南芝潤，侯 磊，劉 霞，焦雄飛，焦改麗，吳慎杰

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 玉米研究所，山西 忻州 034000；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 棉花研究所，山西 運(yùn)城 044000)

轉(zhuǎn)AtHDG11基因玉米的獲得及抗旱性鑒定

南芝潤1，侯 磊1，劉 霞1，焦雄飛1，焦改麗2，吳慎杰2

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 玉米研究所，山西 忻州 034000；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 棉花研究所，山西 運(yùn)城 044000)

培育抗除草劑和抗旱的轉(zhuǎn)基因玉米種質(zhì)，通過超聲波輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)花粉非組培法將擬南芥抗旱基因AtHDG11導(dǎo)入玉米自交系昌7-2中，獲得轉(zhuǎn)基因植株。通過逐代除草劑篩選、分子檢測對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測，獲得5株轉(zhuǎn)基因株系。在此基礎(chǔ)上，以非轉(zhuǎn)基因自交系昌7-2為對照，對5個轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行抗旱性鑒測；對苗期和十葉期玉米植株進(jìn)行干旱脅迫處理，測定轉(zhuǎn)基因植株生理活性物質(zhì)和光合參數(shù)。結(jié)果表明，在干旱脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因玉米葉片的Pro含量高于非轉(zhuǎn)基因玉米，MDA含量低于非轉(zhuǎn)基因玉米；不論在正常生長條件下還是干旱條件下，轉(zhuǎn)基因株系的光合速率和水分利用率都明顯高于對照植株；而轉(zhuǎn)基因株系的蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度則明顯低于對照植株。綜合室內(nèi)與田間的抗旱檢測結(jié)果表明，超聲波輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)花粉的非組培轉(zhuǎn)基因方法在玉米上是可行的。將擬南芥HDG11基因?qū)胗衩?，同樣可以有效地提高玉米的抗旱性，為玉米的抗旱育種提供新的種質(zhì)資源和新的轉(zhuǎn)基因方法。

玉米；抗旱性；AtHDG11；遺傳轉(zhuǎn)化

玉米是世界上三大作物之一，是主要的糧食、飼料作物和重要的工業(yè)原料。提高玉米產(chǎn)量一直以來都是育種家們努力的目標(biāo)，然而，在植物的生長過程中，經(jīng)常會面臨干旱、 澇害、 鹽堿、 高溫、 低溫、 冷害、 營養(yǎng)匱乏、 重金屬污染等非生物脅迫，嚴(yán)重影響了植物的正常生長和發(fā)育。在這些逆境脅迫中，干旱是最為突出的限制因素之一[1]。據(jù)統(tǒng)計，每年干旱導(dǎo)致作物減產(chǎn)達(dá)50%以上[2]，而玉米是對水分脅迫比較敏感的作物之一，干旱是影響玉米產(chǎn)量提高的重要因素之一。

AtHDG11是擬南芥HD-START 轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一。 擬南芥中共有16個HD-START 轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥的正常生長發(fā)育過程中充當(dāng)中心調(diào)節(jié)因子[3]。過量表達(dá)HDG11基因的轉(zhuǎn)基因植株增強(qiáng)了的多個特征與耐旱性相關(guān)，包括增強(qiáng)根系生長和降低氣孔密度。目前，該基因已在擬南芥、煙草[4]、水稻[5]、馬鈴薯[6]、高羊茅[7]、黑麥草[8]、棉花和楊樹[9]中得到證實(shí)。過量表達(dá)該基因能增強(qiáng)植物的干旱脅迫能力，在改善植物抗旱和耐鹽性上有很好的效果。迄今為止，尚未見轉(zhuǎn)HDG11玉米的相關(guān)研究報道。

本研究通過超聲波輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)花粉非組培法，將外源基因AtHDG11導(dǎo)入玉米自交系中，獲得了轉(zhuǎn)基因玉米植株，證明超聲波輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)花粉非組培法在玉米轉(zhuǎn)基因研究上的可行性；比較了干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米中的游離脯氨酸含量、MDA含量以及光合參數(shù)，初步證實(shí)來源于擬南芥的HDG11基因在玉米中同樣具備抗旱耐逆的生理功能，這對培育玉米抗旱新品種具有一定的科研參考價值。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以玉米(Zeamays)自交系昌7-2為受體試材；農(nóng)桿菌菌株為LB4404。植物表達(dá)載體pCB2004-AtHDG11由中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)向成斌教授提供。T-DNA區(qū)結(jié)構(gòu)如圖1 所示。

圖1 質(zhì)粒 pCB2004-AtHDG11的 T-DNA 區(qū)Fig.1 T-DNA region of plasmid pCB2004-AtHDG11

1.2 轉(zhuǎn)化方法

1.2.1 農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備 攜帶pCB2004-AtHDG11質(zhì)粒載體的農(nóng)桿菌菌株 28 ℃懸浮培養(yǎng) 16～24 h 后，離心并用液體培養(yǎng)基(含10%～15%蔗糖)重懸稀釋至 OD600為 0.8～1.0備用。

1.2.2 花粉準(zhǔn)備 供試玉米自交系昌7-2于7月上、中旬開花抽絲前，將其雌穗套袋隔離。待盛花期收集10：00-12：00開花的玉米花粉，于4 ℃冰箱中冷凍處理2 h。將處理過的花粉溶于經(jīng)過通氣和低溫處理的濃度為10%～20%的蔗糖溶液中，超聲波處理(聲強(qiáng)100～200 W，工作時間為5 s，間隔6 s，工作次數(shù)6次)，處理后將花粉懸浮液稍靜置后倒掉上清液。

1.2.3 轉(zhuǎn)化處理 以農(nóng)桿菌懸浮液為基因供體，以處理后的花粉為受體，以一定比例將花粉和農(nóng)桿菌混合，同時加入100 μmol/L乙酰丁香酮，靜置處理5～15 min后，倒掉上清液，用細(xì)毛筆刷將沉淀的處理花粉授到植物柱頭上，并套袋掛牌標(biāo)記。2 d后再重復(fù)處理1次，利用農(nóng)桿菌將目的基因整合于植物基因組中。待轉(zhuǎn)化的植物籽粒成熟后收獲，在隨后的生長季播種于大田，利用篩選標(biāo)記基因篩選，即可獲得轉(zhuǎn)基因植株。

1.3 轉(zhuǎn)基因玉米的鑒定

1.3.1 T0種子除草劑初步篩選 將收獲的T0玉米種子表面消毒后種植在含0.05%草胺膦的固體1/2 MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，14 d后統(tǒng)計玉米的生長情況。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株正常生長，葉片為綠色，非轉(zhuǎn)基因植株發(fā)芽后莖尖開始褐化并停止生長，將篩選出來的陽性植株移栽到花盆中，為進(jìn)一步試驗做準(zhǔn)備。

1.3.2 PCR檢測 采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因玉米植株和對照植株的基因組DNA[10]。以基因組DNA為模板，用AtHDG11基因的上游引物5′-CGGTGGTG GTAGTCATCAT-3′和下游引物5′-CGCCTTTAGTAGC AACACG-3′進(jìn)行基因組PCR分析，預(yù)計擴(kuò)增片段大約為 1 014 bp。引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

AtHDG11基因PCR擴(kuò)增程序為：94 ℃ 預(yù)變性 5 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 延伸 10 min。擴(kuò)增PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，拍照。確定AtHDG11基因是否插入轉(zhuǎn)基因玉米的基因組中。

1.3.3AtHDG11在轉(zhuǎn)基因玉米中的表達(dá)分析 初步確定為陽性的T1植株，取其葉片，提取葉片總 RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA 為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。

用天根公司提供的RNAprep pure Plant Kit試劑盒提取T1轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米葉片組織總RNA，取5 μg的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(SuperRT cDNA Kit)反轉(zhuǎn)錄合成20 μL的cDNA。以cDNA為模板，用AtHDG11的上游特異引物5′-CGGTGGTGG TAGTCATCATCA-3′和下游引物5′-ACTGTGGAGG TCCTCCTGTTA-3′進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段預(yù)計為340 bp。考察轉(zhuǎn)基因玉米葉片中AtHDG11的轉(zhuǎn)錄水平。用GADPH為內(nèi)參，擴(kuò)增GADPH的cDNA所用的上游引物5′-AGCAGGTCGAGCATCTTCG-3′和下游引物5′-CTGTAGCCCACTCGTTGTC-3′，RT-PCR反應(yīng)采用第一鏈cDNA作為模板，擴(kuò)增內(nèi)參基因用30個循環(huán)，擴(kuò)增AtHDG11的cDNA也用30個循環(huán)。

1.4 轉(zhuǎn)基因玉米的苗期抗旱性鑒定

播種于花盆的T2玉米植株在正常澆水條件下長至16 d，選取大小長勢一致的5個株系進(jìn)行干旱控水處理，干旱處理10 d后恢復(fù)正常澆水，分別在干旱處理的第 0，4，6，10天取相同部位的葉片進(jìn)行丙二酮(MDA)、游離脯氨酸(Pro)含量的測定。Pro含量的測定采用酸性茚三酮法[11]；MDA含量的測定采用TBA法[12]。

1.5 轉(zhuǎn)基因玉米的田間抗旱性鑒定

將T2轉(zhuǎn)基因玉米種子和受體自交系種子種植于大田，在植株長到10片葉時測定植株的凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、水分利用率(WUE)。測定方法參照澤泉CI-340超輕型便攜式光合作用測定儀說明書進(jìn)行。選取5個株系進(jìn)行測定，每個株系測5株，設(shè)3個重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因玉米的獲得

在玉米盛花期，利用超聲波輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)花粉非組培法將外源基因AtHDG11導(dǎo)入受體材料自交系昌7-2中，共處理玉米雌穗500穗，獲得T0種子292粒。

2.2 轉(zhuǎn)基因玉米植株的分子鑒定

2.2.1 PCR檢測AtHDG11的玉米經(jīng)草胺膦篩選后得抗性苗28株，經(jīng)馴化、移栽后成活14株(圖2)。待T1抗性苗生長5～6片葉時，全部取樣并提取總DNA進(jìn)行PCR檢測(圖3)。對AtHDG11基因PCR檢測結(jié)果顯示，抗性株5株呈陽性，即部分除草劑草胺膦抗性的植株是非轉(zhuǎn)基因的。這5株陽性株初步被確認(rèn)為轉(zhuǎn)基因陽性株。

2.2.2 RT-PCR 檢測 為了確定AtHDG11在轉(zhuǎn)基因植株中的轉(zhuǎn)錄情況，提取葉片RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，利用RT-PCR對初步確定為陽性的植株進(jìn)行進(jìn)一步檢測。選用GADPH的表達(dá)強(qiáng)度為內(nèi)標(biāo)。從圖4可以看出，AtHDG11基因不僅被整合到玉米基因組中，而且還能正常轉(zhuǎn)錄，表達(dá)水平因株系不同而差異較大。

圖2 轉(zhuǎn)基因玉米在含0.05%草銨膦培養(yǎng)基上的抗性表現(xiàn)Fig.2 Herbicide resistance of transgenic plants suffered from 0.05% glufosinate-ammonium

M.DL2000 DNA Marker；1～5.轉(zhuǎn)基因植株；-.空白對照；CK.昌7-2；+.陽性對照(質(zhì)粒 DNA)。圖4同。M.DL2000 DNA Marker；1-5.Transgenic plants；-.Blank control；CK.Chang 7-2；+.Positive control(plasmid DNA).The same as Tab.4.

圖4 T1轉(zhuǎn)基因玉米植株的 RT-PCR 檢測結(jié)果Fig.4 RT-PCR analysis of T1 transgenic plants

2.3 轉(zhuǎn)基因與對照玉米植株在干旱脅迫下MDA和Pro含量的變化

脯氨酸是植物受到逆境脅迫后產(chǎn)生的最常見和最有效的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，植物通過滲透調(diào)節(jié)作用保持細(xì)胞內(nèi)的水分，避免或減輕逆境對其傷害，脯氨酸含量與植物抵抗逆境的能力成正比[13]。植物中脯氨酸含量是抗逆研究的常用指標(biāo)[14]。由圖5-A可知，在干旱脅迫的每個時間段，5個轉(zhuǎn)基因株系與對照植株的Pro含量均呈上升趨勢，但是轉(zhuǎn)基因植株無論是Pro的絕對含量還是相對增加程度都明顯高于對照植株，表明轉(zhuǎn)基因玉米受到的傷害較小，具有更強(qiáng)的抗旱性。由圖5-B可知，對照植株與轉(zhuǎn)基因植株相比，MDA(以鮮質(zhì)量計)積累量較高，說明對照植株受傷害的程度更大。表明在干旱脅迫下，轉(zhuǎn)AtHDG11基因玉米能更好地免受氧化損傷，具有更強(qiáng)的抗旱性。

圖5 轉(zhuǎn)基因和對照玉米植株干旱脅迫處理過程中Pro和MDA含量變化Fig.5 Chang of Pro content and MDA content in transgenic maize plants and control plants during the drought stress tolerance

2.4 干旱脅迫對玉米轉(zhuǎn)基因植株光合參數(shù)的影響

光合作用是植物體內(nèi)至關(guān)重要的代謝過程，其強(qiáng)弱對植物的抗逆性有重要影響，因而，光合參數(shù)可以作為衡量植物抗逆性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)[15]。由圖 6可知，不論在正常生長條件下還是在干旱條件下，轉(zhuǎn)基因株系的光合速率和水分利用效率都明顯高于對照植株；而轉(zhuǎn)基因株系的蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度則明顯低于對照植株。在整個干旱脅迫過程中，轉(zhuǎn)AtHD11株系能夠維持較高的光合速率和水分利用效率，保持較低的蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度，表明轉(zhuǎn)AtHD11植株在干旱脅迫中受損傷程度較輕。

圖6 干旱脅迫對玉米葉片光合參數(shù)的影響Fig.6 Effects of drought stress on photosynthetic parameters of maize leaves

3 討論與結(jié)論

超聲波介導(dǎo)花粉轉(zhuǎn)化法是一個簡單易行的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法[16]，但該方法的主要缺點(diǎn)之一是不能很好地轉(zhuǎn)化大片段的DNA，DNA片段越大轉(zhuǎn)化的效率越低，且遺傳穩(wěn)定性越差，可能是由于DNA片段沒有自主性，不能實(shí)現(xiàn)外源基因自主向植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移并且整合，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率低且遺傳穩(wěn)定性較差。農(nóng)桿菌作為一種天然的植物基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，具有能夠轉(zhuǎn)移大的DNA片段、 整合位點(diǎn)較穩(wěn)定、外源基因重排少等優(yōu)點(diǎn)，外源基因多以單或寡拷貝整合，并能穩(wěn)定遺傳，其在玉米遺傳轉(zhuǎn)化中已有很多報道[17-19]。 超聲波輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)花粉的非組培轉(zhuǎn)基因方法是在超聲波介導(dǎo)花粉轉(zhuǎn)化法的基礎(chǔ)上，將沒有自主性的DNA攜帶載體替換成有自主結(jié)合能力的農(nóng)桿菌，這樣既可以提高轉(zhuǎn)化大片段DNA植株的結(jié)實(shí)率、穩(wěn)定性，又避免了冗長繁瑣的植物組培過程。該方法經(jīng)過筆者3年的試驗研究，揭示了其可行性。2013年通過超聲波輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)花粉的非組培轉(zhuǎn)基因方法，將AtHDG11基因?qū)胗衩鬃越幌挡?-2中，共處理500株，分5個批次；2014年處理500株，分5個批次；2015年處理300株，分3個批次。2013年得到292粒種子；2014年收獲籽粒數(shù)295粒；2015年收獲230粒種子。經(jīng)PCR分析鑒定，2013年有5株表現(xiàn)為陽性；2014年有14株表現(xiàn)為陽性；2015年有28株表現(xiàn)為陽性。隨著技術(shù)參數(shù)的不斷改進(jìn)，陽性率越來越高，從2013年的1.7%增至2015年的12%。

干旱脅迫明顯地影響了農(nóng)作物的生長和生產(chǎn)力。因此，改進(jìn)作物品種的抗旱性至關(guān)重要和緊迫，轉(zhuǎn)基因的方法已被證明可以加速作物改良[20-22]。關(guān)于AtHDG11抗旱性研究表明，轉(zhuǎn)AtHDG11基因能夠增強(qiáng)植物對干旱的耐受性。轉(zhuǎn)基因植株改善的多個特征與耐旱性相關(guān)，如降低轉(zhuǎn)基因植株的氣孔密度、發(fā)達(dá)的植株根系、較高水平的SOD和CAT活性等。本試驗將AtHDG11轉(zhuǎn)入玉米，獲得了具有抗旱性狀的玉米新品種。選取Pro含量、MDA含量[23-24]和光合參數(shù)這幾個與抗旱密切相關(guān)的生理生化指標(biāo)，以評價轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性，試驗結(jié)果表明，在干旱脅迫下，轉(zhuǎn)AtHDG11 玉米通過提高WUE，維持較強(qiáng)的光合能力，較高的脯氨酸含量和較低水平的丙二酮含量等提高了玉米的抗旱性。同時也證明超聲波輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)花粉非組培法的可行性。

關(guān)于轉(zhuǎn)AtHDG11 基因在玉米干旱脅迫中的表達(dá)調(diào)控功能有待進(jìn)一步研究，以明確其在玉米干旱逆境脅迫下的調(diào)控機(jī)制，為研究玉米的耐旱分子機(jī)制及基因工程提供科學(xué)依據(jù)，為培育耐旱玉米新品種奠定良好的基礎(chǔ)。

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Expression of AtHDG 11 in Transgenic Maize and Drought Resistance Identification

NAN Zhirun1，HOU Lei1，LIU Xia1，JIAO Xiongfei1，JIAO Gaili2，WU Shenjie2

(1.Institute of Maize，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Xinzhou 034000，China； 2.Cotton Research Institute，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Yuncheng 044000，China)

The objective of this experiment is to study the production of transgenic maize with the resistance of drought stress.In this study，an expression vector containing drought resistance geneAtHDG11 was used to transform to maize elite inbred line Chang 7-2 by ultrasonic assistedAgrobacteriummediated pollen transformation method，and produced transgenic maize plants.Based on herbicid resistance，PCR analysis and transcriptional analysis，five transgenic maize lines were selected from a large number of transgenic lines.Subsequently，the inbred line Chang 7-2 was used as the nontransgenic control to analyze the drought resistance of transgenic plants.Physiological active substances and photosynthetic parameters were measured on plants at the seedling stage and 10-leaf stage in a drought stress treatment.The results showed that Pro content of transgenic maize was higher than that of the CK plants under drought stress conditions，while MDA content was lower.Both normal conditions and drought condition，photosynthetic rate and water use efficiency of transgenic lines were significantly higher than that of CK plants.And transpiration rate and stomatal conductance of transgenic lines were significantly lower than the control plants.Therefore，ultrasonic assistedAgrobacteriummediated pollen transformation method is feasible in the maize.AtHDG11 is a strong biotechnological candidate for use in efforts to produce a drought-resistance maize.This study will provide new germplasm resources and new transgenic method.

Maize；Drought resistance；AtHDG11；Transformation

2016-07-06

山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院育種基礎(chǔ)項目(yyzjc1413)

南芝潤(1979-)，女，山西運(yùn)城人，助理研究員，碩士，主要從事玉米轉(zhuǎn)基因育種研究。

吳慎杰(1971-)，男，山西運(yùn)城人，副研究員，博士，主要從事棉花轉(zhuǎn)基因育種研究。

S332.4

A

1000-7091(2016)06-0063-05

10.7668/hbnxb.2016.06.010