邢 蔓，譚太龍，李 健，鄔賢夢(mèng)，官春云，熊興華

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.國(guó)家油料改良中心湖南分中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

甘藍(lán)型油菜PEPC基因ihpRNA表達(dá)載體的構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化研究

邢 蔓1，2，譚太龍2，李 健2，鄔賢夢(mèng)2，官春云2，熊興華1，2

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.國(guó)家油料改良中心湖南分中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

為提高油菜含油量，構(gòu)建了基于油菜磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)的ihpRNA植物表達(dá)載體。分別從甘藍(lán)型油菜基因組中克隆了種子儲(chǔ)藏蛋白napin基因啟動(dòng)子(315 bp)、PEPC基因的外顯子片段(246 bp)及PEPC基因的內(nèi)含子(754 bp)，包含了其剪切位點(diǎn)之前4 bp和之后18 bp片段。通過(guò)中間載體pBluescript Ⅱ SK(+)再構(gòu)建到pBI121中，構(gòu)成種子特異表達(dá)的內(nèi)含子剪接的PEPC基因的RNA 干擾載體pBI121.NP+IP-。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)湘油15號(hào)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化植株9株，PCR檢測(cè)證實(shí)外源片段成功導(dǎo)入其中7株油菜基因組中。對(duì)T2種子中含油量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)比對(duì)照提高10%左右。

甘藍(lán)型油菜；PEPC基因；ihpRNA載體；轉(zhuǎn)基因油菜；含油量

油菜是我國(guó)重要的油料作物，年產(chǎn)油400萬(wàn)t，占植物油生產(chǎn)量的1/3，每年還需進(jìn)口植物油1 000萬(wàn)t。然而，我國(guó)多數(shù)品種含油量為40%左右，比進(jìn)口菜籽的含油量低3%～5%[1]，提高油菜含油量一直是油菜育種研究的主要目標(biāo)之一，也是當(dāng)前國(guó)際上油料作物基因工程研究的一個(gè)熱點(diǎn)[2]。

本試驗(yàn)依據(jù)ihpRNA介導(dǎo)的RNAi技術(shù)原理，分別克隆了napin啟動(dòng)子、PEPC基因片段及其內(nèi)含子，構(gòu)建了對(duì)應(yīng)于油菜PEPC基因的ihpRNA植物表達(dá)載體，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化以抑制油菜PEPC基因在種子中的表達(dá)。轉(zhuǎn)基因油菜含油量提高了10%，為高油油菜分子育種提供研究材料。

1 材料和方法

1.1 植物材料

甘藍(lán)型油菜(BrassicanapusL.)湘油15號(hào)，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家油料作物改良中心湖南分中心提供。

1.2 質(zhì)粒、菌種、酶和試劑

pBI121、大腸桿菌菌種DH5α、農(nóng)桿菌LBA4404、pBluescript Ⅱ SK(+)由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)作物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。TaqDNA聚合酶、pGEM-T Easy、各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、dNTP均購(gòu)自TaKaRa公司。質(zhì)粒提取試劑盒和DNA快速純化/回收試劑盒均購(gòu)自北京鼎國(guó)生物公司，其余生化試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。引物由麗欣生物公司合成，萬(wàn)百生物公司完成測(cè)序。其余生化試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 PCR引物

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的油菜相應(yīng)基因序列分別設(shè)計(jì)PCR引物，并在其5′端引入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)(下劃線為引物酶切位點(diǎn)序列；斜體代表PEPC內(nèi)含子剪切位點(diǎn)之前和之后的序列)。napin上游引物(FWn) AAGCTTTAGACTCTCATCCCCTTTTA，napin下游引物(RVn) GAATTCTGAGTAAAGAGTG AAGCGG；PEPC+上游引物(FWp+)GAATTCGTGGC TGGTCACAAGGA，PEPC+下游引物(RVp+)GGATCC AGTGTCTTCAAGTCCAGGT；PEPC-上游引物(FWp-) GAGCTCGTGGCTGGTCACAAGGA，PEPC-下游引物(RVp-) TCTAGAAGTGTCTTCAAGTCCA GGT；內(nèi)含子上游引物(FWi)GGATCCATTTGTTACC GTTTCCCTTT，內(nèi)含子下游引物(RVi)TCTAGACTCGTAGCATTCTTGAACCTT。

1.4 油菜napin啟動(dòng)子、PEPC內(nèi)含子及正、反基因片段序列克隆與測(cè)序油菜DNA PCR擴(kuò)增：50 μL體系擴(kuò)增基因，反應(yīng)體系包括：基因組DNA 1 μL、2.5 mmol/L dNTP 5 μL、10×PCR Buffer 5 μL、Taq酶2 μL、含5 pmol/μL引物各2 μL，加水至50 μL。PCR程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)。 PCR產(chǎn)物與pGEM-T Easy連接參照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備、轉(zhuǎn)化、重組質(zhì)粒DNA的提取與酶切均按常規(guī)方法進(jìn)行。經(jīng)Hind Ⅲ和EcoRⅠ酶切鑒定napin啟動(dòng)子；用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ以及SacⅠ和XbaⅠ進(jìn)行酶切鑒定246 bp正向與反向基因片段；用BamH Ⅰ+XbaⅠ酶切鑒定PEPC內(nèi)含子片段。鑒定的陽(yáng)性克隆送萬(wàn)百生物公司測(cè)序。將各基因測(cè)序結(jié)果分別在GenBank 中進(jìn)行序列的同源性比較。

1.5 種子特異性表達(dá)的ihpRNA植物載體pBI121.NP+IP-的構(gòu)建將雙酶切片段分別回收。首先將回收的napin啟動(dòng)子插入pBluescript Ⅱ SK(+)的Hind Ⅲ和EcoRⅠ位點(diǎn)構(gòu)建pSK.N；再將用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切回收的PEPC正向基因片段(PEPC+)插入pSK.N的相同酶切位點(diǎn)上構(gòu)建pSK.NP+；然后回收pSK.NP+經(jīng)Hind Ⅲ+BamH Ⅰ酶切產(chǎn)生561 bp 的napin基因啟動(dòng)子和PEPC+片段插入pBI121的同樣酶切位點(diǎn)構(gòu)建pBI121.NP+；將BamH Ⅰ+XbaⅠ酶切產(chǎn)生754 bp 的PEPC內(nèi)含子片段插入pBI121.NP+的同樣酶切位點(diǎn)構(gòu)建pBI121.NP+Ⅰ；最后經(jīng)SacⅠ和XbaⅠ酶切產(chǎn)生246 bp 的PEPC基因反向片段(PEPC-)插入pBI121.NP+I的同樣酶切位點(diǎn)上構(gòu)建pBI121.NP+IP-(圖1)。

圖1 PEPC基因ihpRNA載體示意圖Fig.1 The schematic diagram of ihpRNA vector targeting PEPC gene

1.6 甘藍(lán)型油菜的遺傳轉(zhuǎn)化

將植物表達(dá)載體pBI121.NP+IP-通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404，菌落PCR鑒定。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，以湘油15號(hào)的子葉柄為外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。

1.7 轉(zhuǎn)基因油菜T0的PCR檢測(cè)

取非轉(zhuǎn)基因再生油菜苗和轉(zhuǎn)基因抗卡那霉素油菜苗分別提取總DNA，利用napin啟動(dòng)子上游引物和內(nèi)含子的下游引物，PCR擴(kuò)增檢測(cè)ihpRNA-PEPC。

1.8 轉(zhuǎn)基因油菜后代的含油量檢測(cè)

從轉(zhuǎn)基因后代中選擇含油量高的材料進(jìn)行自交，T2種子進(jìn)行含油量檢測(cè)。采取標(biāo)準(zhǔn)索氏抽提法的提取步驟參照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB2906-82。測(cè)定重復(fù)3次，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1napin基因啟動(dòng)子、PEPC基因正反義序列及內(nèi)含子的克隆提取湘油15葉片總DNA，分別利用引物FWn/RVn、FWp+/RVp+、FWp-/RVp-、FWi/RVi PCR克隆napin基因啟動(dòng)子、PEPC基因正、反義鏈片段和內(nèi)含子序列。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析表明：PCR產(chǎn)物大小均與設(shè)計(jì)的序列大小相符(圖2-4)。將擴(kuò)增產(chǎn)物回收后分別與T-Easy相連，獲得重組質(zhì)粒。分別經(jīng)Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ、EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ、SacⅠ/XbaⅠ 和BamH Ⅰ/XbaⅠ雙酶切鑒定后進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明：napin啟動(dòng)子為315 bp(圖2)，與GenBank中油菜1.7 Snapin、napB的啟動(dòng)子序列同源性達(dá)到100%，與2Snapin啟動(dòng)子同源性達(dá)到了99%。PEPC基因正、反義鏈片段大小為246 bp(圖3)，與GenBank中PEPC3序列(D13987)的同源性達(dá)到95%以上。PEPC內(nèi)含子以及其剪接位點(diǎn)上游4 bp 和下游18 bp的序列長(zhǎng)度為754 bp(圖4)，與GenBank中的PEPC序列完全一致。

M.100 bp DNA Marker；1～2.napin啟動(dòng)子片段。M.100 bp DNA Marker；1-2.napin promoter fragments.

M.100 bp DNA Marker；1～2.PEPC+正向片段；3～4.PEPC-反向片段。 M.100 bp DNA Marker；1-2.PEPC+ sense fragments；3-4.PEPC- anti-sense fragments.

M.100 bp DNA Marker；1.PEPC內(nèi)含子片段。M.100 bp DNA Marker；1.PEPC intron fragments.

2.2 種子特異性表達(dá)的PEPCihpRNA的植物載體構(gòu)建

分別將雙酶切的4個(gè)片段回收。 首先將napin啟動(dòng)子插入pBluescript Ⅱ SK(+)的Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ位點(diǎn)構(gòu)建pSK.N；再將回收的PEPC+正向基因片段插入pSK.N的相同酶切位點(diǎn)上構(gòu)建pSK.NP+(圖5)；然后將napin基因啟動(dòng)子和PEPC+正向片段插入pBI121的同樣酶切位點(diǎn)構(gòu)建pBI121.NP+(圖6)；再依次插入內(nèi)含子片段和反向片段而構(gòu)建pBI121.NP+I(圖7)和pBI121.NP+IP-(圖8)。每個(gè)中間載體分別進(jìn)行酶切鑒定和PCR鑒定。對(duì)pBI121.NP+IP-分別進(jìn)行napin、NP+(napin與PEPC+)、intron、IP-(intron與PEPC-)的 PCR鑒定(圖8)。

M.DNA Marker Ⅲ；1～2. Hind Ⅲ和EcoRⅠ酶切pSK.NP+。M.DNA Marker Ⅲ；1-2. Hind Ⅲ and EcoRⅠdigested pSK.NP+.

M.DNA Marker Ⅲ；1. Hind Ⅲ和BamH Ⅰ酶切pBI121.NP+。M.DNA Marker Ⅲ；1. Hind Ⅲ and BamH Ⅰ digested pBI121.NP+.

M.DNA Marker Ⅲ；1. BamH Ⅰ和Xba Ⅰ雙酶切pBI121.NP+Ⅰ。M.DNA Marker Ⅲ；1. BamH Ⅰ and Xba Ⅰ digested pBI121.NP+Ⅰ.

M.DNA Marker Ⅲ；1.napin啟動(dòng)子；2.napin和PEPC+片段； 3.PEPC 內(nèi)含子；4.intron 和PEPC-片段。M.DNA Marker Ⅲ；1.napin；2.NP+；3.PEPC intron；4.IP-.

2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)pBI121.NP+IP-載體轉(zhuǎn)化湘油15

在培養(yǎng)基上取發(fā)芽5 d左右的湘油15幼苗帶生長(zhǎng)點(diǎn)的子葉節(jié)，預(yù)培養(yǎng)1 d。經(jīng)取OD值為0.5左右的農(nóng)桿菌LBA4404(含pBI121.NP+IP-表達(dá)載體)浸染7 min后，共培養(yǎng)在共培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)3 d，再轉(zhuǎn)入放入Kan篩選培養(yǎng)基進(jìn)行Kan 梯度篩選分化培養(yǎng)(先10 mg/L，后提高到15 mg/L，30 d繼代1次，繼代2次)。待篩選后的綠芽長(zhǎng)到2～3 cm時(shí)，切下綠芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根。當(dāng)根系發(fā)達(dá)成為完整的植株后，經(jīng)煉苗便可移栽至營(yíng)養(yǎng)缽中(圖9)。

2.4 轉(zhuǎn)基因油菜T0的PCR檢測(cè)

以napin啟動(dòng)子的FW引物與內(nèi)含子的RW組成引物對(duì)，對(duì)9株再生轉(zhuǎn)ihpRNA-PEPC抗性植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，擴(kuò)增得到產(chǎn)物為1 300 bp左右。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：9株再生植株中能擴(kuò)增出目的條帶的植株有7株(圖10)，PCR陽(yáng)性率為77%。

2.5 轉(zhuǎn)基因油菜后代的含油量檢測(cè)

利用索氏提取法測(cè)定對(duì)照植株與轉(zhuǎn)基因T2植株種子含油量，結(jié)果如圖11 所示：5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系種子含油量都明顯高于對(duì)照植株，說(shuō)明通過(guò)RNAi技術(shù)干擾種子內(nèi)源PEPC，并能提高轉(zhuǎn)基因植株種子中油分積累。

A.子葉節(jié)預(yù)培養(yǎng)；B.子葉節(jié)篩選培養(yǎng)； C.在生根培養(yǎng)基中的完整植株；D.在花盆中生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因植株。A.Cotyledon node preculture；B.Cotyledon node on selection medium； C.Whole plant on rooting medium；D.Transgenic plants in pots.

M.DNA Marker Ⅲ；1.負(fù)對(duì)照；2.正對(duì)照；3～6，8～10.轉(zhuǎn)基因植株；7，11.非轉(zhuǎn)基因植株。M.DNA Marker Ⅲ；1.Negative control；2.Positive control；3-6，8-10.Transgenic plants；7，11.Non-transgenic plant.

3 討論

熊興華等[14]曾從甘藍(lán)型油菜中克隆了1 147 bp的napin啟動(dòng)子，譚小力等[15]對(duì)此啟動(dòng)子在擬南芥中表達(dá)進(jìn)行了功能驗(yàn)證，此napin啟動(dòng)子控制基因只在和種子有關(guān)的部位和種子衍生的部位表達(dá)。St?lberg等[16]在轉(zhuǎn)基因煙草中對(duì)甘藍(lán)型油菜種子儲(chǔ)藏蛋白napA基因的啟動(dòng)子進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)napin啟動(dòng)子具有正、負(fù)調(diào)控元件。刪除-1 101～-309 bp可增強(qiáng)GUS的表達(dá)，刪除-309～-211 bp 降低其表達(dá)，從-152～+44 bp是種子特異表達(dá)所必需的最小序列，而5′端刪除到-126 bp則無(wú)啟動(dòng)子功能。

CK.非轉(zhuǎn)基因油菜(湘油15號(hào))；T2-1～T2-5.轉(zhuǎn)基因植株。CK.Non-transgenic plant(Xiangyou 15)；T2-1-T2-5.Transgenic plants.

本試驗(yàn)依據(jù)napA基因的啟動(dòng)子序列克隆了315 bp的napin啟動(dòng)子序列(-310～+5 bp)，測(cè)序結(jié)果完全一致，可以在油菜種子中實(shí)現(xiàn)超強(qiáng)表達(dá)。

陳錦清等[4]轉(zhuǎn)35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的反義PEPC基因在油菜中表達(dá)使其含油量達(dá)50%以上。張艷等[17]將高粱PEPC基因轉(zhuǎn)入大豆，T1植株的凈光合速率提高了20.7%，氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率均有不同程度的提高。陳全戰(zhàn)等[18]將玉米PEPC基因?qū)敫仕{(lán)型油菜，PEPC活性提高17倍，凈光合速率提高15.5%。Wang等[19]將玉米的PEPC基因?qū)胄←?，提高了轉(zhuǎn)化小麥的耐旱性和千粒質(zhì)量。王永霞等[20]將玉米PEPC基因?qū)胄←満?，促進(jìn)了小麥原有的C4循環(huán)，提高了小麥的光合效率和籽粒產(chǎn)量。

目前，構(gòu)建ihpRNA表達(dá)載體用于特定基因表達(dá)調(diào)控的研究應(yīng)用廣泛，而如何構(gòu)建高效載體則是其中關(guān)鍵的一步。首先，本試驗(yàn)選擇PEPC基因的編碼區(qū)作為靶標(biāo)序列構(gòu)建載體。筆者根據(jù)GenBank中序列，設(shè)計(jì)引物，直接從甘藍(lán)型油菜湘油15基因組DNA中克隆PEPC基因片段，正向和反向片段在轉(zhuǎn)錄后形成的mRNA嚴(yán)格互補(bǔ)且與內(nèi)源靶序列一致。其次，本試驗(yàn)所構(gòu)建的RNAi植物表達(dá)載體是1個(gè)ihpRNA(Intron splicing hpRNA，ihpRNA)結(jié)構(gòu)，研究表明，含內(nèi)含子剪接的反轉(zhuǎn)重復(fù)結(jié)構(gòu)的沉默效果優(yōu)于hpRNA。構(gòu)建的pBI121.NP+IP-是先插入正向片段，再插入反向片段；此外，在克隆內(nèi)含子片段時(shí)選擇了從其剪接位點(diǎn)前4 bp和剪接位點(diǎn)后面的18 bp克隆，有利于形成更穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)其沉默效果。

為滿足人們對(duì)食用油消費(fèi)不斷增加和生產(chǎn)生物柴油的需要，增加油料作物種子油的產(chǎn)量成為油料作物研究的主要目標(biāo)，前人的研究證實(shí)通過(guò)操縱油合成途徑的基因只可適當(dāng)提高含油量。目前，我們正在進(jìn)行利用轉(zhuǎn)錄因子基因和油合成關(guān)鍵基因來(lái)調(diào)控油菜含油量的研究。

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Construction of Seed-specific ihpRNA Expression Vector Targeting PEPC Gene and Transformation of Rapeseed

XING Man1，2，TAN Tailong2，LI Jian2，WU Xianmeng2，GUAN Chunyun2，XIONG Xinghua1，2

(1.Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province，Hunan Agricultural University，Changsha 410128， China；2.Hunan Branch of National Oilseed Crops Improvement Center，Changsha 410128，China)

To study the relationship between rapeseed oil content and phosphoenolpyruvate carboxylase activity，we constructed the seed-specific ihpRNA expression vector targetingPEPCgene inBrassicanapusL..A fragment of 315 bpnapinpromoter and 246 bp exon fragment ofPEPCgene were amplified from the genomic DNA of Xiangyou 15.At the same time，a intron(754 bp) ofPEPCgene including 4 bp and 18 bp DNA fragment before and after the splice site respectively was cloned into corresponding enzyme sites.According to the structural principle of expression vector，these fragments were cloned into pBluescript Ⅱ SK(+)，respectively.Then we inserted the ihpRNA structure into plant expression vector pBI121，designated pBI121.NP+IP-.Transformed Xiangyou 15 byAgrobacteriumtumefacienscontaining pBI121.NP+IP-，seven transgenic plants from nine anti-kanamycin plants were confirmed by PCR detection.The oil content of transgenic plants was about 10% higher than that of the controls.

BrassicanapusL.；PEPCgene；ihpRNA expression vector；Transgenic rapeseed；Oil content

2016-07-15

國(guó)家“973”計(jì)劃項(xiàng)目(2015CB150200)；湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014FJ1006-3)

邢 蔓(1992-)，男，新疆伊犁人，在讀碩士，主要從事油菜分子生物學(xué)研究。

熊興華(1967-)，男，湖南安鄉(xiāng)人，副研究員，博士，主要從事油菜分子生物學(xué)及基因工程研究。

Q78；S635.03

A

1000-7091(2016)06-0007-05

10.7668/hbnxb.2016.06.002