周 碩，劉永偉，董福雙，楊 帆，趙 和，柴建芳，呂孟雨，孫果忠，王海波

(河北省農(nóng)林科學院 遺傳生理研究所，河北省植物轉(zhuǎn)基因中心，河北 石家莊 050051)

小麥類鈣調(diào)素TaCML79基因的克隆和表達分析

周 碩，劉永偉，董福雙，楊 帆，趙 和，柴建芳，呂孟雨，孫果忠，王海波

(河北省農(nóng)林科學院 遺傳生理研究所，河北省植物轉(zhuǎn)基因中心，河北 石家莊 050051)

為了研究小麥類鈣調(diào)素基因的功能和在植物逆境響應中的分子機制，以電子克隆結(jié)合RT-PCR的方法，在小麥中克隆到一個類鈣調(diào)素基因TaCML79。該基因的開放閱讀框長度為588 bp，編碼的蛋白長度為195個氨基酸，推測的分子量為20.45 kDa，等電點為4.6，屬于酸性蛋白，具有2個典型的和一個不完整的EF-hand結(jié)構(gòu)域。多序列比對和系統(tǒng)進化樹分析表明，TaCML79與野生稻的ObCML35和水稻的OsCML10親緣關(guān)系較近，相似性分別為84.6%和86.8%。該基因的表達在根和地上部分受到熱激、NaCl、滲透和冷脅迫的誘導或抑制，初步推斷該基因可能與植物抗逆有密切的關(guān)系。

小麥；類鈣調(diào)素；EF-hand結(jié)構(gòu)域；基因克??；基因表達

鈣信號通路在植物的生長發(fā)育和耐受逆境脅迫中起著至關(guān)重要的作用。大多數(shù)的外界刺激都會引起植物細胞內(nèi)鈣離子(Calcium，Ca2+)水平發(fā)生改變，其變化的頻率、幅度和胞內(nèi)的位置等的不同，會形成復雜的Ca2+信號，由下游的鈣離子結(jié)合蛋白感知并傳導，激活下游的信號轉(zhuǎn)導通路[1-5]。鈣調(diào)素(Calmodulin，CaM)和類鈣調(diào)素(Calmodulin-like protein，CML)是植物中重要的Ca2+感受蛋白，其本身沒有酶的活性，可通過與Ca2+結(jié)合，改變自身構(gòu)象，從而激活下游的靶蛋白發(fā)揮功能[6-7]。典型的CaM非常保守，一般由149個氨基酸組成，具有4個EF-hand結(jié)構(gòu)域，參與了植物的熱激(TaCaM1-2和AtCaM3)[8-10]、鹽脅迫(GmCaM4)[11]、氧化脅迫(CaCaM1)[12]、生物脅迫(GmCaM4)[11]、光形態(tài)建成(AtCaM7)[13]等信號通路。CML是與CaM相似性較高的鈣離子結(jié)合蛋白大家族，擬南芥中有50個成員，水稻中有32個成員，蛋白長度一般為83～315個氨基酸不等，具有2～6個EF-hand結(jié)構(gòu)域[6-7，14]。CML參與了植物的鹽脅迫(AtCML9和OsMSR2)[15-17]、ABA信號(AtCML37和AtCML24)[18-20]、抗壞血酸合成(AtCML10)[21]、過氧化物酶體代謝(AtCML3)[22]、生物脅迫(AtCML42)[23]等抗逆相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導過程。然而，對CaM/CML的研究多集中在擬南芥和水稻中，作為世界上最重要的作物小麥，CaM/CML基因的克隆和功能研究則相對滯后。目前，僅克隆了10個小麥CaM基因[24]，尚未見關(guān)于CML基因的報道，小麥CML基因的表達特性和生物學功能基本上還處于未知的狀態(tài)。由于CaM/CML基因在結(jié)構(gòu)和功能上具有高度的保守性，推測小麥的CaM/CML基因可能參與植物的抗逆信號通路。本研究在對小麥CaM/CML基因電子克隆的基礎(chǔ)上，從小麥cDNA中分離克隆了一個新的CML基因TaCML79，對其進行了生物信息學分析，并研究了其基本特性及逆境脅迫下的表達特征，為深入研究和利用該基因奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料及逆境脅迫處理

試驗于2015-2016年在河北省農(nóng)林科學院遺傳生理研究所植物轉(zhuǎn)基因中心進行。以河北省農(nóng)林科學院遺傳生理研究所育成的國審小麥品種金禾9123為研究材料。取籽粒飽滿、大小均勻一致的小麥種子，經(jīng)表面消毒后置于含有雙層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中。待種子萌發(fā)后，選取發(fā)芽狀態(tài)較一致的種子播于蛭石盒中，在光照培養(yǎng)箱(光周期：16 h/8 h；溫度：24～26 ℃)中培養(yǎng)14 d后進行熱激、NaCl、滲透和冷脅迫處理。具體處理方法為：熱激處理組將幼苗置于42 ℃光照培養(yǎng)箱，于0，10，20，30，60，120，180 min分別取樣；NaCl脅迫組用200 mmol/L NaCl處理，滲透脅迫組用16.1%的PEG6000處理，冷處理組將幼苗置于4 ℃光照培養(yǎng)箱，后3種處理分別于0，1，3，6，12，24 h取樣。4種脅迫處理時間點取樣，皆為根和地上部分2組樣本，且均為10株幼苗的混合樣，取樣后置于液氮速凍，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 植物總RNA的提取及cDNA第1鏈的合成

利用RNAiso Plus(TaKaRa)提取植物總RNA。cDNA第1鏈的合成使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)。

1.3 小麥TaCML79基因的克隆和序列分析

以小麥TaCaM1-1蛋白序列為探針，在NCBI的小麥EST數(shù)據(jù)庫中進行tBlastN比對(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，下載一致性較高的ESTs序列，然后利用DNAStar軟件對ESTs序列進行拼接，得到多個可能的小麥CaM/CML基因。根據(jù)其中一個小麥CML基因TaCML79的拼接序列，設(shè)計基因的開放閱讀框(Open reading frame，ORF)擴增引物，上游引物TaCML79-F：5′-GCATTCATCTC CTTTGAGCAG-3′，下游引物TaCML79-R：5′-GGAGG AGGAGCCTGGCGTAG-3′，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR反應使用TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，體系為50 μL：FastPfu Fly DNA Polymerase 1 μL，5×PCR Buffer 10 μL，PCR Stimulant 10 μL，10 μmol/L的上下游引物各2 μL，小麥cDNA 2 μL，去離子水23 μL。PCR反應條件為：98 ℃ 2 min；98 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，32個循環(huán)；72 ℃ 5 min?；厥盏腜CR產(chǎn)物目的片段連接至Blunt vector(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，PCR、酶切篩選陽性克隆，并對陽性克隆進行測序驗證。序列的ORF分析、蛋白質(zhì)翻譯、分子量和等電點預測使用DNAStar軟件包；利用ProSite(http：//prosite.expasy.org/)在線分析蛋白的保守結(jié)構(gòu)；利用DNAman 8.0軟件對蛋白序列進行比對；利用MEGA 6.0軟件Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(Bootstrap：1 000；Mode/Method：Poisson model；Gaps/Missing Data Treatment：Pairwise deletion)。

1.4 實時熒光定量PCR

參照TaKaRa SYBR Green qPCR 試劑盒的實時熒光定量PCR 引物原則，設(shè)計目標基因qRT-PCR引物。上游引物TaCML79-QF：5′-GGACTTCGCGCG CATGATGA-3′，下游引物TaCML79-QR：5′-GGAGG AGGAGCCTGGCGTAG-3′。以小麥18SrRNA為內(nèi)參，上游引物18S-QF：5′-GATCCATTGGAGGGCAA GTC-3′，下游引物18S-QR：5′-GATGCTTGCTTTGAG CACTC-3′。實時熒光定量PCR反應體系為20 μL：qPCR Master Mix (2×) 10 μL、 ROX Dye 0.4 μL、cDNA模板2.5 μL、10 μmol/L的上下游引物各0.5 μL和去離子水6.1 μL。每個樣品設(shè)置3個重復。反應在ABI 7500 Real-time System上進行。反應條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 34 s，40個循環(huán)；在72 ℃ 反應步驟時收集熒光信號。根據(jù)擴增曲線確定每個基因和樣本相應的Ct值，以18S為內(nèi)參基因，將“0”時間點樣本的表達量設(shè)為“1”，相對表達量采用2-ΔΔCt方法計算。

2 結(jié)果與分析

2.1TaCML79基因克隆及序列分析

根據(jù)拼接的TaCML79基因的序列，設(shè)計了上下游引物，從小麥幼苗的cDNA中擴增獲得一條長度為683 bp的序列(圖1)。測序結(jié)果表明，其核苷酸序列與電子克隆序列一致。TaCML79基因的ORF長度為588 bp，編碼的蛋白長度為195個氨基酸，推測的蛋白分子量為20.45 kDa，等電點為4.6。TaCML79蛋白具有2個典型的EF-hand結(jié)構(gòu)域，位于第108～143，148～183個氨基酸，2個典型的鈣離子結(jié)合區(qū)位于第121～133，161～173個氨基酸；還具有一個不完整的EF-hand結(jié)構(gòu)域，位于第73～88個氨基酸，一個不完整的鈣離子結(jié)合區(qū)位于第72～77個氨基酸。將TaCML79基因序列提交到NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為KX094887。

D2000.D2000 DNA分子量標準；TaCML79.TaCML79基因的擴增結(jié)果。D2000.D2000 DNA Marker；TaCML79.Gene amplification of TaCML79.

2.2 TaCML79蛋白的同源序列比對和系統(tǒng)進化樹分析

將TaCML79預測的氨基酸序列與來自野生稻(Oryzabrachyantha)(ObCML35：XP_006645392.1)、水稻(Oryzasativa)(OsCML10：XP_015647311.1)、短柄草(Brachypodiumdistachyon)(BdCML35：XP_003565061.3)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)(AtCML7：NP_172089.1)、小麥(Triticumaestivum)(TaCaM1-1：AAC49578)的蛋白序列進行同源比對(圖2)，結(jié)果顯示，TaCML79與野生稻的ObCML35和水稻的OsCML10序列相近，相似性分別為84.6%和86.8%；而與短柄草BdCML35、擬南芥AtCML7和小麥TaCaM1-1的蛋白序列存在較大差異，相似性分別為30.1%，27.9% 和25.0%。表明TaCML79是一個新的小麥CML基因。

將TaCML79與上述蛋白序列，以及來自玉米(Zeamays)(ZmCML1：ACG37375)、水稻(Oryzasativa)(OsCML36：XP_015619632.1)、黃瓜(Cucumissativus)(CsCML35：XP_004136671.2)、煙草(Nicotianatomentosiformis)(NtCML3：XP_009607745.1)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)(AtCaM1：NP_198594.1)的蛋白序列進行系統(tǒng)進化樹分析(圖3)，結(jié)果顯示，TaCML79與ObCML35、OsCML10、ZmCML1、OsCML36和CsCML35歸為一組，屬于CML家族，且TaCML79與ObCML35和OsCML10的親緣關(guān)系較近。系統(tǒng)進化分析還表明，BdCML35、NtCML3和AtCML7歸為一組，同屬CML家族，但是與CaM家族的親緣關(guān)系較近；AtCaM1與TaCaM1-1歸為一組，屬于CaM家族。

圖2 TaCML79推測的氨基酸序列與其他CaM/CML蛋白序列的比對Fig.2 Alignments of deduced amino acid sequence of TaCML79 and other CaM/CML proteins

圖3 小麥TaCML79蛋白與其他CaM/CML蛋白的系統(tǒng)進化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree of TaCML79 and other CaM/CML proteins

圖4 TaCML79基因在各種處理下的相對表達量Fig.4 Relative expression of TaCML79 under various treatments

2.3TaCML79基因的表達特性

為了解TaCML79基因在各種脅迫下的表達特性，設(shè)計特異引物進行了熒光定量PCR的檢測。結(jié)果顯示，熱激處理時，TaCML79基因在根中的表達在60 min前沒有明顯的變化，2 h時明顯上升；在地上部分的表達受到熱激的抑制，60 min時達到最低值，之后沒有明顯變化(圖4-A)。

NaCl處理時，TaCML79基因在根中的表達量有明顯的波動，1 h時表達量上升，隨后下降到初始水平，12 h時又上升；在地上部分的表達持續(xù)上升，12 h上升到最高值，之后表達量下降(圖4-B)。

滲透處理時，TaCML79基因在根和地上部分的表達均持續(xù)上升，到12 h達到最高值，之后略有下降(圖4-C)。

冷處理時，TaCML79基因在根和地上部分的表達均受到明顯的抑制，但在處理的不同時間點變化不大(圖4-D)。

總之，TaCML79基因的表達受到熱激、鹽、滲透和冷脅迫的誘導或抑制，可能與小麥抵御非生物脅迫有密切的關(guān)系。

3 討論與結(jié)論

為了克隆小麥CML基因，并研究其表達特性，本研究通過電子克隆結(jié)合RT-PCR的方法，得到一個小麥CML基因TaCML79。生物信息學分析顯示，該基因的ORF長588 bp，編碼的蛋白長度為195個氨基酸；蛋白序列的同源比對和系統(tǒng)進化樹分析顯示，TaCML79與來自野生稻的ObCML35和水稻的OsCML10序列相近，表明TaCML79是一個新的小麥CML基因。并且TaCML79不僅具有2個完整的EF-hand結(jié)構(gòu)域，還具有一個不完整的EF-hand結(jié)構(gòu)域，其是否具有結(jié)合Ca2+的特性還需更深入的研究。

CML基因廣泛參與到植物的多種信號通路中，并且已證明多個CML基因與植物耐受逆境脅迫有關(guān)。AtCML9的表達量受到NaCl、冷、干旱和ABA處理的誘導，其功能缺失突變體對NaCl和干旱脅迫更加敏感[15]；水稻中的一個CML基因，OsMSR2，其表達量不僅受到熱激、鹽、干旱和冷脅迫的誘導，過表達該基因還可以提高擬南芥和水稻對鹽脅迫的抗性[16-17]；而AtCML24卻負調(diào)節(jié)了植物對ABA和鹽離子脅迫的抗性[20]。本研究中的TaCML79基因，熱激可以誘導該基因在根中的表達，抑制其在地上組織中的表達，表明TaCML79基因在熱激時可能在根和地上部分發(fā)揮不同的功能；在NaCl和滲透脅迫中，TaCML79在根和地上組織中的表達均上升，24 h后略有下降，表明TaCML79可能在植物耐受鹽和滲透脅迫中發(fā)揮重要的功能，植物通過提高TaCML79的表達來應對NaCl和滲透脅迫，并且隨著脅迫時間的延長，植物逐漸適應逆境，TaCML79的表達隨之回落；TaCML79的表達受到冷脅迫的抑制，說明TaCML79在植物抗冷反應中參與了與上述3種逆境脅迫不同的信號轉(zhuǎn)導通路。

CML基因只在植物和某些原生生物中發(fā)現(xiàn)，所以一般認為CML基因是植物為了適應各種逆境脅迫由CaM基因進化而來[25-26]。植物在生長過程中，需要感受熱激、鹽、干旱、冷等各種不同的刺激，使胞內(nèi)產(chǎn)生復雜的鈣信號，這就需要由多種不同的鈣結(jié)合蛋白感知、解碼并傳導至下游不同的信號通路。本研究中的TaCML79基因，其表達量在根和地上部分受到多種脅迫處理的誘導或抑制，不僅暗示了該基因在植物耐受逆境脅迫中發(fā)揮著重要的作用，也說明植物鈣信號轉(zhuǎn)導通路在不同的逆境脅迫和不同組織中的復雜性。不過，本研究僅探索了TaCML79基因的生物信息學特性和表達模式，認識其生物學功能還需要更多分子遺傳學的證據(jù)。

本研究克隆到一個新的小麥CML基因TaCML79，該基因的ORF長588 bp，編碼的蛋白長度為195個氨基酸，具有2個典型的和一個不完整的EF-hand結(jié)構(gòu)域，與來自野生稻的ObCML35和水稻的OsCML10序列相近。TaCML79的表達受到熱激、NaCl、滲透和冷脅迫的誘導和抑制，說明該基因可能與植物對非生物脅迫的抗性相關(guān)。本研究為探討小麥CML在植物抗逆中的功能提供了新的候選基因，為小麥抗逆分子生物學及轉(zhuǎn)基因研究提供了新的線索。

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Cloning and Expression Analysis of TaCML 79 in Wheat

ZHOU Shuo，LIU Yongwei，DONG Fushuang，YANG Fan，ZHAO He，CHAI Jianfang，Lü Mengyu，SUN Guozhong，WANG Haibo

(Institute of Genetics and Physiology，Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Plant Genetic Engineering Center of Hebei Province，Shijiazhuang 050051，China)

In order to study the function and molecular mechanism of wheat calmodulin-like protein gene(CML) in plant stress response，oneCMLgeneTaCML79 was cloned in wheat based on electron cloning and RT-PCR.Sequence analysis showed that the open reading frame (ORF) ofTaCML79 was 588 bp，encoding 195 amino acids of protein containing two typical and one incomplete EF-hand domains，with predicted molecular weight of 20.45 kDa and isoelectric point of 4.6.Multiple sequence alignment and phylogenetic tree analysis showed that TaCML79 was closely related to the ObCML35 and OsCML10，with 84.6% and 86.8% identity respectively.The expression ofTaCML79 was induced or inhibited by heat shock，NaCl，osmotic and cold stress in root and shoot tissue，suggesting thatTaCML79 might be closely related to plant resistance to abiotic stress.

Triticumaestivum；Calmodulin-like proteins；EF-hand domain；Gene cloning；Gene expression

2016-08-26

河北省農(nóng)林科學院博士基金項目(F15E0008)；北京全式金生物技術(shù)有限公司Trans助研夢想基金(Trans-RasDF-003)；國家自然科學基金項目(31600216)；河北省農(nóng)林科學院科學技術(shù)研究與發(fā)展計劃項目(A2015110102)

周 碩(1985-)，男，河北邢臺人，助理研究員，博士，主要從事作物分子生物學研究。周碩、劉永偉為同等貢獻作者。

王海波(1958-)，男，河北保定人，研究員，博士，主要從事作物遺傳、生理、育種及轉(zhuǎn)基因研究。

Q78；S512.1

A

1000-7091(2016)06-0001-06

10.7668/hbnxb.2016.06.001