趙艷茹，余克強，李曉麗，何 勇※

（1. 浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，杭州 310058；2. 西北農林科技大學機械與電子工程學院，楊凌 712100）

應用激光拉曼光譜判別油菜葉片核盤菌早期侵染

趙艷茹1，余克強2，李曉麗1，何 勇1※

（1. 浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，杭州 310058；2. 西北農林科技大學機械與電子工程學院，楊凌 712100）

病原物核盤菌侵染油菜植株所引發(fā)的油菜菌核病嚴重制約著油菜產業(yè)的發(fā)展，及早診斷核盤菌的侵染有助于油菜菌核病的早期防治。病原物一般由侵入點向植物寄主四周擴散形成病斑，而與病原物侵染點不同距離的組織區(qū)域可代表病害的不同嚴重程度。該研究采用激光共聚焦顯微拉曼光譜儀在800～2 000 cm-1范圍內獲取健康和染病油菜葉片的拉曼光譜曲線，接著采用小波變換（wavelet transform，WT）進行拉曼光譜的預處理以去除熒光背景的干擾，然后選擇主成分因子（principal components，PC-1和PC-2）以及特征參量（1 006，1 156和1 522 cm-1）進行樣本間的聚類分析，最后分別基于主成分因子和拉曼特征參量建立最小二乘支持向量機（least squares support vector machine，LS-SVM）進行菌核病侵染油菜葉片不同階段的判別分析。結果發(fā)現(xiàn)采用基于PC-1主成分，1 156和1 522 cm-1處的拉曼強度建立的LS-SVM判別模型可以得到100%的識別率。研究結果表明，通過判別分析油菜葉片菌核病病斑不同區(qū)域處的拉曼光譜可以實現(xiàn)核盤菌侵染油菜葉片的早期判別，這為后續(xù)探究植物病害的早期監(jiān)測以及研發(fā)油菜葉片菌核病早期診斷拉曼便攜儀提供理論參考。

拉曼光譜學；病原物；主成分分析；油菜葉片；菌核病；特征參量；化學計量學方法

0 引 言

油菜菌核病是由核盤菌（sclerotinia sclerotiorum(Lib.) de Bary）引起的植物組織壞死性病害，是一種真菌性病害，菌核病的爆發(fā)嚴重制約著油菜產業(yè)的發(fā)展。菌核病不僅可以發(fā)生于油菜各個生長期，而且可危害油菜植株的不同器官（例如花、葉、莖和果實等）[1-2]。核盤菌首先會通過侵染釘透過葉片表皮角質層侵入油菜葉片，當菌絲通過表皮進入寄主細胞時，會分泌大量的水解酶及毒素進行植物組織（細胞壁、葉綠體等）的瓦解，而葉表皮在菌絲進入植物組織時會發(fā)生解離[3]。葉片組織的潰爛會通過病斑來反映。油菜葉片菌核病發(fā)病時，病斑初為水漬狀，暗青色，后擴大成圓形或不規(guī)則形，中間部分成為黃褐色。隨著時間的推移，病斑迅速擴大，并長出大量菌絲，葉片也隨之腐爛。早期診斷核盤菌侵染對防治油菜菌核病具有重要意義。

酶聯(lián)免疫吸附技術（enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA）和聚合酶聯(lián)鎖反應（polymerase chain reaction，PCR）技術常用于植物病原物侵染的檢測[4]。然而這些方法一般操作復雜，需要專業(yè)人員，另外不適用于大規(guī)模田間植物病害的檢測。近年來，紅外光譜由于無損、快速檢測的特點已經(jīng)被廣泛用于植物病害的檢測中。植物的生理信息在組織受到病原物侵染時會發(fā)生相應的改變，例如葉綠素含量降低，酶活性發(fā)生變化等[5-12]。而植物一系列的生理變化會影響光譜特性的改變，這也是光譜能夠用于植物病害檢測的理論基礎。然而近紅外光譜主要反映的是含氫基團的振動的倍頻和合頻吸收，并且水的紅外吸收很強，這些因素限制了近紅外光譜在植物組織檢測方面的應用。

拉曼光譜是一種散射光譜，能夠體現(xiàn)分子的結構信息，并且水的拉曼散射很弱，這些特點都促進了拉曼光譜在生物樣本中的檢測應用。被測物質分子的結構和含量等信息均可通過拉曼譜峰的位置、強度和形狀來反映[13]。由于拉曼光譜的優(yōu)越性，其已經(jīng)開始應用于植物病害檢測中。Cialla等[14]直接采用增強拉曼光譜對煙草花葉病毒病原物進行檢測。Yeturn等[15]采用激光波長為1 064 nm的便攜拉曼光譜儀采集感染菜豆金色花葉病毒的青麻作物的拉曼光譜，并采用單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）對于類胡蘿卜素拉曼譜峰位置（1 526 cm-1）的拉曼光譜強度進行顯著性分析，結果表明健康、輕微染病與嚴重染病樣本的拉曼光譜強度在P＜0.000 1水平上存在顯著性差異。Baranski等[16]采用傅里葉變換拉曼光譜成像技術對蔬菜組織中的類胡蘿卜素進行原位無損成像發(fā)現(xiàn)，病菌侵染會導致植物葉片中類胡蘿卜素含量的下降。譚峰等[17]利用拉曼光譜儀在200～3 400 cm-1范圍內進行水稻葉片感染稻葉瘟的判別分析，提出雙峰（984和994 cm-1；828和851 cm-1）聯(lián)線的斜率和拉曼光譜散射截面與病害嚴重程度的良好對應關系。李曉麗等[18]采用共聚焦顯微拉曼光譜技術實現(xiàn)了感染炭疽病的茶葉葉片細胞壁結構和化學成分的變化，發(fā)現(xiàn)病菌侵染導致細胞壁中纖維素有序機構被破壞，并且纖維素含量降低。植物真菌病害是農業(yè)生產的主要病害，而真菌菌絲的生長與幾丁質的生成關系密切，有學者采用激光共聚焦拉曼成像技術實現(xiàn)幾丁質在菌絲中二維和三維的化學成像圖[19]。除此外，拉曼光譜還可用于水果以及樹木等植物病害的檢測[20-21]。

檢測植物病害不僅可以通過直接檢測病原物的存在，還可以通過檢測由病原物導致的微小病斑來間接進行病原物侵染植物的判別。本研究采用激光共聚焦拉曼光譜特征參量及化學計量學方法進行核盤菌侵染油菜葉片不同嚴重程度的早期判別分析。

1 材料與方法

1.1 試驗樣本

本次試驗所采用的油菜品種為高油605，核盤菌菌株由浙江大學生物技術研究所提供。具體的病菌接種方法參見文獻[5]。選取接種病菌24 h的油菜葉片作為本次試驗樣本，此時葉片處于核盤菌侵染初期。如圖1a為正常樣本放大3倍時所拍圖片，此時葉片正面尚無明顯病斑，葉片背面開始出現(xiàn)輕微的水漬狀。但是通過顯微鏡可以清晰地觀察到病斑，如圖1b所示。本次試驗采用的是菌絲塊接種法，菌絲首先會從與葉片接觸部分進行侵染，然后再向四周擴散，可以根據(jù)病斑的大小范圍來初步判定核盤菌的侵染階段。圖1c為病斑放大圖，可以發(fā)現(xiàn)病斑邊緣分界比較明顯。圖1d為圖1c中1區(qū)域的10倍顯微放大圖，可以發(fā)現(xiàn)葉片表面已經(jīng)開始模糊，蠟質層已經(jīng)大部分被溶解，將其判斷為病原物侵染葉片的嚴重階段。圖1e為圖1c中2區(qū)域的10倍顯微放大圖，這時，可以發(fā)現(xiàn)油菜葉片表面的蠟質層開始出現(xiàn)溶解，但是葉表皮結構尚較完整，相比圖1d，將其判斷為病原物侵染葉片的輕微階段。圖1f為健康葉片顯微放大圖，健康葉片表面的蠟質層完整，表皮細胞充盈。

由于是在20倍顯微鏡圖下獲取油菜葉片的表皮的拉曼曲線，因此獲取樣品相近部位的光譜曲線可以盡量減少樣品間光譜的誤差，選取如圖1中叉號位置處的拉曼光譜曲線。

1.2 儀器及參數(shù)

試驗儀器：雷尼紹共聚焦拉曼光譜儀（國家海洋局第二海洋研究所）

激發(fā)波長：514.5 nm

激光功率：0.5 mW

曝光時間：10 s

光譜掃描范圍：800～2 000 cm-1

圖1 不同感染區(qū)域下油菜葉片表面顯微圖Fig.1 Micrograph of rape leaf within different infected areas

將接種12 h的葉片剪成大約0.5 cm×0.5 cm的方塊粘于載玻片上，并置于載物臺上。依次將60個病斑樣品置于10倍顯微鏡下，準確找到病斑邊緣，如圖1c所示，由于病斑中心已經(jīng)被菌絲覆蓋，得不到有效的拉曼光譜曲線。找到病斑后，再在20倍顯微鏡下，選取病斑中心外圍不同的圈作為光譜提取的感興區(qū)，共獲得60條拉曼光譜曲線。由于葉片病害組織已經(jīng)遭到破壞，所含水分較少，因此需要采用較小的激光功率以避免樣本燒焦。另外將30個健康樣本置于同樣條件下獲得30條拉曼光譜曲線，最終得到90條拉曼光譜曲線用于進行核盤菌侵染油菜葉片不同侵染階段的判別分析。本試驗采用10%大小的激光光圈以避免鮮葉表面因激光燒蝕產生形變從而影響拉曼光譜的獲取。采集拉曼光譜用的軟件為Renishaw’s Wire 3.3 software。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

主成分分析（principal components analysis，PCA）是對樣本原始光譜數(shù)據(jù)中所包含的自變量進行線性組[22]。其主要利用方差最大原則，采用新的低維變量代替原始的高維變量，從而達到數(shù)據(jù)降維的目的。經(jīng)PCA變換得到的各主成分之間相互獨立，可以有效消除原始數(shù)據(jù)中的冗余信息。一般采用前幾個對偏差量較大的主成分變量代替全部變量進行樣本種間聚類判別[23]。

由雜散光和光源引起的噪聲會影響拉曼光譜的峰值，譜線寬度等，而可見激光照射有機樣品也會造成拉曼信號中熒光背景的干擾，從而造成拉曼光譜信號的漂移以及熒光包[24]。因此，尋求合適的拉曼光譜預處理方法有助于準確地獲取試驗數(shù)據(jù)。Baseline算法可以有效去除拉曼光譜的漂移[25]。另外，小波變換（wavelet transform，WT）基于時頻域可以對拉曼光譜進行多尺度分解，將被認為成熒光背景的低頻率信號置零，然后進行信號的重構，以達到去除熒光背景的目的。

最小二乘支持向量機（least squares support vectormachine，LS-SVM）能夠進行線性和非線性的多元建模，能夠在少量的訓練樣本中進行高維特征空間學習，具有較強的泛化能力[26]。在進行LS-SVM運算時，選擇合適的核函數(shù)參數(shù)非常重要[27]。本文采用RBF核函數(shù)作為非線性核函數(shù)，能夠減少訓練樣本中的計算的復雜度。

本研究中所使用的小波變換和LS-SVM判別模型在MatlabR2009a中完成，Baseline和PCA算法在Unscrambler X10.1（CAMO,Process,AS,Norway）中完成。

2 結果與分析

2.1 拉曼光譜曲線

圖2為油菜葉片表面的原始拉曼光譜曲線圖，可以發(fā)現(xiàn)樣本的光譜曲線有明顯的3個特征峰，分別為1 006，1 156和1 522 cm-1。1006 cm-1歸屬于-CH3的面內搖擺振動，1156和1522 cm-1分別歸屬于C-O-C和C=C雙鍵振動[11]。文獻[28]表明1 006，1156和1522 cm-1是類胡蘿卜素的特征峰。可能由于核盤菌的侵染導致了油菜葉片中色素的分解，從而影響染病油菜葉片的這3個特征峰處拉曼強度的差異。同時可以發(fā)現(xiàn)，圖2中染病樣本的拉曼光譜曲線發(fā)生嚴重基線漂移現(xiàn)象。

圖2 油菜葉片上表皮健康與染病區(qū)域的原始拉曼光譜Fig.2 Original Raman spectra of healthy and infected areas on upper epidermis of rape leaves

為了更清晰地探討核盤菌對油菜葉片的早期侵染機理，將健康樣本以及2類染病樣本共3類拉曼光譜曲線進行平均取值，得到圖3a中的3條平均拉曼光譜曲線?？梢灾庇^地發(fā)現(xiàn)健康樣本幾乎沒有發(fā)生漂移，而染病樣本的漂移現(xiàn)象隨著染病嚴重程度的增加而加劇。采用baseline算法進行光譜基線校正，得到圖3b。仔細觀察發(fā)現(xiàn)，感染病害較嚴重的樣本特征峰明顯減少，特別是A和B處的拉曼峰幾乎消失，不過發(fā)現(xiàn)，由于熒光背景信號的影響，經(jīng)基線校正后的拉曼光譜曲線依然存在漂移現(xiàn)象。接著采用小波變換進行拉曼光譜曲線的預處理。采用bior2.4雙正交小波進行7層小波分解后，將最高層的低頻系數(shù)置零，重構信號后得到圖3c。圖3c中拉曼光譜曲線中一些細節(jié)處的特征峰明顯表現(xiàn)出來，而且一些細節(jié)處的特征峰也明顯表現(xiàn)出來，尤其是1 185 cm-1處的特征峰，其歸屬于C-N伸縮振動[29]。從圖3c可以看出，輕微染病區(qū)域的光譜強度與健康樣本的拉曼強度值差不多，不過染病嚴重度高的樣本拉曼曲線強度明顯較弱。

圖3 拉曼光譜預處理Fig.3 Preprocessing of Raman spectra

單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）是檢驗基于一種因素影響，判斷兩個以上總體的均值相等與否的一種統(tǒng)計方法[30]。本研究采用單因素方差分析對 3 類樣本的拉曼光譜曲線強度值進行顯著性分析，統(tǒng)計結果如表1所示。可以得出，3個明顯特征峰處的拉曼光譜強度值在P＜0.05水平處均存在顯著性差異。因此可以考慮采用這 3 個特征峰進行油菜葉片核盤菌侵染的早期判別。然而，根據(jù)表1發(fā)現(xiàn)，這3類樣本的拉曼光譜強度值之間沒有明顯的規(guī)律，猜測是由于選取部位病菌侵染較輕，單純依靠拉曼強度值并不能判斷油菜感染菌核病的情況。因此，考慮采用化學計量學方法進行油菜菌核病早期侵染的判別。

表1 在1 006,1 156和1 522 cm-1處拉曼強度的單因素方差分析結果Table 1 ANOVA statistics results of Raman intensity at 1 006,1 156 and 1 522 cm-1

2.2 樣本聚類分析

采用PCA在全譜范圍內對樣本進行聚類分析，前兩個主成分1（PC-1）和主成分2（PC-2）累計可表達93%的原始信息。其聚類結果如圖4所示。

圖4 3類樣品前2個主成分的聚類圖Fig. 4 Cluster plot of first two PCs(PC-1 and PC-2)

圖4種可以發(fā)現(xiàn)3類樣本有很好的聚類效果，健康樣本與病害嚴重感染的樣本樣本集中度較高，并且二者無論在PC-1軸或PC-2軸方向的投影均無重合。而輕微染病樣本雖然也能與其他兩類樣本很好地分開，但是比較分散，而且其在PC-1軸上的投影與健康樣本的投影有重合，PC-2軸方向的投影則與嚴重感染病害的樣本有重合。輕微感染病菌的階段防治病害的有利時期，這個階段的病癥肉眼還無法識別，然而采用拉曼光譜卻可以將這個階段與健康以及嚴重染病區(qū)劃分開。如圖 4 所示，采用PC-1和PC-2可以得到染病樣本間很好的聚類，其中PC-1可表達全部信息的89%，PC-2可表達4%的全部信息，然而整體運算卻是基于 7 89個波數(shù)，計算過程較為復雜，而且也不利于便攜拉曼檢測儀的設計。在圖3c中可以很清晰地看到 3條特征波段，因此考慮采用這 3個拉曼特征參量進行核盤菌侵染油菜葉片不同階段的判別。采用這3個波數(shù)得到的三維聚類圖如圖5所示。圖5中同樣也可以得到 3 類樣本間很好的聚類效果，可以看到染病較嚴重的樣本集中于三維塊的底部，比較容易判別。但是如表1 所示輕微感染病害樣本的拉曼強度值介于健康樣本和嚴重染病之間，圖5中健康樣本與輕微染病樣本的分類沒有那么明確。圖4和圖5表明了單純依靠無監(jiān)督聚類并不能判斷作物的染病狀況，因此需要進一步采用有監(jiān)督的模式識別方法進行病原物侵染植物的判別。

圖5 3類樣本基于3個特征拉曼譜峰（1 006，1 156和1 522 cm-1）的聚類圖Fig.5 Cluster plot with characteristic peaks at 1 006,1 156 and 1 522 cm-1for 3 types of samples

2.3 LS-SVM判別分析

圖4和圖5中的聚類圖可以很好地表達3類樣本間的聚類，說明這 3 類樣本具有可分性，然而通過聚類圖卻無法直接判斷油菜葉片的染病情況。因此，采用LS-SVM進行油菜葉片核盤菌不同侵染階段的判別。采用樣本的前兩個主成分（PC-1和PC-2）以及3個拉曼特征參量（1 006，1 156和1 522 cm-1）和自定義的類值（1，2和3）分別作為LS-SVM模型的輸入值進行油菜葉片核盤菌不同侵染階段的判別。本試驗共90個試驗樣本，隨機選取其中的60個樣本（每個階段各20個樣本）為建模樣本，剩余的30個（每個階段各10個樣本）為預測樣本。采用LS-SVM判別模型得到的結果如表2所示。

表2 基于主成分和特征拉曼譜峰的LS-SVM模型樣本侵染階段識別結果Table 2 LS-SVM predictive results of sample infection stage based on principal components and characteristics peaks

由表2可得，基于PC-1，1 156和1 522 cm-1建立的LS-SVM判別模型的識別率均為100%。而基于1 006 cm-1和PC-2建立的LS-SVM判別模型僅得到66.7%和70.0%的準確率，其中PC-2-LS-SVM模型中將10個輕微染病樣本全部判斷成嚴重染病樣本，而1 006 cm-1-LS-SVM判別模型中有 9 個輕微染病樣本被判定為健康樣本，造成樣本判斷錯誤的原因可能為油菜葉片病菌感染初期，葉片表面還未發(fā)生明顯的變化，而不同的模型對輕微染病樣本的判斷敏感不同。不過采用1 156與1 522 cm-1均可進行植物染病階段的判別，而且還避免了尋找大量的特征參量，為油菜菌核病診斷便攜儀器的開發(fā)提供理論基礎。

Yeturn等[15]的試驗結果也表明1526 cm-1處的拉曼峰值適用于植物病害的早期檢測。但是并不能單純依靠類胡蘿卜素含量的變化就判斷病害的種類。造成植物中類胡蘿卜素含量的變化有許多原因，例如還有環(huán)境因素，非生物脅迫等。

3 結 論

本研究采用激光共聚焦拉曼光譜對接種核盤菌的油菜葉片進行光譜采集，并基于主成分因子與特征參量建立LS-SVM模型，結果表明基于PC-1和1 156 cm-1與1 522 cm-1處的特征參量可以得到100%的識別率；通過判別分析油菜葉片菌核病病斑不同區(qū)域處的拉曼光譜可以實現(xiàn)核盤菌侵染油菜葉片的早期判別。在今后的研究工作中可以考慮不同品種的油菜接種不同病害進行病害的早期發(fā)現(xiàn)，并輔助其他分子手段進行具體病原物的判別分析。

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Application of Raman spectroscopy for early detection of rape sclerotinia on rapeseed leaves

Zhao Yanru1,Yu Keqiang2,Li Xiaoli1,He Yong1※
(1. College of Biosystems Engineering and Food Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China;2. College of Mechanical and Electronic Engineering,Northwest A&F University,Yangling 712100,China)

Raman spectroscopy technique has been widely used in detecting the physiological information of plants. Due to its unique advantages of simple pre-treating,rapid response,high sensitivity and in-situ,nondestructive detecting,it can be performed to acquire biological information. As an important oil crop,oilseed rape(Brassica napus L.) is widely cultivated all around the world. High energy and protein livestock feed are mainly made from its seeds. It is also partly used as potential raw material in synthesizing biodiesel. However,sclerotinia rot of colza,which is generally caused by fungal pathogens sclerotinia sclerotiorum,seriously limited the development of rapeseed industry. Therefore,early detection of the sclerotinia sclerotiorum infection on rape leaves will helpful to discriminate,prevent and cure the sclerotinia rot of colza on rape plants. In general,plant pathogen spread to the tissue around the invasion point,the different distance between the invasion points on the scab represents different severity of the disease on the host plants. In this study,a total of 90 oilseed rape leaves were collected for this experiment. 90 Raman spectral curves of healthy,mid-infected and severe infected oilseed rape leaves were acquired by confocal micro-Raman spectroscopy in the region of 800-2 000 cm-1. Baseline algorithms were employed to process baseline correction. Wavelet transform based on the time-frequency domain can undertake multi-scale decomposition of Raman spectra,therefore,fluorescent background would be removed by reconstructing the signal without low frequency signal. Herein,wavelet transform was used to remove fluorescence background from the original spectral information. Significant differences at 0.05 level among the three kinds of samples at three characteristic peaks(1 006,1 156 and 1 522 cm-1) were analyzed by one-way analysis of variance(ANOVA) method. Then,principal component analysis(PCA),which can compress the representation of a collection of vectors,was adopted to process cluster analysis. 93% information of the original data was represented by the first two principal components(PC-1 and PC-2). Then,variables of principal components(PC-1 and PC-2) and characteristic peaks(1 006,1 156 and 1 522 cm-1) were employed to process cluster analysis. Finally,least squares support vector machine(LS-SVM) model,which is highly adaptive,was established based on the data of principal components and the characteristic parameters to discriminate the infected severity. The results revealed that LS-SVM models based on the PC-1,1 156 and 1 522 cm-1provided a discriminative accuracy of 100%,LS-SVM discriminative models based on PC-2 and 1 006 cm-1with accuracy of 66.7% and 70.0%,respectively. The results proved that Raman spectra analysis on the disease spot is meaningful for the early detection of disease. Meanwhile,this research provided a theoretical reference for portable Raman instrument designing in disease infection’s early detection. What is more,different varieties of oilseed rape plants infected by different diseases would be detected if Raman spectroscopy technique is applied. Raman spectra coupled with molecular analysis provide a promising way in detecting specific pathogen of plants at early infection stage in future study.

Raman spectroscopy;pathogens;principal component analysis;oilseed rape leaves;sclerotinia;characteristic parameter;chemometrics methods

10.11975/j.issn.1002-6819.2017.01.028

TP391.41;Q945.8

A

1002-6819(2017)-01-0206-06

趙艷茹，余克強，李曉麗，何 勇. 應用激光拉曼光譜判別油菜葉片核盤菌早期侵染[J]. 農業(yè)工程學報，2017，33(1)：206－211.

10.11975/j.issn.1002-6819.2017.01.028 http://www.tcsae.org

Zhao Yanru,Yu Keqiang,Li Xiaoli,He Yong. Application of Raman spectroscopy for early detection of rape sclerotinia on rapeseed leaves[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering(Transactions of the CSAE),2017,33(1):206－211.(in Chinese with English abstract)doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.01.028 http://www.tcsae.org

2016-05-27

2016-10-12

高等學校博士學科點專項科研基金（20130101110104）；國家自然科學基金（31471417，31402318）

趙艷茹，女，博士生，研究方向為數(shù)字農業(yè)信息獲取與檢測技術的研究。杭州浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，310058。Email：xiaoru19863804@sina.com.

※通信作者：何 勇，男，教授，博士生導師，研究方向為數(shù)字農業(yè)，3S技術與農業(yè)物聯(lián)網(wǎng)方面研究。杭州浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，310058。Email：yhe@zju.edu.cn