胡建廷，邱 波，英 永，屈卉錦，王鳳乾，張 鑫

(山東省藥學(xué)科學(xué)院、山東省化學(xué)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250101)

自發(fā)性肝硬化比格犬肝臟病理形態(tài)學(xué)研究

胡建廷，邱 波，英 永，屈卉錦，王鳳乾，張 鑫

(山東省藥學(xué)科學(xué)院、山東省化學(xué)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250101)

目的研究自發(fā)性肝硬化比格犬肝臟的病理形態(tài)學(xué)改變和血清生化改變，以建立適用于GLP的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背景資料。方法下肢靜脈采血制備血清，全自動(dòng)生化分析儀測(cè) ALT、AST、TP、ALB、ALP、TBIL、TC、TG、GGT等肝功能指標(biāo)，比較患病動(dòng)物與同期空白對(duì)照組動(dòng)物上述指標(biāo)的差異;對(duì)比格犬肝臟進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，光學(xué)顯微鏡下描述其病理形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。結(jié)果與同期空白對(duì)照組動(dòng)物相比，患病動(dòng)物ALT、AST、ALP、TBIL、GGT顯著升高，ALB顯著降低;與正常組織相比，肝硬化的肝細(xì)胞呈結(jié)節(jié)狀再生、排列紊亂，形成數(shù)量不等的假小葉，假小葉周圍被增生的膠原纖維所包裹。結(jié)論需加強(qiáng)比格犬自發(fā)病變的病理監(jiān)測(cè)，為藥物安全性評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的背景資料。

比格犬;肝硬化;病理形態(tài)學(xué)

在重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)研究中，比格犬是常用的非嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。關(guān)于比格犬的自發(fā)性病變，此前國(guó)內(nèi)外學(xué)者也進(jìn)行了相關(guān)研究了［1-3］，但未見有比格犬自發(fā)性肝硬化的文獻(xiàn)報(bào)道。本文以藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)研究中空白對(duì)照組出現(xiàn)的一例肝硬化比格犬為研究對(duì)象，探討其肝臟生化指標(biāo)的改變和肝臟病理形態(tài)學(xué)改變，以期為藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)提供重要的病理學(xué)背景資料。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)環(huán)境

普通級(jí)比格犬，購自北京瑪斯生物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2011-0003】。動(dòng)物飼養(yǎng)于本中心屏障環(huán)境(普通級(jí))動(dòng)物房【SYXK(魯)2010-0004】。

試驗(yàn)開始時(shí)所有動(dòng)物體重、攝食量及生化指標(biāo)均無明顯差異。解剖前35 d，患病動(dòng)物開始出現(xiàn)消瘦、體重減輕、皮膚粘膜輕度黃染等體征?；疾?dòng)物為雌性，解剖時(shí)體重10 kg，24月齡。

1.2 儀器與試劑

日立7180全自動(dòng)生化分析儀，由日立公司生產(chǎn);櫻花VIP6全自動(dòng)脫水機(jī)、全自動(dòng)染色封片機(jī)等病理設(shè)備均由櫻花醫(yī)療株式會(huì)社生產(chǎn)。

肝功能生化檢測(cè)試劑盒均由寧波瑞源生物科技有限公司生產(chǎn);Masson三色染色試劑盒由 Sigma公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào):SLBK9565V;網(wǎng)狀纖維染色試劑盒由北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào):20160512。

1.3 方法

1.3.1 血清制備及肝生化指標(biāo)檢測(cè):下肢靜脈采血2～3 mL置促凝管中靜置30 min，3500 r/min離心10 min制備血清。全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定 ALT、AST、TP、ALB、ALP、TBIL、TC、TG、GGT等肝功能指標(biāo)，比較患病動(dòng)物與同期空白對(duì)照組動(dòng)物上述指標(biāo)的差異。

1.3.2 動(dòng)物剖檢:剖檢前動(dòng)物隔夜禁食不禁水。戊巴比妥鈉麻醉，頸動(dòng)脈放血處死。打開腹腔，觀察患病動(dòng)物腹腔內(nèi)有無腹水、腹水的顏色和腹水量;肉眼觀察肝臟形態(tài)學(xué)改變。肝臟經(jīng)粗切后放入中性甲醛溶液中固定。

1.3.3 組織病理學(xué)檢查:對(duì)肝組織進(jìn)行常規(guī)取材、脫水、包埋、石蠟切片，根據(jù)說明書步驟進(jìn)行HE染色、網(wǎng)狀纖維染色［4］和 Masson染色［5］，光學(xué)顯微鏡下觀察患病動(dòng)物肝臟病理形態(tài)學(xué)改變。

2 結(jié)果

2.1 生化指標(biāo)的改變

與同期空白對(duì)照組動(dòng)物相比，患病動(dòng)物 ALT、AST、ALP、TBIL、GGT顯著升高，ALB顯著降低，升高或降低幅度為同期空白對(duì)照組2～5倍不等;與同期空白對(duì)照組動(dòng)物相比，患病動(dòng)物TP、TC、TG未見明顯變化(表1)。

2.2 肉眼形態(tài)學(xué)觀察

患病動(dòng)物腹腔內(nèi)可見淡黃色腹水，腹水量約50 mL;患病動(dòng)物肝臟形狀不規(guī)則、質(zhì)地變硬，表面可見大小不一的顆粒狀結(jié)節(jié)和黃色壞死灶突出于肝臟表面(圖1)。

2.3 組織病理學(xué)檢查

HE染色顯示患病動(dòng)物肝臟肝細(xì)胞呈彌漫性變性、壞死伴結(jié)節(jié)狀再生;再生的肝細(xì)胞排列紊亂，形成數(shù)量不等的假小葉，假小葉內(nèi)中央靜脈缺如或偏位;肝內(nèi)膽汁淤積(圖2、圖3)。

Masson染色顯示形成的假小葉被藍(lán)染的增生的膠原纖維分割、包裹;肝臟匯管區(qū)膠原纖維增生(圖4、圖5)。

網(wǎng)狀纖維染色顯示肝細(xì)胞壞死區(qū)域和假小葉周圍未見黑色網(wǎng)狀纖維塌陷或沉積，僅見棕黃色膠原纖維增生(圖6)。

表1 比格犬血清生化值改變Tab.1 Changes of serum biochemistry values in the Beagle dogs

圖1 肝臟表面形狀不規(guī)則、質(zhì)地變硬，表面可見大小不一的顆粒狀結(jié)節(jié)和黃色壞死灶。圖2 肝細(xì)胞變性、壞死、結(jié)節(jié)狀再生。再生肝細(xì)胞排列紊亂，形成假小葉。假小葉中央靜脈缺如或偏位(HE，標(biāo)尺=100μm，100×)。圖3 肝細(xì)胞廣泛壞死、膽汁淤積(HE，標(biāo)尺=100μm，200×)。圖4 肝細(xì)胞結(jié)節(jié)狀再生。再生肝細(xì)胞排列紊亂，形成假小葉，假小葉中央靜脈缺如或偏位。假小葉被藍(lán)染的膠原纖維分割、包裹(Masson，標(biāo)尺=100μm，40×)。圖5 匯管區(qū)膠原纖維增生(Masson，標(biāo)尺=100μm，100×)。圖6 假小葉被棕黃色的膠原纖維分割、包裹;肝細(xì)胞壞死區(qū)和假小葉周圍未見黑色網(wǎng)狀纖維沉積(網(wǎng)狀纖維染色，標(biāo)尺=100μm，40×)。Fig.1 The liver has irregular surface and hard constance，granular nodules and necrotic foci can be seen on the liver surface.Fig.2 Liver cellsdegeneration，necrosis and nodular regeneration.Disarrenged regenerative hepatocytes and pseudolobule formation.Central vein is absent in some pseudolobules.(HE，Bar=100μm，100×).Fig.3 Necrosis of hepatocytes and cholestasis(HE，Bar=100μm，200×)Fig.4 Disarranged regenerative hepatocytes and formation of hepatic pseudolobules.Extensive depositsofcollagen fibers in the pseudonudules. The central vein is absent in some pseudolobules.(Masson，Bar=100μm，40×).Fig.5 Hyperplasia of collagen fibers in the pirtal area.(Masson，Bar=100μm，10×)Fig.6 The pseudolobules were surrounded and separated by bundles of brown colored collagen fibers. No black colored reticular fibers were seen.(Reticular fiber Bar=100μm，40×)

3 討論

重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)中，肝臟是常見的毒性靶器官。為了對(duì)藥物相關(guān)性肝病和自發(fā)性病變進(jìn)行正確鑒別，需加強(qiáng)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自發(fā)性肝臟病變的研究。因此，本試驗(yàn)系統(tǒng)描述了自發(fā)性肝硬化比格犬肝臟肉眼形態(tài)學(xué)、組織病理學(xué)變化特征以及血清生化指標(biāo)改變。

肉眼形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示患病動(dòng)物腹腔內(nèi)出現(xiàn)約50 mL淡黃色腹水;病變肝臟形狀不規(guī)則、質(zhì)地變硬，表面可見大小不一的顆粒狀結(jié)節(jié)突出于肝臟表面。組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示患病肝臟肝細(xì)胞呈彌漫性變性、壞死伴結(jié)節(jié)狀再生，再生的肝細(xì)胞排列紊亂，形成數(shù)量不等的假小葉，假小葉被增生的膠原纖維所分割、包裹，假小葉內(nèi)中央靜脈缺如或偏位。肝臟匯管區(qū)膠原纖維增生，肝內(nèi)膽汁淤積。上述結(jié)果提示，患病動(dòng)物出現(xiàn)的肝臟病變?yōu)榻Y(jié)節(jié)性肝硬化。結(jié)節(jié)性肝硬化可通過網(wǎng)狀纖維染色與亞急性肝衰竭進(jìn)行鑒別診斷，亞急性肝衰竭時(shí)肝細(xì)胞壞死區(qū)域和假小葉周圍可見網(wǎng)狀纖維塌陷或沉積［6］。

生化檢測(cè)結(jié)果顯示肝硬化動(dòng)物ALT、AST、ALP、TBIL、GGT顯著升高，ALB顯著降低。試驗(yàn)中指標(biāo)升高的意義與病理學(xué)檢查結(jié)果相一致，如ALT、AST顯著升高提示了肝細(xì)胞存在廣泛的變性、壞死。生化檢測(cè)結(jié)果同時(shí)也解釋了肝硬化動(dòng)物出現(xiàn)的一些特殊體征，如動(dòng)物出現(xiàn)明顯腹水是由于肝臟合成蛋白能力下降［7］，血中ALB顯著降低引起低蛋白血癥所致;動(dòng)物出現(xiàn)皮膚粘膜黃染是由于膽紅素代謝障礙、肝內(nèi)膽汁淤積，血中TBIL顯著升高所致。

肝硬化是一種慢性進(jìn)行性疾病，病毒性肝炎、化學(xué)藥物、營(yíng)養(yǎng)不良、中毒等因素均可導(dǎo)致肝硬化的發(fā)生。研究表明，肝硬化病理過程起始于肝內(nèi)星狀細(xì)胞活化［8］。肝星狀細(xì)胞是存在于肝臟的一類特殊的間質(zhì)細(xì)胞，主要位于肝血竇內(nèi)皮與肝細(xì)胞之間的竇周隙內(nèi)?；罨蟮母涡菭罴?xì)胞可轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞，進(jìn)而使肝臟細(xì)胞外基質(zhì)及膠原纖維合成增多，引起細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生重構(gòu)形成纖維間隔［9-10］，導(dǎo)致肝臟假小葉被分割、包裹，最終形成肝硬化。

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Study on pathomorphological changes of the Iiver in Beagle Dog with spontaneous hepatocirrhosis

HU Jian-ting，QIU Bo，YING Yong，QU Hui-jin，WANG Feng-qian，ZHANG Xin
(Shandong Pharmaceutical Academy，Shandong Provincial Key Laboratory Of Chemical Drug，Shandong Jinan 250101，China)

ObjectiveTo study the liver pathomorphological and serum biochemical changes in Beagle dog with spontaneous hepatocirrhosis and establish the backgroud information of experimental animals for GLP.MethodsThe ALT，AST，TP，ALB，ALP，TBIL，TC，TG and GGT were detected using an automatic biochemical analyzer，and compared the differences of above index between blank control and diseased animal.The histological changes of the liver were observed by optical microscopy.ResultsCompared with the blank control，the ALT，AST，ALP，TBIL and GGT of diseased dogs were increased significantly，and the ALB decreased significantly.Compared with normal dogs，the liver cells had nodular regeneration，arranged irregularly and pseudolobule formation.The pseudolobules were packaged with collagen fibers. Conclusion It is suggested that spontaneous lesions in Beagle dogs should be monitored so as to provide appropriate experimental animal histopathologicalbackgroud information for drug safety evaluation.

Beagle dog;Hepatocirrhosis;Pathomorphology

R-332

A

1671-7856(2016)12-0055-04

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.12.011

2016-07-12

2014年省自主創(chuàng)新及成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng)計(jì)劃(2014ZZCX02104)。

胡建廷(1979-)，男，副主任藥師，研究方向:毒性病理，E-mail:jiantinghu@163.com。