郭銀華，談 勇，鄒奕潔

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023)

補腎促排卵湯對多囊卵巢綜合征模型大鼠卵巢形態(tài)及性激素的影響

郭銀華1，談 勇2，鄒奕潔1

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023)

目的通過觀察補腎促排卵湯對多囊卵巢綜合征模型大鼠的性激素、抗苗勒氏管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)、卵巢形態(tài)的影響，探討補腎促排卵湯治療多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)的作用機制。方法應(yīng)用補腎促排卵湯作用于以脫氫表雄酮誘導(dǎo)的 PCOS大鼠模型，對卵巢進行形態(tài)學(xué)分析并檢測血清性激素、AMH。結(jié)果與正常組相比，模型組大鼠卵巢彌漫性囊性重度擴張，可見大小不等的囊腔，粒層細胞被擠壓呈扁平或立方形，黃體及各種發(fā)育階段卵泡稀少。補腎促排卵湯能明顯改善PCOS模型大鼠成熟卵泡個數(shù)、黃體個數(shù)、性激素及AMH水平，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論補腎促排卵湯能改善 PCOS模型大鼠血清性激素水平、降低血清AMH及恢復(fù)卵巢排卵功能，從而達到治療多囊卵巢綜合征的作用。

多囊卵巢綜合征模型大鼠;補腎促排卵湯;性激素;抗苗勒氏管激素;卵巢形態(tài)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是青春期及育齡女性生殖功能障礙及代謝異常的常見內(nèi)分泌疾病，以長期無排卵和持續(xù)高雄激素血癥為主要特征，其發(fā)病率為5% ～10%［1］，占無排卵性不孕的75%。PCOS的病因和發(fā)病機制至今仍不十分清楚，其病理生理改變涉及的范圍較為廣泛，可涉及神經(jīng)、內(nèi)分泌、卵巢局部調(diào)控因素的異常變化以及脂肪、糖、蛋白質(zhì)代謝等。我科應(yīng)用國醫(yī)大師夏桂成教授的補腎促排卵湯治療多囊卵巢綜合征，臨床療效較好。研究表明［2，3］:補腎促排卵湯治療PCOS，可以改善卵泡質(zhì)量、提高排卵率、增加子宮內(nèi)膜厚度、改善子宮內(nèi)膜形態(tài)、提高子宮內(nèi)膜容受性，從而提高周期妊娠率，減少流產(chǎn)率，改善妊娠結(jié)局。本研究旨在通過觀察補腎促排卵湯對PCOS模型大鼠性激素、AMH水平以及卵巢形態(tài)的影響，探討補腎促排卵湯治療多囊卵巢綜合征的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:21日齡雌性 SD大鼠60只。由上海斯萊克實驗動物責任有限公司提供。生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)2007-0005，實驗動物使用許可證:SYXK(蘇)2007-0031。

1.1.2 藥品與試劑:補腎促排卵湯(炒當歸、赤白芍、熟地黃、川斷、菟絲子、鹿角片(先煎)、丹皮、茯苓、山藥各10克，等)，由江蘇省中醫(yī)院中藥房提供;枸櫞酸氯米芬片(clomifene citrate capsules，CC)，高特制藥有限公司;脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)，美國IL公司;注射用大豆油，廣州漢方現(xiàn)代中藥研究開發(fā)有限公司。睪酮T (testosterone)、雌二醇 E2(estradiol)、卵泡生成激素FSH(follicle stimulating hormone)、黃體生成激素LH (luteinizing hormone)、抗苗勒氏管激素 AMH(anti-Mullerian hormone)ELISA Kit 96T，購自上海聯(lián)碩生物技術(shù)有限公司。櫻花全自動真空組織脫水機，型號VIP5;櫻花包埋機，型號TECTM5;櫻花全自動染色機，型號 DRS2000，均購自日本櫻花醫(yī)療集團。Thermo半自動切片機，型號 HM340E，購自德國Thermo Fisher Scientific公司。Olympus顯微鏡，型號BX41，購自日本Olympus公司。

1.2 實驗方法

21日齡SD雌性大鼠，共60只。隨機分為正常對照組10只、PCOS模型組50只。正常對照組予以常規(guī)飼養(yǎng)。PCOS模型組的大鼠均于21日齡斷乳，標準大鼠顆粒飼料飼養(yǎng)。適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d后，即大鼠23日齡開始，頸背部皮下注射DHEA 60 mg/kg/ d，連續(xù)20 d，所有大鼠均在注藥的第20日(即大鼠42日齡日)20∶00開始禁食。并在注藥的第21天早晨，眼眶后靜脈取血，測血清T、E2、FSH、LH、AMH。大鼠動情周期陰道涂片的細胞變化特點如下:①動情前期:陰道涂片可見大量有核上皮細胞，偶有少量角化上皮細胞;②動情期:陰道涂片可見滿視野不規(guī)則的角化上皮細胞，呈“落葉狀”堆積，少量有核上皮細胞;③動情后期:陰道涂片可見角化上皮細胞、白細胞、有核上皮細胞，比例相當;④動情間期:陰道涂片可見大量白細胞，少量有核上皮細胞和陰道黏液。

陰道涂片失去完整動情周期及血清T升高者，為PCOS模型。按體重隨機分為模型空白對照組10只、中藥治療組10只、CC組各10只、中藥+CC組各10只，正常對照組10只。將其余大鼠剔除。正常對照組及模型空白對照組均給予正常顆粒飼料，中藥組予以補腎促排卵湯灌胃，CC組予以枸櫞酸氯米芬灌胃，中藥 +CC組予以補腎促排卵湯及枸櫞酸氯米芬灌胃。根據(jù)“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”計算，補腎促排卵湯給藥劑量為11.16 g生藥/kg/d，枸櫞酸氯米芬給藥劑量為4.5 mg/kg/d，各組均給藥12 d，給藥結(jié)束的次日，空腹眼眶取血后處死，取卵巢標本。

1.3 觀察方法

(1)血清T、E2、FSH、LH;(2)血清AMH;(3)陰道涂片觀察動情周期、取卵巢標本，HE染色并在顯微鏡下計算成熟卵泡數(shù)及黃體數(shù)。成熟卵泡的標準:卵泡腔很大，卵丘很明顯。卵泡內(nèi)膜細胞緊靠卵泡顆粒層，與顆粒層細胞之間有一層基膜相隔，內(nèi)膜細胞呈多邊形，胞質(zhì)清亮，胞核圓形，細胞間可見許多毛細血管，外膜細胞位于最外層，多呈梭形，與周圍結(jié)締組織分界不明顯。可見放射冠。各指標進行組間對照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標準差(±s)表示，采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用 LSD法，以P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 給藥結(jié)束血清 E2、T、LH、FSH、AMH水平(表1)

與正常組比較，模型組血清T、E2、AMH水平均顯著提高(P＜0.01)，而 LH、FSH沒有差異(P＞0.05);與模型組比較，中藥組、CC組、中藥+CC組血清T、E2、AMH水平均顯著下降(除中藥組E2與模型組比較P＜0.05外，其余數(shù)值P＜0.01);中藥組與CC組比較，血清T、AMH下降水平略差，但均沒有顯著差異(P＞0.05);中藥+CC組與中藥組比較，血清 T、LH水平均顯著下降(P＜0.01)，血清E2、FSH、AMH水平均沒有顯著差異(P＞0.05)。

2.2 卵巢HE染色(圖1)

正常對照組的大鼠卵巢皮質(zhì)部分，可以見到不同發(fā)育階段的卵泡、黃體及白體，顆粒細胞形態(tài)完整，排列較整齊，沒有見到細胞變性、壞死及炎細胞浸潤等病變，卵巢髓質(zhì)部分也無充血、水腫及炎細胞浸潤等病變。模型組大鼠卵巢彌漫性囊性重度擴張，可見大小不等的囊腔，粒層細胞被擠壓呈扁平或立方形，黃體及各種發(fā)育階段卵泡稀少。中藥組、氯米芬組、中藥+CC組卵巢彌漫性囊性輕度-中度擴張，可見黃體及閉鎖卵泡，各種發(fā)育階段卵泡輕度減少，與模型組比較，明顯好轉(zhuǎn)，中藥+CC組優(yōu)于CC組，CC組優(yōu)于中藥組。

2.3 成熟卵泡個數(shù)及黃體數(shù)量(表2)

每組觀察統(tǒng)計了10個卵巢，每個卵巢觀察統(tǒng)計了5張切片。

表1 給藥結(jié)束血清E2、T、LH、FSH、AMH水平Tab.1 The levels of serum E2，T，LH，F(xiàn)SH，and AMH after drug administration

表2 成熟卵泡數(shù)量及黃體數(shù)量Tab.2 The quantity of mature follicles and corpora lutea in the rats

圖1 給藥結(jié)束卵巢病理學(xué)改變(標尺=100 μm)Note.Arrows indicate follicles.Fig.1 Pathological changes of the ovaries after drug administration(Bar=100 μm)

與正常組比較，模型組成熟卵泡個數(shù)均顯著減少(P＜0.01);與模型組比較，中藥組成熟卵泡個數(shù)明顯增加(P＜0.05)，而CC組、中藥+CC組成熟卵泡個數(shù)均顯著增加(P＜0.01);中藥組與 CC組比較，成熟卵泡個數(shù)略少，但沒有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P＞0.05);中藥+CC組與CC組比較，成熟卵泡個數(shù)明顯增加(P＜0.05)。與正常組比較，模型組黃體個數(shù)均顯著減少(P＜0.01);與模型組比較，中藥組黃體個數(shù)明顯增加(P＜0.05)，而CC組、中藥+CC組黃體個數(shù)均顯著增加(P＜0.01);中藥組與CC組比較，黃體個數(shù)略少，但沒有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P＞0.05);中藥+CC組與 CC組比較，黃體個數(shù)略增加，但沒有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P＞0.05)。

3 討論

PCOS病理生理因素較為復(fù)雜，抗苗勒氏管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)屬于轉(zhuǎn)化生長因子b(tansforming growth factor-beta，TGF-b)超家族成員，在卵泡發(fā)育的啟動和選擇性生長中發(fā)揮了重要作用。AMH的效應(yīng)主要通過其 II型受體——AMHR2發(fā)揮作用，AMHR2分布在苗勒氏管周圍的間充質(zhì)細胞和兩性性腺，在女性卵巢中則主要表達于卵巢顆粒細胞(granulosa cells，GC)，此外在竇前卵泡和小竇狀卵泡內(nèi)膜細胞中也檢測到該受體的表達［4］。AMH作為卵巢重要的局部調(diào)節(jié)因子之一［5］，近年來成為了PCOS的發(fā)病機制的研究熱點。

研究發(fā)現(xiàn)AMH僅與的直徑小于2～5 mm小竇狀卵泡有關(guān)，過多的小竇狀卵泡導(dǎo)致了PCOS患者血清AMH水平的顯著升高［6］。過高的AMH水平可使顆粒細胞將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素的過程受到抑制，導(dǎo)致其卵巢局部出現(xiàn)了高雄激素的環(huán)境，抑制優(yōu)勢卵泡生成并又增加小竇卵泡，周而復(fù)始，形成惡性循環(huán)［7］，此外在體外細胞培養(yǎng)中，外源性AMH可以抑制原始卵泡的募集以及FSH誘導(dǎo)的卵泡生長發(fā)育，由此推斷這可能就是PCOS卵泡停滯的機制。

目前研究發(fā)現(xiàn)，補腎活血類中藥有使胰島素、睪酮降低的作用以及促進排卵的作用［8，9］。補腎活血類的中藥利于子宮內(nèi)膜的同步化［10］。補腎促排卵湯是全國中醫(yī)婦科名老中醫(yī)夏桂成教授在補腎調(diào)周法中的主要驗方，意在通過補腎，促使排卵。前期研究表明［2，3］補腎促排卵湯治療PCOS患者，可以改善卵泡質(zhì)量、提高排卵率、增加子宮內(nèi)膜厚度、改善子宮內(nèi)膜形態(tài)、提高子宮內(nèi)膜容受性，從而提高周期妊娠率，減少流產(chǎn)率，改善妊娠結(jié)局。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組血清T、AMH水平較正常組均顯著提高(P＜0.01)，中藥組、CC組、中藥+CC組血清T、AMH均較模型組顯著下降(P＜0.01);中藥+CC組與中藥組比較，血清T、LH顯著下降(P＜0.01)，而血清AMH略有下降但沒有顯著差異(P＞0.05)，中藥組與CC組比較，血清T、AMH下降水平?jīng)]有顯著差異(P＞0.05)。在卵巢形態(tài)方面，中藥組、CC組、中藥+CC組卵巢彌漫性囊性輕度-中度擴張，可見黃體及閉鎖卵泡，各種發(fā)育階段卵泡輕度減少，與模型組比較均明顯好轉(zhuǎn)，中藥+CC組優(yōu)于CC組，CC組優(yōu)于中藥組。模型組成熟卵泡個數(shù)及黃體個數(shù)均較正常組顯著減少(P＜0.01);與模型組相比較，中藥組優(yōu)勢卵泡個數(shù)、黃體個數(shù)明顯增加(P＜0.05)，而CC組、中藥+CC組優(yōu)勢卵泡個數(shù)、黃體個數(shù)顯著增加(P＜0.01);中藥 +CC組與CC組比較，成熟卵泡個數(shù)明顯增加(P＜0.05)，黃體個數(shù)略增加，但沒有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P＞0.05)，中藥組與 CC組比較，沒有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P＞0.05)。由此推論，補腎促排卵湯可能是通過降低PCOS模型大鼠異常升高的血清AMH，降低其血清雄激素水平，改善卵巢形態(tài)，促進了竇卵泡的募集，誘發(fā)恢復(fù)了排卵，從而起到了治療PCOS的作用。

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Effect of Bushencupailuan Decoction on ovarian morphology and sex hormone levels in rat models of polycystic ovary syndrome

GUO Yin-hua1，TAN Yong2，ZOU Yi-jie1
(1.The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine，Jiangsu Nanjing 210029，China; 2.Nanjing University of Chinese Medicine，Jiangsu Nanjing 210023)

ObjectiveTo explore the effect of Bushencupailuan decoction，a Chinese medicine formula，on polycystic ovary syndrome(PCOS)and its mechanism through observing the sex hormones，anti-Müllerian hormone (AMH)and the morphology of ovaries of PCOS rat models.MethodsBushencupailuan decoction was administered in DHEA-induced PCOS model rats.The pathology of ovaries was examined，and the serum sex hormones and AMH were detected.ResultsCompared with the normal group，the ovaries of model group rats had severe diffuse cystic dilatation and cystic cavities of different sizes.The granular layer cells were compressed into flat or cubical shapes.Corpora lutea and follicles in various stages of development were rare.Bushencupailuan decoction obviously improved the numbers of mature follicles and corpora lutea，levels of sex hormones and AMH of PCOS model rats compared with those of model rats(P＜0.05).ConclusionsBushencupailuan decoction can treat PCOS by improving the serum sex hormone levels in PCOS model rats，reduce serum AMH and help to restore ovulation.

Polycystic ovary syndrome，PCOS;Rat model;Bushencupailuan decoction;Sex hormones;Anti-Mullerian hormone，AMH;Morphology，ovary

R-33

A

1671-7856(2016)12-0027-05

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.12.006

2016-06-16

江蘇省中醫(yī)藥局2010年度康緣中醫(yī)藥科技創(chuàng)新基金項目(HZ1010KY)。

郭銀華(1980-)，女，博士生在讀，副主任中醫(yī)師，從事生殖內(nèi)分泌研究。E-mail:gyhwelcome@126.com。

談勇(1956-)，女，博士生導(dǎo)師，主任中醫(yī)師，從事生殖內(nèi)分泌研究。E-mail:xijun1025@163.com。