董晤訊，袁翰，馬勇，郭楊，苑文超，李廣廣，黃桂成

（南京中醫(yī)藥大學(xué)骨傷修復(fù)與重建新技術(shù)實驗室，江蘇 南京 210023）

骨血管生成機制與功能的研究進展*

董晤訊，袁翰，馬勇，郭楊，苑文超，李廣廣，黃桂成

（南京中醫(yī)藥大學(xué)骨傷修復(fù)與重建新技術(shù)實驗室，江蘇 南京 210023）

骨骼是高度血管化的組織，依賴于血管和骨細(xì)胞之間的密切關(guān)系，以維持骨骼完整性。因此，血管生成在骨骼發(fā)育、修復(fù)和重塑中起關(guān)鍵作用。骨血管是為骨細(xì)胞傳遞氧、營養(yǎng)素、激素、神經(jīng)遞質(zhì)和生長因子等的主要通道，骨血管還參與協(xié)調(diào)造血過程。骨毛細(xì)血管可以區(qū)分出兩種亞型，包括位于干骺端的H型和在骨干的骨髓腔中形成毛細(xì)管網(wǎng)的L型。已有研究表明，血管生成和骨形成的過程是偶聯(lián)的，這其中涉及多種細(xì)胞因子、信號通路及microRNA的參與。該研究回顧關(guān)于骨血管的結(jié)構(gòu)、功能和相關(guān)調(diào)節(jié)因素的最新數(shù)據(jù)，特別強調(diào)血管生成和血管功能在骨發(fā)育和再生中的作用及其在骨折愈合和骨組織工程中的應(yīng)用。

血管生成；骨形成；內(nèi)皮細(xì)胞；成骨細(xì)胞；軟骨細(xì)胞；microRNA

骨骼不僅為身體提供結(jié)構(gòu)支持，還參與運動、保護身體、制造紅血球和白血球及儲藏礦物質(zhì)等生理活動。哺乳動物的骨主要有2種類型，長骨和扁平骨均以不同的方式形成。長骨通過軟骨骨化形成，在該過程中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）分化成不同類型的造骨細(xì)胞，即軟骨細(xì)胞、骨原細(xì)胞和成骨細(xì)胞，先形成無血管的軟骨板，塑造骨的基本形態(tài)，之后新骨和骨髓逐漸取代軟骨板；而扁平骨由膜內(nèi)骨化形成，MSCs直接分化為成骨細(xì)胞譜系，在局部聚集，形成1個骨化中心，分泌細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）促進骨形成。

研究表明[1]，骨形成與血管生成兩者過程是偶聯(lián)的。一方面，骨細(xì)胞分泌促血管生成因子，其中最重要的是血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），觸發(fā)包括血管內(nèi)皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞群產(chǎn)生信號應(yīng)答。另一方面，骨血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放可以作用于軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞譜系的細(xì)胞因子。此外，血管生成在骨發(fā)育和骨折修復(fù)中也起著重要作用，局部血管的變化也與許多骨骼疾病的進展有關(guān)，如骨質(zhì)疏松癥、骨壞死、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨腫瘤及轉(zhuǎn)移等[2]。

1 血管與血管生成

血管由不同類型的細(xì)胞組成。血管的內(nèi)層由內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cell，ECs）組成，外層由血管周圍細(xì)胞組成。血管周圍細(xì)胞嵌入到內(nèi)皮下基底膜中，與毛細(xì)血管ECs和血管平滑肌細(xì)胞進行細(xì)胞間接觸，而缺乏與ECs的物理接觸。血管形成有兩個過程：血管發(fā)生和血管生成。血管發(fā)生：在早期胚胎發(fā)育中，中胚層細(xì)胞分化為成血管細(xì)胞（ECs和血細(xì)胞的祖細(xì)胞），其遷移到特定位置并聚集，形成第一原始血管；血管生成：通過一系列過程如ECs發(fā)芽，遷移，增殖，血管吻合和修剪來擴大現(xiàn)有血管網(wǎng)絡(luò)。血管發(fā)生需要不同類型血管細(xì)胞之間廣泛協(xié)調(diào)，以確保新血管功能的完全和穩(wěn)定。大量研究表明[3]，由于局部微環(huán)境信號介導(dǎo)ECs中的特定分子對血管進行標(biāo)記，所以針對不同器官，血管的形成具有特異性，骨血管系統(tǒng)也不例外。

1.1 骨血管結(jié)構(gòu)

早期研究中使用染料注射和放射性顯微照片使血管可視化，這對骨血管組織，特別是進入股骨頭的動脈血管提供重要認(rèn)識。早期研究表明，骨血管組織在不同種類哺乳動物中相似，包括大鼠，兔子，豚鼠和人類。近年來，隨著各種研究技術(shù)的進步，如鑒定細(xì)胞類型特異性標(biāo)記，轉(zhuǎn)基因熒光報告基因，共聚焦和雙光子顯微鏡成像，微計算機斷層掃描（micro-CT），三維（3D）重建成像，以及組織處理和免疫染色方案的改進，使骨血管組織及其功能得到了進一步理解。

骨是高度鈣化、富含基質(zhì)的組織，同時也是高度血管化的組織，除了生長板和關(guān)節(jié)軟骨，在骨骼系統(tǒng)的所有區(qū)域中均存在血管?；跇?biāo)記表達和功能特征的差異，骨毛細(xì)血管可以區(qū)分出2種亞型：H型和L型。H型毛細(xì)血管位于干骺端，干骺端包含有無血管的生長板，干骺端中的H型毛細(xì)血管在生長板附近互連為血管柱。該血管以及相鄰密質(zhì)骨骨內(nèi)膜上的H型毛細(xì)血管與表達成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子osterix的骨原細(xì)胞相關(guān)，高水平表達血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子CD31（platelet endothelial cell adhesion molecule-1）和內(nèi)皮粘蛋白 EMCN（endomucin）。研究表明[4]，H型血管內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量與年齡相關(guān)，與H型相反，L型血管內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量不隨年齡改變。

在長骨遠端的橫截面中，H型血管密集排列，并且在生長板附近相互連接。而L型血管在骨干的骨髓腔中形成密集、高度分枝的毛細(xì)管網(wǎng)，表達較低水平的CD31和EMCN。L型毛細(xì)血管被密集的造血細(xì)胞包圍，并且連接中央靜脈。動脈和遠端小動脈血不直接進入L型毛細(xì)血管，而是流入到干骺端和骨內(nèi)膜上的H型毛細(xì)血管中。由于骨血管組織的這種特異性，血液通過動脈流入H型毛細(xì)血管，在干骺端和骨干交接處進入L型毛細(xì)血管網(wǎng)，最終流入中央靜脈[5]。因此，可以在新生的長骨中檢測到不同的代謝環(huán)境：由于缺乏直接的動脈血液和大量的造血細(xì)胞供應(yīng)，骨干高度缺氧，而新生和青春期小鼠的干骺端則具有良好的氧供。

骨血管還含有不同類型的血管周細(xì)胞。在骨髓中，L型血管的血管周細(xì)胞有2種類型，即瘦素受體（leptin receptor，LEPR）陽性細(xì)胞和趨化因子CXCL12（C-X-C chemokine ligand 12）豐富的網(wǎng)狀（CAR）細(xì)胞。研究表明[6]，血管周細(xì)胞分泌的信號分子如干細(xì)胞因子（SCF或KITL），CXCL12和血管生成素，在調(diào)節(jié)造血過程中起著重要作用。LEPR陽性細(xì)胞可表達血小板衍生生長因子受體α（platelet-derived growth factor receptors，PDGFR α），但對周細(xì)胞標(biāo)記物血小板衍生生長因子受體β（platelet-derived growth factor receptors，PDGFR β）和神經(jīng) /神經(jīng)膠質(zhì)抗原 2（neural/glial antigen2，NG2）及硫酸軟骨素蛋白聚糖 4（chondroitin sulfate proteoglycan 4，CSPG4）呈陰性。該巢蛋白-GFP報告基因低表達的細(xì)胞具有分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的能力。在軟組織中，α平滑肌肌動蛋白（alpha smooth muscle actin，αSMA）陽性的平滑肌細(xì)胞覆蓋骨動脈，該細(xì)胞可表達NG2，并具有分化成不同間充質(zhì)細(xì)胞的能力。干骺端的H型毛細(xì)血管柱周圍存在PDGFRβ+和NG2+血管周細(xì)胞，H型毛細(xì)血管的ECs可通過分泌血小板衍生生長因子B（platelet derived growth factor B，PDGFB）來調(diào)節(jié)這兩種血管周細(xì)胞[7]。

綜上，可以明確骨血管包含幾種不同類型的血管周細(xì)胞群，其在調(diào)節(jié)造血，成骨和血管穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。

1.2 骨血管生成

骨血管由血管發(fā)生形成。鼠長骨的血管在胚胎發(fā)育第13～14 d開始侵入軟骨板，并在成年之前不斷生長[8]。軟骨內(nèi)血管生成是1個復(fù)雜的過程：①軟骨細(xì)胞在初級骨化中心（primary ossification center，POC）停止增殖，成為肥大軟骨細(xì)胞，與骨原細(xì)胞一起分泌促血管生成因子并刺激血管生成；②血管侵入肥大軟骨板，形成骨化過程中的初始血管網(wǎng)絡(luò)，在發(fā)育的長骨兩端，通過成熟和肥大生長板，軟骨細(xì)胞釋放信號，進一步促進血管生長和骨化，使骨骼生長延伸；③血管在長骨的兩個遠端處侵入骺軟骨板，形成二級骨化中心（secondary ossification center，SOC）。

扁平骨通過膜內(nèi)骨化形成，因此沒有軟骨板。與長骨相似，扁平骨高度血管化。其血管化過程與軟骨內(nèi)血管生成過程相似，這表明兩者分子機制類似。由于大多數(shù)研究涉及軟骨內(nèi)血管生成，本文將重點對軟骨內(nèi)血管生成進行綜述。

1.3 骨血管生成相關(guān)信號因子及通路

目前，已有研究表明[9]，氧張力和VEGF家族生長因子是促進軟骨內(nèi)血管生成的主要因素，不但影響ECs和骨細(xì)胞譜系，而且證明血管生成和骨形成的過程是偶聯(lián)的。

1.3.1 VEGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo) VEGF-A是誘導(dǎo)血管生成的關(guān)鍵分子，由肥大軟骨細(xì)胞高度表達和分泌。VEGF-A主要通過結(jié)合其受體VEGFR1（KDR/Flk-1）和VEGFR2（Flt-1）來發(fā)揮作用。盡管VEGF-A對VEGFR1具有較高的親和力，但是血管生成作用主要由VEGFR2介導(dǎo)。當(dāng)結(jié)合VEGFR1時，VEGF-A傳遞非常弱的有絲分裂信號，但是在結(jié)合VEGFR2后，內(nèi)皮細(xì)胞接受非常強的有絲分裂信號。

VEGF-A主要存在三大亞型：VEGFA120-可溶且不結(jié)合基質(zhì)、VEGFA164-可溶或與基質(zhì)結(jié)合、VEGFA188-難溶且高度結(jié)合基質(zhì)。該亞型可引起不同的生物效應(yīng)：僅表達VEGFA120的小鼠顯示出軟骨內(nèi)血管生成與礦化減少，并且POC中成骨細(xì)胞標(biāo)記物的表達降低。而VEGFA164或VEGFA188的表達即可誘導(dǎo)發(fā)育的POC中血管生成。成骨細(xì)胞譜系中VEGFA164過表達，可激活β-連環(huán)蛋白信號通路，刺激骨血管生成和骨形成[10]；然而，僅與基質(zhì)結(jié)合的VEGFA188亞型的表達導(dǎo)致SOC血管生成受損，這表明可溶性VEGF-A的擴散是骨血管生成所必需的。

此外，ECs中編碼VEGFR2基因的特異性失活，可導(dǎo)致干骺端臨近生長板的血管大量減少。PI3KAkt通路是活化的VEGF受體觸發(fā)的主要信號通路之一。相對于AKT2和AKT3，激酶AKT1在ECs中高表達，小鼠AKT1敲除后導(dǎo)致骨形成和血管生成減少[11]。

1.3.2 缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxaia-inducibble factor，HIF） 缺氧可激活各種細(xì)胞內(nèi)信號通路，并通過HIF調(diào)節(jié)靶基因表達。HIFs是異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子，由HIF-α及HIF-β組成，其中，HIF-α有3種，分別為 HIF-1α、HIF-2α 及 HIF-3α；HIF-β，即芳香烴受體核轉(zhuǎn)運蛋白，也有3種，分別為HIF-1β、HIF-2β及HIF-3β。HIF-α為功能性亞基，決定HIFs的活性，受細(xì)胞內(nèi)氧濃度的調(diào)節(jié)；HIF-β為結(jié)構(gòu)性亞基，在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達，起結(jié)構(gòu)性作用，不受氧濃度的影響和調(diào)節(jié)。HIF1α和HIF2α在低氧狀態(tài)（＜5%氧）下穩(wěn)定表達。在常氧（＞5%氧）中，HIF-α與Von Hippel-Lindau（VHL）蛋白結(jié)合后，被泛素連接酶E3受體識別，形成 E3泛素連接酶復(fù)合物。HIF靶基因參與多種生物過程，如無氧代謝和血管生成。軟骨細(xì)胞利用無氧代謝在缺氧條件下存活，而HIF1α調(diào)節(jié)許多在該過程中起重要作用的基因[12]。因此，小鼠HIF1α的敲除可導(dǎo)致生長板內(nèi)部缺氧區(qū)的細(xì)胞大量死亡。

缺氧主要通過調(diào)控VEGF表達，促進血管生成。調(diào)控成骨細(xì)胞的HIF-1通路，使VEGF和其他血管發(fā)生相關(guān)因子過表達，可刺激骨血管生成及骨形成[13]。因此，在成骨細(xì)胞中特異性的敲除HIF1α，可導(dǎo)致骨血管生成和骨形成減少。相反，HIF1α在成骨細(xì)胞中特異性過表達或敲除VHL可導(dǎo)致骨血管生成和骨形成增加。HIF1α和HIF2α也轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)ECM基因的表達，并且缺失可導(dǎo)致ECM分泌受損，從而影響軟骨形成和成骨。此外，ECs中缺氧信號通路的激活也可引起H型毛細(xì)血管數(shù)量增加，從而使骨血管生成和骨形成增加[14]。

1.3.3 基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMPs） 盡管骨骼高度礦化并富含ECM，但是骨骼在生長過程中仍會重塑，并保持修復(fù)能力。軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分泌的基質(zhì)分子對礦化至關(guān)重要。在血管侵入到POC期間，MMPs誘導(dǎo)ECM蛋白水解，導(dǎo)致基質(zhì)重塑、ECs遷移和增殖[15]。MMPs主要由破骨細(xì)胞和血管細(xì)胞分泌，其中MMP-9和MMP-13在骨血管生成和骨重塑中起重要作用。此外MMPs的蛋白水解活性可被組織金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs） 特異性抑制[16]。

ECM可通過整聯(lián)蛋白家族異二聚體受體誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，這種基質(zhì)-整聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對于血管生成和血管完整性至關(guān)重要。與基質(zhì)結(jié)合的VEGF可誘導(dǎo)VEGFR2活化延長和促分裂原活化蛋白（mitogen-activated protein，MAP）激酶 p38的下游活化；還可以誘導(dǎo)整聯(lián)蛋白β1亞基與VEGFR2、粘著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）結(jié)合。綜上，可見VEGF與基質(zhì)結(jié)合對于骨血管生成至關(guān)重要。MMPs的基質(zhì)修飾性質(zhì)也可影響血管生成和骨形成。有研究表明[17]，MMP-9敲除小鼠存在軟骨內(nèi)骨化缺陷，該缺陷與VEGF的生物利用度不足有關(guān)，而使用外源VEGF可避免該缺陷。這與早期研究一致，表明MMP-9參與ECM釋放VEGF的過程。在MMP-13突變小鼠中，可見生長板和板狀骨增加，但在血管系統(tǒng)中無明顯變化。相比之下，缺乏MMP-13和MMP-9的雙突變體小鼠，軟骨內(nèi)血管生成及ECM重塑減少，且伴有骨形成缺陷[18]。本研究結(jié)果強調(diào)MMPs的重要作用，表明其通過細(xì)胞基質(zhì)和生長因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在多方面控制血管生成和骨形成。

1.3.4 成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）信號通路 FGF具有18個配體，可通過4種不同的酪氨酸激酶受體（FGFR1-4）發(fā)出信號，誘導(dǎo)效應(yīng)，如細(xì)胞存活，增殖和分化[19]。在成骨期間，F(xiàn)GF2，F(xiàn)GF9和FGF18以及受體FGFR1-3以階段和細(xì)胞類型依賴的方式表達。受體FGFR1和FGFR2在骨血管中表達，而FGFs由軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分泌。此外，F(xiàn)GF可誘導(dǎo)VEGFA和VEGFR2表達。FGF2可增加血管內(nèi)皮粘附分子VE-鈣粘蛋白（或鈣粘蛋白5）和緊密連接蛋白ZO-1（或TJP1）的表達，從而刺激骨動脈血管擴張。在敲除FGF2的突變小鼠中，骨小梁體積、礦物質(zhì)附著和骨形成速率降低[20]。FGF9和FGF18可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞增殖，其缺失可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞增殖減少。在FGF9和FGF18特異性敲除小鼠顯示出VEGFA表達減少，POC血管形成延遲[21]。此外，ECs中編碼FGFR1/2基因的特異性失活可導(dǎo)致血管通透性增加、骨血管周細(xì)胞缺失。本研究表明，F(xiàn)GFR1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)維持骨血管結(jié)構(gòu)和功能的完整性。綜上，表明FGF信號通路參與血管生成和骨形成的調(diào)節(jié)。

1.3.5 Notch信號通路 Notch信號通路可調(diào)節(jié)VEGF的促血管生成作用。有研究發(fā)現(xiàn)[22]，ECs中Notch信號通路的失活可引起ECs增殖和出芽增加，導(dǎo)致軟組織中血管過度增生。而激活骨ECs中Notch信號通路則可促進局部血管生成和骨形成。Notch受控的ECs分泌頭蛋白，頭蛋白是骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）通路的拮抗劑，可促進相鄰生長板中肥大軟骨細(xì)胞形成。EC-特異性Notch缺失突變體，即缺乏Notch配體DLL4或 Notch控制的基因調(diào)節(jié) RBPJκ（recombination binding protein-J）的介質(zhì)的小鼠，表現(xiàn)出血管生成及H型血管減少、骨形成缺陷。有研究表明[23]，在EC-特異性突變體中，由于成熟和肥大的軟骨細(xì)胞缺陷，導(dǎo)致VEGF的分泌減少，并形成不規(guī)則和增大的生長板。與配體結(jié)合的Notch受體活化需要經(jīng)歷一系列蛋白水解切割過程，其中之一便由ADAM家族金屬蛋白酶ADAM10介導(dǎo)。因此，ECs中ADAM10的缺失可導(dǎo)致骨生長受損和生長板缺陷，這與其他EC-特異性Notch功能缺失突變體中看到的表型一致[24]。

1.3.6 骨血管生成相關(guān)miRNA microRNA已經(jīng)被證實參與各種生理和病理過程[25]。miRNA的表觀遺傳調(diào)控是骨骼系統(tǒng)疾病研究的新領(lǐng)域[26]。有研究表明，miRNA-126可增強VEGF和成纖維細(xì)胞生長因子FGF的生成及作用；通過抑制血管生成信號傳導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)酶抑制劑Sprouty相關(guān)蛋白1（sprouty-related protein 1，Spred-1） 的表達促進血管生成[27]。miRNA-381在異常WNT1誘導(dǎo)型信號通路蛋白-1（WISP-1）誘導(dǎo)的VEGF-A表達和血管生成中具有重要作用。WISP-1通過下調(diào)miRNA-381表達促進人骨肉瘤細(xì)胞中的VEGF-A表達，隨后誘導(dǎo)人內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）遷移和血管形成[28]。血管生成是股骨頭類固醇相關(guān)性骨壞死（steroid induced osteoncnosis of the femoral head，SONFH）的重要事件。研究表明[29]，與SONFH相比，miRNA-210在正常骨組織中甲基化，導(dǎo)致該組織中miRNA-210表達的抑制。一旦股骨頭發(fā)生骨壞死，miRNA-210脫甲基化而表達上調(diào)，相應(yīng)地激活血管生成以用于股骨頭愈合。用去甲基化劑處理的內(nèi)皮細(xì)胞可以增加miRNA-210的表達，同時促進細(xì)胞活力和分化。此外，去甲基化處理后細(xì)胞上清液增強機體募集微血管的能力。

1.3.7 其他生長因子和轉(zhuǎn)錄因子 結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF/CCN2）和激酶c-RAF（RAF1）參與VEGFA表達的調(diào)節(jié)，進而參與骨血管生成。CTGF是CCN家族的一員，分泌基質(zhì)細(xì)胞蛋白，與生長因子和整聯(lián)蛋白相互作用。在軟骨內(nèi)血管生成期間，軟骨膜和肥大軟骨細(xì)胞強表達CTGF。CTGF募集破骨細(xì)胞，促進肥大軟骨細(xì)胞表達VEGF、ECM生成和骨發(fā)育。c-RAF是MEK1/2（或MAP2K1/2）激酶的上游激活劑，其控制MAP激酶信號通路活性。c-RAF在肥大軟骨細(xì)胞中強表達，其在該細(xì)胞中的缺失導(dǎo)致肥大軟骨細(xì)胞凋亡和擴張減少。軟骨細(xì)胞特異性c-RAF功能缺失可導(dǎo)致孕齡15 d半的胎鼠血管侵入POC，以及35 d的新生鼠干骺端血管生成減少。此外，也有研究表明[30]，該變化與VEGFA降解增強相關(guān)，與編碼VEGFA164和VEGFA188轉(zhuǎn)錄物的改變無關(guān)。

如上所述，肥大軟骨細(xì)胞通過分泌促血管生成因子，促進血管生成，然而增殖的軟骨細(xì)胞仍處于缺氧狀態(tài)，抑制血管生長。研究表明[31]，增殖的軟骨細(xì)胞通過分泌軟骨調(diào)節(jié)蛋白1（或LECT1）和tenomodulin因子，抑制生長板和軟骨血管化；SOX9的失活/激活會阻礙血管生成，減少VEGFA表達，導(dǎo)致血管生成和骨形成減少。

2 血管生成在骨修復(fù)中的作用

以上論述表明骨骼系統(tǒng)中不同類型細(xì)胞之間的相互作用十分密切。成骨細(xì)胞譜系的軟骨細(xì)胞產(chǎn)生VEGFA之類的促血管生長因子，同時血管又是作用于骨細(xì)胞信號的來源，兩者相互作用影響骨發(fā)育和骨修復(fù)。血管實現(xiàn)了Osterix陽性骨原細(xì)胞從軟骨膜到干骺端的遷移，進而促進了骨小梁的形成[32]。由于生長因子和ECs誘導(dǎo)的BMP拮抗劑的產(chǎn)生，使得Osterix陽性細(xì)胞優(yōu)先與干骺端和內(nèi)皮中的H型毛細(xì)血管發(fā)生關(guān)聯(lián)。遠端小動脈直接連接干骺端和骨內(nèi)膜H型血管，那么營養(yǎng)物質(zhì)的供給將是形成骨祖細(xì)胞生長環(huán)境的重要因素[33]?？梢姡苌L和促血管生成信號之間的相互作用十分重要。

2.1 骨血管在骨折愈合中的作用

由于骨損傷和局部血管的破壞導(dǎo)致炎性細(xì)胞滲出和血腫形成，所以骨折愈合是一個極其復(fù)雜的過程。目前，雖然明確肯定血管在骨重建過程中的重要作用，但是在骨修復(fù)期間血管的重塑和重組機制尚未完全明確，該過程是否引起不同來源的ECs的混合還有待探討。血管向內(nèi)生長的特性在軟骨痂的形成過程中十分重要，不僅加快軟骨內(nèi)骨形成進程，還將愈傷組織轉(zhuǎn)化成剛性鈣化組織，從而實現(xiàn)血管重塑、骨修復(fù)[34]。

研究表明[35-36]，促血管生成因子影響骨折愈合。在兔骨折模型中，應(yīng)用VEGF對骨折區(qū)域進行治療，加速了骨折愈合和血管生成。在小鼠骨折模型中，應(yīng)用可溶性重組VEGFR1（或FLT1）融合蛋白阻斷內(nèi)源性VEGF，可減少骨血管生成和愈傷組織礦化，抑制小鼠骨折愈合。VEGFR1可分泌產(chǎn)生血管生長的負(fù)調(diào)節(jié)劑，炎癥細(xì)胞表達VEGFR1，并募集到組織損傷部位，進而影響骨折愈合。胎盤生長因子（PIGF或PGF）是VEGF家族的成員和VEGFR1的配體，也參與調(diào)節(jié)骨愈合，并控制一系列骨組織再生和病理過程。研究表明，PIGF基因敲除小鼠模型炎癥過度聚集、成骨和愈傷組織重塑減少，導(dǎo)致骨折難以修復(fù)[37]。

FGF信號的傳導(dǎo)不但在骨形成和血管發(fā)生方面發(fā)揮重要作用，而且與骨修復(fù)聯(lián)系密切。研究表明，在骨折愈合期間，F(xiàn)GF和FGF受體表達增加，而且FGF2在骨修復(fù)期間，刺激血管生成和成骨[38]。DJ-1（PARK7）作為MSCs分泌的血管生成因子，可以活化FGFR1介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)，并在體外刺激血管生成和成骨細(xì)胞分化。另外，也有研究表明在大鼠骨折模型中，DJ-1促進大鼠骨折的愈合。研究發(fā)現(xiàn)[39]，在FGF9基因復(fù)合突變體小鼠模型中顯示骨損傷處，VEGF和VEGFR2的表達降低，破骨細(xì)胞減少，且MMP-9的表達降低。針對該情況，可以通過重組VEGFA而促進部分組織愈合，而通過FGF9治療則可以使受損部位完全修復(fù)。重組VEGFA和FGF9的聯(lián)合應(yīng)用不但可以促進2型糖尿病小鼠模型中的血管產(chǎn)生，而且有助于成骨和骨再生的增加[40]。

轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β），BMP和生長分化因子（growth differention factor，GDF）也在發(fā)育期間控制骨形成并刺激骨修復(fù)。研究表明[41]，在動物模型中全身注射TGF-β，可增加愈傷組織體積和骨強度。在愈合過程中，TGF-β介導(dǎo)軟骨細(xì)胞和骨原細(xì)胞的分化并刺激基質(zhì)產(chǎn)生，但目前其在血管發(fā)生中的潛在作用尚未明確。BMP信號傳導(dǎo)刺激間充質(zhì)和骨原細(xì)胞增殖和分化，BMP2和BMP7可以誘導(dǎo)骨形成、刺激骨修復(fù)，誘導(dǎo)VEGF表達、刺激血管生成[42]。

以上研究表明，在骨折愈合、骨形成期間，控制血管生成的途徑多樣，主要集中在細(xì)胞分子、信號通絡(luò)方面。其中間充質(zhì)干細(xì)胞中的Notch信號通路，可促進其增殖并抑制分化。但是Notch1的過表達可導(dǎo)致成骨細(xì)胞譜系中細(xì)胞的增殖和分化，而抑制成骨細(xì)胞中Notch信號傳導(dǎo)，可引起老年小鼠骨質(zhì)疏松的發(fā)生[43]。目前，仍需要大量研究揭示信號傳導(dǎo)通路之間的相互作用，并探索潛在的治療應(yīng)用，以防止骨丟失并促進骨折愈合。

2.2 骨血管生成在組織工程骨中的應(yīng)用

目前組織工程骨的血管化不足、缺乏功能性血管已成為其發(fā)展進入臨床應(yīng)用的最大障礙。國內(nèi)外許多研究證實，血管內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）可以通過增強骨修復(fù)過程中的血管生成與骨形成能力來促進骨缺損修復(fù)[44]。移植的EPCs通過直接形成新血管可提高早期血管形成。同時，移植的EPCs釋放趨化因子（VEGF）以招募宿主的EPCs并刺激骨缺損中的血管形成[45]。一項將EPCs和MSC共培養(yǎng)形成的細(xì)胞片移植到大鼠牙槽骨缺損模型中的研究顯示，與MSC單獨移植相比，EPCMSC細(xì)胞片的移植可以更好地改善大鼠牙槽骨缺損模型的骨再生。EPC-MSC細(xì)胞片中血管生成基因（VEGF-A和KDR）的表達高于MSC片段。EPC-MSC共培養(yǎng)移植物可誘導(dǎo)血管生成生長因子上調(diào)，產(chǎn)生有利于血管生成和成骨的環(huán)境[46]。有研究將單純EPCs、BMSCs及聯(lián)合培養(yǎng)組的組織工程骨移植到兔四肢肌袋內(nèi)，移植后隨時間延長成骨增加，新生血管長入增多。提示EPCs可加快組織工程骨內(nèi)新生血管及血管網(wǎng)的形成，增加BMSCs的存活數(shù)量，提高其增殖和成骨轉(zhuǎn)化能力[47]。有研究發(fā)現(xiàn)，EPCs與MSCs共接種比例為1∶1時，MSCs的細(xì)胞存活能力最強，可以提高組織工程骨的細(xì)胞上架率?；贓PCs的預(yù)血管化策略能促進組織工程骨在體內(nèi)更早地實現(xiàn)血管化，以恢復(fù)骨缺損區(qū)的血供[48]。另外一項研究表明，局部移植hEPCs增加血管密度和成骨，而礦物質(zhì)密度沒有變化。hEPC的局部移植顯示出良好的安全性，在局部hEPC移植后5個月，在組織和器官水平上，在移植部位或遠處器官中無炎癥反應(yīng)或發(fā)育異常變化[49]。

3 未來展望

骨骼系統(tǒng)的形成和體內(nèi)平衡依賴于不同細(xì)胞的整合活性。然而，ECs是控制軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的信號的關(guān)鍵來源，從而為在血管生成和成骨期間的耦合提供契機。

骨形成和血管生成之間的聯(lián)系，對深入了解骨疾病和衰老具有重要的意義。骨骼在生物體的存活期間持續(xù)重塑，該作用主要體現(xiàn)在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的持續(xù)動態(tài)平衡。骨形成和再吸收之間的平衡是維持骨骼強度和功能的關(guān)鍵，因此，其狀態(tài)失衡可導(dǎo)致骨礦物質(zhì)密度降低、骨質(zhì)疏松性骨丟失和骨折風(fēng)險增高。年老時，骨吸收因激素和其他因素的變化而增加，而成骨作用逐漸下降[50]。在卵巢切除小鼠骨質(zhì)疏松模型中，血管中高表達的CD31減少[51]，表明其在局部血管的改變可能有助于病理狀態(tài)的改變。同時，也為通過調(diào)控骨血管生成用于預(yù)防因年齡或疾病引起的骨量丟失疾病的治療提供新的方法，為缺血性壞死疾病的治療提供新思路。然而，諸多研究仍然停留在基礎(chǔ)實驗研究階段，至于能否在臨床研究中取得好的結(jié)果還尚不清楚。盡管如此，骨血管和ECs亞群在各種生理和病理環(huán)境中作用確切，這也將增強筆者對骨骼系統(tǒng)疾病機制的進一步了解。

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（王榮兵 編輯）

Systemic review of mechanism and function of bone vascularization*

Wu-xun Dong,Han Yuan,Yong Ma,Yang Guo,Wen-chao Yuan,Guang-guang Li,Gui-cheng Huang
(Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing,Jiangsu 210023,China)

The bone is a highly vascularized organ which depends on intimate connection between blood vessels and cells to maintain its integrity.Thus,angiogenesis plays a pivotal role in development,repair and remodeling of bone.Blood vessel is the main channel for the transmission of oxygen,nutrients,hormones,neurotransmitters and growth factors for bone cells.Vessels are also involved in coordinating the hematopoiesis procedure.There are 2 subtypes of capillaries in bone,including H-type located in the metaphyseal and L-type in the backbone of the bone marrow cavity.Studies have shown that angiogenesis is closely associated with bone formation requiring cytokines,MicroRNA and other signaling pathways.In this paper,we reviewed the latestpublicationson the structure,function and related regulatory factorsofbone vessels.More specifically,we emphasize on the role of angiogenesis and vascular function in development and regeneration of bone,which may provide therapeutic approaches in fracture healing and bone engineering.

angiogenesis;bone formation;endothelial cells;osteoblasts;chondrocytes;MicroRNA

R681

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.27.010

1005-8982（2017）27-0051-08

2017-05-24

江蘇省高校研究生科研創(chuàng)新計劃項目（No：KYZZ16_0409）；江蘇省金壇市科研計劃項目（No：JT2013070）

黃桂成，E-mail：hgc@njutcm.edu.cn