李萌萌綜述，周建業(yè)、宋江平審校

綜述

誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞在心肌病中的應(yīng)用

李萌萌綜述，周建業(yè)、宋江平審校

誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）的研究促進(jìn)了再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展。在外源因子作用下，分化成熟的細(xì)胞通過誘導(dǎo)去分化變?yōu)榫哂蟹只瘽撃艿亩嗄芨杉?xì)胞，后者亦可再分化為其他細(xì)胞。心肌病是心血管疾病中一類常見疾病，終末期可進(jìn)展為心力衰竭，是目前世界范圍內(nèi)主要致死因素之一。本文對iPSC在心肌病臨床和基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用作一綜述。

綜述； 心肌病；干細(xì)胞

2006年,日本科學(xué)家Yamanaka等首次將胚胎干細(xì)胞（ESC）富含的4個重要轉(zhuǎn)錄因子Oct4, Sox2, Klf4和 c-Myc（Yamanaka 因子） 通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染到小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中，成功誘導(dǎo)出一種具有分化潛能的細(xì)胞,因此命名為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPSC）[1]。隨著iPSC技術(shù)的推廣,從肝臟細(xì)胞，神經(jīng)元細(xì)胞，角質(zhì)細(xì)胞中成功誘導(dǎo)出iPSC[2]。心肌病是一類復(fù)雜疾病，終末期可以進(jìn)展為心臟衰竭，其具體分子機(jī)制尚不明確[3]。心肌病分子機(jī)制研究的一大瓶頸是建立體外細(xì)胞模型及獲取人源心肌組織，而動物模型又不能完全模擬人體的疾病狀態(tài)。通過將患者iPSC分化為心肌細(xì)胞，攜帶有患者全部遺傳信息，并在體外建立其相應(yīng)心肌病的細(xì)胞模型甚至心肌微組織，可以用于心肌病發(fā)病機(jī)制研究并作為藥物篩選的細(xì)胞平臺[4]。同時iPSC來源于自體細(xì)胞，在增殖分化潛能上有胚胎干細(xì)胞的特性，且獲取較為容易，也避免了直接研究胚胎干細(xì)胞帶來的倫理學(xué)問題[5]。在分化效率上，iPSC明顯優(yōu)于間充質(zhì)干細(xì)胞[6]。將iPSC誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞，這對心肌病致病機(jī)制的研究，尋找相應(yīng)的信號通路以及致病靶點都起到至關(guān)重要的作用，極大地促進(jìn)了心肌病基礎(chǔ)研究發(fā)展[7]。本文將重點討論iPSC在心肌病致病機(jī)制研究中的應(yīng)用以及臨床治療。

1 iPSC與心肌病基礎(chǔ)研究

心肌病是我國乃至全世界人群中重要的致死因素之一[8]。如限制型心肌病在年輕人中的發(fā)病率為1/500, 擴(kuò)張型心肌病每10萬人群中有40～50人患有該病[9]。心肌病主要分為原發(fā)性心肌病和獲得性心肌病，前者主要包括擴(kuò)張型心肌病、致心律失常性右心室心肌病、肥厚型心肌病、限制型心肌病等，其中有相當(dāng)一部分與遺傳突變相關(guān)；而后者有炎癥性心肌病[3]。此外，還有冠心病、瓣膜病等并發(fā)缺血性心肌病、瓣膜性心肌病等。

1.1 iPSC與擴(kuò)張型心肌病

擴(kuò)張型心肌病主要臨床特征為左心室擴(kuò)張，收縮功能障礙，并最終導(dǎo)致心力衰竭，在成人中的發(fā)病率約為1/2500[10]。最近研究發(fā)現(xiàn)，肌小節(jié)蛋白（Titin, TTN）的截短突變是導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病的重要原因，18%的散發(fā)性擴(kuò)張型心肌病和25%的家族性擴(kuò)張型心肌病是由TTN基因突變引起的[11]。Hinson等[12]通過提取擴(kuò)張型心肌病患者的外周血樣本單核細(xì)胞，在體外加入Yamanaka因子誘導(dǎo)得到iPSC；同時提取正常人外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)得到iPSC，并利用Crispa-Cas9技術(shù)定點進(jìn)行TTNtvs截短突變，通過病毒載體導(dǎo)入，利用Cas9作為核酸內(nèi)切酶在sgRNA （short guide RNA） 引導(dǎo)下在DNA分子中進(jìn)行剪切。將兩種來源的iPSC誘導(dǎo)分化形成心肌細(xì)胞并構(gòu)建心臟微組織。通過對其組織收縮力等心肌表型進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)含有截短突變的心臟微組織收縮力明顯下降，心肌組織肌小節(jié)分布紊亂。對攜帶突變的心臟微組織進(jìn)行牽拉刺激和異丙腎上腺素刺激，與對照組相比，突變組的收縮力也明顯下降，表明TTN突變導(dǎo)致異常的心肌應(yīng)激反應(yīng)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，突變型細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、纖維母細(xì)胞生長因子（FGF ）、上表皮生長因素（EGF）等生長因子表達(dá)下調(diào)，miR-1、miR-16和miR-124表達(dá)上調(diào)。研究表明TTN截短突變是導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病發(fā)生的原因，其可能通過降低部分生長因子表達(dá)水平，及心肌相關(guān)miRNA上調(diào)導(dǎo)致疾病的發(fā)生。在體外構(gòu)建攜帶致病突變的iPSC，使得能夠在細(xì)胞水平檢測相關(guān)因子的變化，為闡述該致病機(jī)制提供參考。

1.2 iPSC與致心律失常性右心室心肌病

致心律失常性右心室心肌病是一種橋粒蛋白突變相關(guān)的遺傳性疾病，其特征主要表現(xiàn)在右心室局灶性纖維脂肪替代及心肌細(xì)胞缺失并伴有室性心率失常，是導(dǎo)致青年人及運(yùn)動員猝死的重要原因之一[13]。超過50%患者攜帶橋粒蛋白基因的突變，最普遍的就是plakophilin-2 （PKP2）基因突變[14]。該病致病機(jī)制尚未闡明，主要原因有以下三方面：（1）由于致心律失常性右心室心肌病是慢性進(jìn)展性疾病，因此從早期獲得該病的心臟樣本幾乎是無法實現(xiàn)的；（2）對該病患者進(jìn)行心臟組織活檢有心臟穿孔的風(fēng)險，極大地限制了心肌樣本的獲?。唬?）該病動物模型病理特征與人有較大差異，其中最為顯著的是極少有脂肪浸潤[15]。iPSC技術(shù)很好地解決了這些難題，Kim等[16]將致心律失常性右心室心肌病患者（攜帶有橋?；騊KP2致病突變）的成纖維細(xì)胞重編程為心肌細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞表面橋粒基因表達(dá)下調(diào)，但并沒有出現(xiàn)明顯的脂肪形成或細(xì)胞凋亡。為了誘導(dǎo)其產(chǎn)生類似于人體的致心律失常性右心室心肌病特征性病理表型，研究者在心肌細(xì)胞中加入3F因子（包括胰島素，地塞米松，異丁甲基黃嘌呤），觀察到不顯著的脂肪形成和微弱的細(xì)胞凋亡；嘗試加入5F因子（包括胰島素，地塞米松，異丁甲基黃嘌呤，羅格列酮，吲哚美辛）后，發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯的脂肪形成和細(xì)胞凋亡。分析顯示PPAR-γ表達(dá)上調(diào)并檢測到其在核內(nèi)異常的印記。因此推測PPAR-γ在形成致心律失常性右心室心肌病病理表型中發(fā)揮重要的作用。研究者進(jìn)一步實驗證實加入PPAR-γ激動劑可致心肌細(xì)胞在體外發(fā)生顯著脂肪形成和細(xì)胞凋亡，從而揭示了PKP2突變導(dǎo)致致心律失常性右心室心肌病的致病機(jī)制。體外構(gòu)建的基于患者遺傳背景的iPSC模型能夠模擬致心律失常性右心室心肌病病理特征，并通過功能學(xué)研究探索出相關(guān)致病機(jī)制。

1.3 iPSC與肥厚型心肌病

肥厚型心肌病顯著病理特征是不明原因的左心室肥大，舒張期功能障礙，間質(zhì)纖維性增加，肌纖維紊亂，同樣可以導(dǎo)致心源性猝死或終末期心力衰竭[17]。肥厚型心肌病患者致病基因的發(fā)現(xiàn)加深了對于致病機(jī)理認(rèn)識[18]，但是肥厚型心肌病如何在不同基因突變下產(chǎn)生表型仍然未知[19]。Tanaka等[20]利用患者來源的iPSC誘導(dǎo)得到心肌細(xì)胞，致力于發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致肥厚型心肌病表型的共同通路。與不攜帶致病突變的野生型相比，攜帶突變的心肌細(xì)胞并未表現(xiàn)出明顯病理形態(tài)學(xué)特征型。然而內(nèi)皮素-1 （ET-1） 能加速心肌肥大，導(dǎo)致細(xì)胞纖維紊亂。進(jìn)一步研究揭示ET-1主要促進(jìn)活化T細(xì)胞核因子（NFAT）在核內(nèi)集聚從而促進(jìn)形成肥厚型心肌病表型。該項研究結(jié)果表明患者遺傳背景、環(huán)境因素以及ET-1共同促進(jìn)重編程心肌細(xì)胞產(chǎn)生肥厚型心肌病表型，這對于解析致病機(jī)制以及基因突變所致下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了重要的理論支持。

1.4 iPSC應(yīng)用于心肌病基礎(chǔ)研究的局限性

然而，需要指出的是iPSC誘導(dǎo)效率較低，鼠的iPSC誘導(dǎo)效率約為0.1%，而人iPSC誘導(dǎo)效率僅在0.01%左右，目前通過修改轉(zhuǎn)錄因子，加入microRNAs，小分子物質(zhì)等可將iPSC的誘導(dǎo)效率提高2～5倍[21]。但是iPSC誘導(dǎo)效率低仍是制約iPSC技術(shù)應(yīng)用于基礎(chǔ)研究的一大瓶頸。另一方面iPSC誘導(dǎo)分化所得到的心肌細(xì)胞通常在形態(tài)及生理功能方面都表現(xiàn)為胚胎期細(xì)胞未成熟狀態(tài)而不是成熟心肌細(xì)胞表型[22]。因此由于結(jié)構(gòu)和功能上與成熟心肌細(xì)胞之間的差異，在體外以iPSC誘導(dǎo)得到心肌細(xì)胞作為疾病模型的可靠性有待考究[16]。

2 iPSC與心肌病臨床研究

iPSC技術(shù)極大地促進(jìn)了疾病診斷及再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展[23]，同時為心肌病的治療提供了新的視野，并能在個體疾病水平上進(jìn)行研究。Ye等[24]以患有心肌梗死的豬為模型，移植人源性iPSC誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞，研究結(jié)果表明，注射在心肌梗死與正常組織交界區(qū)的人源性iPSC誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞產(chǎn)生完整的肌節(jié)結(jié)構(gòu)，并行使相應(yīng)的功能。細(xì)胞移植顯著減小了心肌梗死區(qū)面積，減輕了心室壁的壓力，并且增強(qiáng)了心肌代謝，改善了左心室功能。Zhang等[25]利用人源性心肌成纖維細(xì)胞制備iPSC并誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞，且將后者移植到小鼠心肌梗死交界區(qū)。在4周后，細(xì)胞凋亡減少，左心室收縮力明顯增強(qiáng)，心肌梗死癥狀明顯減輕。這些研究提示，人源性iPSC有希望于參與心臟損傷后的心肌修復(fù)。Shiba等[26]利用猴源成纖維細(xì)胞制備iPSC并誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞，該心肌細(xì)胞為HT4單體型，將其移植到HT4雜合型猴子心肌梗死交界區(qū)。在12周內(nèi)，未見到明顯的免疫排斥，且在移植后4～12周，心臟收縮功能明顯改善。

來自患者iPSC作為重要的心肌病藥物篩選模型在肥厚型心肌病、擴(kuò)張型心肌病等心肌病治療藥物的篩選取得了重大進(jìn)展[27]。研究表明， iPSC源性的心肌細(xì)胞模型在心肌病藥物研究中的重要作用并為進(jìn)一步的臨床試驗提供數(shù)據(jù)支持。

盡管iPSC對于再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展具有重大意義，但是這項技術(shù)應(yīng)用于臨床治療還有很多問題需要解決，如誘導(dǎo)效率低下，滿足不了臨床治療的細(xì)胞數(shù)量。研究表明，將iPSC源性心肌細(xì)胞在未純化的狀態(tài)下移植到小鼠心肌梗死的交界區(qū)，在一周后左心室出現(xiàn)團(tuán)塊，隨后該團(tuán)塊增長，免疫組化分析該團(tuán)塊為畸胎瘤[28]。這在很大程度上限制了這項技術(shù)在臨床上的應(yīng)用。此外，移植的iPSC源性心肌細(xì)胞與自體的心肌細(xì)胞整合程度不高，移植后的動物易出現(xiàn)心律失常[26]。因此，安全性問題也同樣掣肘iPSC應(yīng)用于臨床。

3 展望

iPSC技術(shù)為在體外研究疾病的分子病理機(jī)制提供了獨特的方法。在過去幾年，iPSC已應(yīng)用于多種心肌病的研究，構(gòu)建了多種心肌病體外iPSC模型，從而進(jìn)行遺傳變異與疾病表型相互作用的分析，獲得對于心肌病的新見解。將iPSC技術(shù)與基因編輯，全基因組技術(shù)等相結(jié)合是未來的發(fā)展方向，將使得iPSC成為生物醫(yī)學(xué)研究一個必不可少的工具。

目前iPSC技術(shù)在人心肌病治療中還未應(yīng)用于臨床。對心肌病的治療可能主要集中在兩方面：一方面，減輕心肌損傷和左心室的擴(kuò)張；另一方面，改善慢性心力衰竭患者心臟收縮能力。iPSC被認(rèn)為是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要資源，可作為研究疾病致病機(jī)制的細(xì)胞模型，并進(jìn)一步提供突變導(dǎo)致患者產(chǎn)生特殊疾病表型的功能驗證，以及評估疾病治療效果并為個體化醫(yī)療提供依據(jù)[29,30]。因此，iPSC技術(shù)對心肌病基礎(chǔ)研究與臨床治療都具有深遠(yuǎn)意義。盡管iPSC應(yīng)用仍存在限制，然而iPSC在基因水平上為心肌病研究提供了個體化治療的事實依據(jù)。

隨著iPSC在疾病模型，藥物篩選，細(xì)胞治療等研究方面的快速發(fā)展與應(yīng)用，iPSC將提供導(dǎo)致疾病發(fā)生的更全面的基礎(chǔ)與臨床信息。在不久的將來，iPSC將更進(jìn)一步地參與心肌病的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)應(yīng)用。

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2016-11-21）

(編輯:汪碧蓉)

CIFMS （2016-I2M-1-015）；國家自然科學(xué)基金 （NO 81670376）；PUMC青年基金；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費基金

100037 北京市，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 國家心血管病中心 阜外醫(yī)院 心血管疾病國家重點實驗室 心血管外科

李萌萌 碩士研究生 主要從事心肌病研究 Email:fw_lmm@163.com 通訊作者：宋江平 Email:fwsongjiangping@126.com

R541

A

1000-3614（2017）09-0934-03

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.09.026