谷俐媛，陶俊宇，曾 蕓，韋英益，胡庭俊*

(1廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧530005；2廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南寧530021)

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.10.06

辣蓼黃酮中蘆丁、槲皮素與槲皮苷的含量分析

谷俐媛1，陶俊宇2，曾 蕓1，韋英益1，胡庭俊1*

(1廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧530005；2廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南寧530021)

為保障辣蓼黃酮工業(yè)化生產(chǎn)中的質(zhì)量控制，建立辣蓼黃酮中蘆丁、槲皮素與槲皮苷含量測(cè)定高效液相色譜法。結(jié)果表明，運(yùn)用高效液相色譜法測(cè)定辣蓼黃酮乙酸乙酯部分(FEA)中蘆丁、槲皮苷與槲皮素的含量分別為281.97、160.98、83.31 mg/g，辣蓼黃酮正丁醇部分(FNB)中蘆丁、槲皮苷與槲皮素的含量分別為150.33、147.51、73.82 mg/g。該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、靈敏、重復(fù)性好，可作為辣蓼黃酮中蘆丁、槲皮素與槲皮苷含量分析的參考方法。

辣蓼；黃酮；高效液相色譜；含量分析

辣蓼，味辛、溫，具有祛風(fēng)利濕，散瘀止痛，解毒消腫，殺蟲止癢之功效[1]。張國英等采用聚酰胺柱層析的方法，從辣蓼中分離得到5個(gè)黃酮類化合物：金絲桃苷、蘆丁、槲皮素、異鼠李素、山奈酚[2]。現(xiàn)代科學(xué)研究表明，黃酮類化合物具有生物抗氧化性、清除自由基作用以及抗衰老的活性，能影響血管的脆性與通透性、改善血液循環(huán)狀態(tài)，凈化血液，有降血脂、降血壓、降血糖的作用，還有鎮(zhèn)痛、免疫、抗炎、抗菌等藥用保健功能[3]。

目前，用于黃酮類化合物檢測(cè)的方法包括分光光度法、薄層色譜法、超臨界流體色譜法、質(zhì)譜法、高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳法[4-9]。其中，分光光度法操作簡(jiǎn)單，但誤差較大。質(zhì)譜及其聯(lián)用技術(shù)所用儀器精密，但價(jià)格非常昂貴。薄層色譜法和毛細(xì)管電泳法在靈敏度和精確度方面都不如高效液相色譜法。因此，本研究選用進(jìn)樣量少，分辨效率高、靈敏度和準(zhǔn)確度高的高效液相色譜法作為測(cè)定辣蓼黃酮中蘆丁、槲皮素與槲皮苷含量的分析方法。高效液相色譜法(HPLC)應(yīng)用廣泛，已成為生命科學(xué)，臨床化學(xué)，藥物研究等方面的重要檢測(cè)方法[10]。HPLC法具有分離效能高，靈敏度高，重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)[11]。本試驗(yàn)運(yùn)用高效液相色譜法，以蘆丁、槲皮素與槲皮苷為對(duì)照品對(duì)辣蓼總黃酮進(jìn)行目標(biāo)成分含量測(cè)定，為獲得質(zhì)量穩(wěn)定含量均一的辣蓼總黃酮提供方法依據(jù)。

1 材 料

1.1 儀器與試劑 Waters 2695分離單元，Waters2998二極管陣列檢測(cè)器，Empower色譜工作站，超聲波清洗機(jī)(DTDN，寧波新芝生物科技有限公司)，純水儀(CD-UPT-1，成都純?cè)娇萍加邢薰?，微量離心機(jī)(TYPE1-14，SIGMA)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(ALPHA RA-8，Heidolph)，電熱恒溫干燥箱(DHG-9071A，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，乙腈(色譜純，TEDIA)，磷酸(色譜純，F(xiàn)isher)，甲醇(色譜純，TEDIA)，石油醚(分析純，西隴化工股份有限公司)，三氯甲烷(分析純，西隴化工股份有限公司)，無水乙醇(分析純，北京化工廠)，蘆丁對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院 100080-200707)，槲皮素對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院 100081-201408)，槲皮苷對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院 111538-200504)。

1.2 辣蓼黃酮 辣蓼生藥購自南寧市山草堂，經(jīng)酶解-超聲偶聯(lián)法提取后濾液經(jīng)過石油醚、氯仿、乙酸乙酯以及正丁醇萃取。收集乙酸乙酯與部分與正丁醇部分，經(jīng)XDA-8大孔吸附樹脂分離純化，得辣蓼黃酮乙酸乙酯部分(FEA)與辣蓼黃酮正丁醇部分(FNB)。FEA為淡黃色粉末，F(xiàn)NB為棕黃色粉末。

2 方 法

2.1 色譜條件 色譜柱為Waters XBridgeTM C18 (4.6 mm×250 mm 5 μm)；柱溫30 ℃；流速為1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為359 nm；流動(dòng)相：A相為乙腈，B相為0.3%磷酸水溶液，A∶B為(27∶73)等度洗脫。

2.2 供試樣品的制備 精密稱取0.1 g FNB與0.1 g FEA分別置于10 mL容量瓶中，加入流動(dòng)相至刻度線于37 ℃下超聲20 min充分溶解，補(bǔ)足失重后4 ℃保存。

2.3 對(duì)照品的制備 取蘆丁、槲皮素與槲皮苷對(duì)照品均精密稱定為3 mg，分別置于10 mL 量瓶中混合，用流動(dòng)相定容至刻度。取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液各1 mL置于5 mL容量瓶中并用用流動(dòng)相定容至刻度，此時(shí)蘆丁、槲皮素與槲皮苷質(zhì)量濃度為60 μg/ml。

2.4 專屬性試驗(yàn) 在“2.1”所述的液相色譜條件下注入對(duì)照品與樣品，記錄蘆丁、槲皮苷與槲皮素保留時(shí)間，計(jì)算分離度，理論塔板數(shù)。

2.5 線性關(guān)系與線性范圍 取“2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液配制成系列梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照液，按“2.1”項(xiàng)下所述色譜條件測(cè)定，記錄蘆丁、槲皮苷與槲皮素的峰面積。以混合對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸。

2.6 精密度試驗(yàn) 取“2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液按“2.1”項(xiàng)下所述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄蘆丁、槲皮苷與槲皮素的峰面積，計(jì)算RSD值。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取FEA與FNB6份，按“2.2”項(xiàng)下制備成供試樣品，按“2.1”項(xiàng)下所述色譜條件測(cè)定蘆丁、槲皮苷與槲皮素的峰面積，計(jì)算RSD值。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取FEA與FNB按“2.2”項(xiàng)下制備成供試樣品于室溫中放置0、2、4、6、8、10、12 h，按“2.1”項(xiàng)下所述色譜條件測(cè)定蘆丁、槲皮苷與槲皮素的峰面積，計(jì)算RSD值。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批已知含量的FEA與FNB，并加入一定含量的對(duì)照品，按“2.2”項(xiàng)下制備成供試樣品，按“2.1”項(xiàng)下所述色譜條件測(cè)定蘆丁、槲皮苷與槲皮素的峰面積。計(jì)算蘆丁、槲皮苷與槲皮素的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1～表4。由表中結(jié)果可知，用本方法檢測(cè)辣蓼黃酮中蘆丁、槲皮苷與槲皮素含量時(shí)對(duì)目標(biāo)成分的損耗低，回收率在97%～99%之間。

2.10 樣品測(cè)定 取不同批次的FEA與FNB每批次樣品取3份，按“2.2”項(xiàng)下制備成供試樣品，按“2.1”項(xiàng)下所述色譜條件測(cè)定蘆丁、槲皮苷與槲皮素的峰面積。計(jì)算蘆丁、槲皮苷與槲皮素的含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 回歸方程與線性關(guān)系 以各標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)建立回歸方程，如圖1所示。蘆丁：Y=381177X-4828.4，R2=0.9999，槲皮苷:Y=823682X-665955，R2=0.9998，槲皮素:Y=659877X-442376，R2=0.9999。結(jié)果表明蘆丁在進(jìn)樣量在10～100 μg/mL，槲皮苷在進(jìn)樣量在10～100 μg/mL，槲皮素在20～200 μg/mL內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。在“2.1”所述的液相色譜條件下，蘆丁、槲皮苷與槲皮素保留時(shí)間分別為7.9、11.9和26.5 min，各峰分離度大于1.5，理論塔板數(shù)大于3000。供試樣品相同的保留時(shí)間處無雜峰干擾，表明方法專屬性良好。色譜圖如圖2～圖6所示。

3.2 精密度試驗(yàn) 結(jié)果顯示蘆丁、槲皮苷與槲皮素的RSD值分別為0.12%、0.45%和0.25%，精密度符合獸藥典要求。

3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 按重復(fù)性實(shí)驗(yàn)要求，結(jié)果顯示： 蘆丁、槲皮苷與槲皮素的RSD值分別為1.10%、1.02%和1.03%，F(xiàn)NB的RSD值分別為0.68%、1.19%和0.61%。

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 結(jié)果顯示：FEA的RSD值分別為0.41%、0.17%和0.52%，得FNB的RSD值分別為0.41%、0.78 %和0.93%，表明供試品室溫內(nèi)放置12 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.5 加樣回收率試驗(yàn) 結(jié)果見表1～表3。由表中結(jié)果可知，用本方法檢測(cè)辣蓼黃酮中蘆丁、槲皮苷與槲皮素含量時(shí)對(duì)目標(biāo)成分的損耗低，回收率在97%～99%之間。

3.6 樣品測(cè)定 對(duì)不同批次，不同提取物的樣品進(jìn)行含量檢測(cè)，結(jié)果如表4，結(jié)果顯示為FEA中蘆丁、槲皮苷與槲皮素的含量分別為281.97、160.98、83.31 mg/g，F(xiàn)NB中蘆丁、槲皮苷與槲皮素的含量分別為150.33、147.51、73.82 mg/g。

4 討論與小結(jié)

前人研究表明，辣蓼中所含黃酮成分有蘆丁、槲皮苷、槲皮素、金絲桃苷、異鼠李素與山柰酚。蘆丁能對(duì)糖尿病大鼠的氧化應(yīng)激損傷，降低尿中蛋白含量[12]。蘆丁與槲皮素在小鼠模型中顯示出明顯的抗驚厥作用[13]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)槲皮苷、蘆丁、槲皮素與山柰酚為辣蓼中含量最多的黃酮[14]。所以本試驗(yàn)選取3者為指標(biāo)物質(zhì)對(duì)FEA、FNB相應(yīng)成分進(jìn)行含量檢測(cè)。

在前期試驗(yàn)中曾經(jīng)考察過用甲醇與0.3%磷酸水溶液進(jìn)行洗脫，但槲皮素的色譜峰會(huì)出現(xiàn)拖尾，于是選用乙腈與0.3%磷酸水溶液作為流動(dòng)相，測(cè)得蘆丁、槲皮苷與槲皮素的峰形較好，各組分在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。在精密度試驗(yàn)中，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)都小于1%，說明該方法精密度高，是可靠的。

運(yùn)用高效液相色譜法測(cè)定FEA中蘆丁、槲皮苷與槲皮素的含量分別為281.97、160.98、83.31 mg/g，F(xiàn)NB中蘆丁、槲皮苷與槲皮素的含量分別為150.33、147.51、73.82 mg/g，本試驗(yàn)所測(cè)的蘆丁、槲皮素與槲皮苷與Zhao F P[15]研究結(jié)果相一致。本研究運(yùn)用的高效液相色譜檢測(cè)辣蓼黃酮中蘆丁、槲皮素與槲皮苷含量的方法，峰型對(duì)稱性較好，回收率高，且操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，精密度、重復(fù)性好，可以用于辣蓼黃酮中蘆丁、槲皮素與槲皮苷的含量分析。

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DeterminationofContentsofRutin,QuercetinandQuercitrininFlavonoidsfromPolygonumhydropiper

GU Li-yuan1, TAO Jun-yu2, ZENG Yun1, WEI Ying-yi1, HU Ting-jun1*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，GuangxiUniversity，Nanning，Guangxi530005,China; 2.SchoolofPreclinicalMedicine,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

HUTing-jun,E-mail:tingjunhu@126.com

The flavonoids ofPolygonumhydropiperwere separated and purified by means of macroporous adsorption resin, and its antioxidant activity was tested in previous research, which gained satisfied results. In order to obtain flavonoids ofPolygonumhydropipewith stable quality, and provide evidence for quality control in industrial production, high performance liquid chromatography for determination of total flavonoids inPolygonumhydropiperwas used with rutin, quercetin and quercitrin as reference substance. The results showed that the contents of rutin, quercetin and quercitrin from flavonoids ethyl acetate (FEA) inPolygonumhydropipewere 281.97, 160.98, 83.31 mg/g respectively; The contents of rutin, quercetin and quercitrin of flavonoids n-butanol (FNB) in polygonum hydropiper were 150.33, 147.51, 73.82 mg/g respectively. The method demonstrated advantage of simply,accuraty and sensitivity, and successfully applied to the analysis of rutin, quercetin and quercitrin content in flavonoids fromPolygonumhydropipe.

Polygonumhydropipe; flavonoids; high performance liquid chromatography

2017-06-26

A

1002-1280 (2017) 10-0039-07

S853.7

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31560708); 廣西大學(xué)獸醫(yī)學(xué)研究生培養(yǎng)基地建設(shè)項(xiàng)目(20160976)

谷俐媛，碩士研究生，從事獸醫(yī)藥理與毒理學(xué)方向研究。

胡庭俊。E-mail:tingjunhu@126.com.

(編輯：陳希)