劉善菁，劉雨昕，陸桂萍，曲 斌，耿士偉

(江蘇省畜產(chǎn)品質(zhì)量檢驗測試中心，南京 210036)

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.10.05

液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜測定 雞蛋及雞肉中氟蟲腈及其代謝物殘留的研究

劉善菁，劉雨昕，陸桂萍，曲 斌，耿士偉

(江蘇省畜產(chǎn)品質(zhì)量檢驗測試中心，南京 210036)

建立了一種測定雞蛋與雞肉中氟蟲腈及其3種代謝物(氟甲腈、氟蟲腈硫醚及氟蟲腈砜)的液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜方法。樣品經(jīng)提取和鹽析后，PRiME HLB凈化柱快速凈化，液相色譜分離后，四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜準確定性并定量，平行反應監(jiān)測模式檢測。4種待測組分均獲得足夠的色譜保留和分離，各藥物在 0.1～5.0 μg/kg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系，日內(nèi)日間精密度小于20 %，方法回收率在75%～115 %之間，方法的定量限為0.1 μg/kg。此方法快速、準確且靈敏度高，為目前國際上爆發(fā)的“毒雞蛋”事件提供了準確有效的技術手段。

氟蟲腈及其代謝物；雞蛋；雞肉；液相色譜-高分辨質(zhì)譜

氟蟲腈(Fipronil，商品名：銳勁特；又名：芬普尼)是一種苯基吡唑類的廣譜殺蟲劑[1]，由法國羅納-普朗克公司研發(fā)[2]，作用于昆蟲的γ-氨基丁酸受體，干擾昆蟲中樞神經(jīng)，引起昆蟲神經(jīng)和肌肉過度興奮直至死亡，從而起到殺蟲作用。1994年，氟蟲腈進入中國市場[3]。研究表明，氟蟲腈對甲殼類水生生物和蜜蜂風險極高[3]；在對人體毒性方面，溫州某醫(yī)院曾有過2例關于氟蟲腈急性中毒的病患報道，患者出現(xiàn)四肢抽搐、精神異常、胡言亂語、狂躁等中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮癥狀[4]。近日，歐洲各國出現(xiàn)被氟蟲腈污染的“毒雞蛋”新聞又一次把它推上了風口浪尖。歐盟395/2005號法規(guī)[5]以及1127/2014補充條例[6]中，明確規(guī)定了各種農(nóng)作物、畜禽產(chǎn)品及其制品(包括肉、蛋、奶、蜂蜜等)中氟蟲腈的最大殘留限量，其中雞蛋的限量為0.005 mg/kg。日本的肯定列表也對此有明確規(guī)定。我國于2009年發(fā)布農(nóng)業(yè)部1157號公告[7]：除衛(wèi)生用、部分旱田種子包衣劑外，在中國境內(nèi)停止銷售和使用用于其他方面的含氟蟲腈成分的農(nóng)藥制劑。食品安全國家標準GB2763-2016[8]對谷物、油料和油脂、蔬菜、水果、糖料和食用菌6項農(nóng)作物中氟蟲腈的殘留量進行了規(guī)定，最大殘留限量為0.02 mg/kg。對畜禽產(chǎn)品中的氟蟲腈最大殘留限量沒有明確規(guī)定；亦沒有涉及畜禽產(chǎn)品中氟蟲腈殘留檢測方法的國家標準。我國雖已嚴格禁用氟蟲腈，但在相關限量規(guī)定及檢測標準的跟進上有一定滯后。氟蟲腈在動物、植物、環(huán)境中會代謝生成與氟蟲腈相當或毒性更高的砜化物或亞砜化合物[1]，根據(jù)GB2763-2016和歐盟法規(guī)中規(guī)定，食品中氟蟲腈的殘留量以氟蟲腈及其3種代謝物(氟甲腈(MB46513)、氟蟲腈硫醚(MB45950)、氟蟲腈砜(MB46136))之和計算。

目前，關于氟蟲腈及其代謝物的檢測方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法[9-11]、液相色譜法[12]和液相色譜-質(zhì)譜法[13-14]，但是,這些方法主要針對的是蔬菜水果或者環(huán)境水體中的氟蟲腈及其代謝物殘留檢測，Meiyu Zhang等于2016年針對雞蛋和雞肉中的氟蟲腈殘留建立了LC-MS/MS分析方法，但僅涉及氟蟲腈原形藥物，未涉及其代謝物的分析。本研究建立了一種高效簡便的分析雞蛋與雞肉中氟蟲腈及其代謝物殘留的液質(zhì)聯(lián)用方法，前處理簡單快速、方法靈敏度高，適合高通量樣品的檢測分析。

1 材料與方法

1.1 儀器 Thermo Q-ExtractiveTM液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀，含高壓二元泵、自動進樣器、柱溫箱、四極桿-靜電場軌道阱質(zhì)量分析器、Xcalibur 3.1數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)；Sigma 3K30 冷凍離心機，Sartorius公司；Heraeus Multifuge X1R離心機，Thermo公司；MS3 basic 渦旋儀，IKA公司；KS501 振蕩器，IKA公司；N-EVAPTM112 氮吹儀，Organomation公司；LINK BLOW 氮氣發(fā)生器，金浪科技有限公司。

1.2 試劑與材料 甲醇、乙腈，色譜純，Merck公司；乙腈，分析純，南京化學試劑有限公司；甲酸，LC-MS級，F(xiàn)isher公司；純凈水，自制。固相萃取凈化柱(PRiME HLB，60mg/3mL)，Waters公司。

標準品純度及來源：氟蟲腈(Fipronil，99.2%，Dr.Ehrenstorfer)、氟甲腈(Fipronil-desulfinyl，101 μg/mL(±3%)，北京曼哈格生物科技有限公司)、氟蟲腈硫醚(Fipronil-sulfide，99.0%，Dr.Ehrenstorfer)、氟蟲腈砜(Fipronil-sulfone，98.2%，Dr.Ehrenstorfer)。

1.3 標準溶液的配制 取氟蟲腈、氟蟲腈硫醚、氟蟲腈砜標準品各適量，精密稱定，用乙腈溶解并定容于100 mL容量瓶中，制成100 μg/mL的標準儲備液；精密量取氟甲腈標準品1 mL于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配置成1 μg/mL的標準儲備液，4 ℃冷藏保存。臨用前用定容溶液逐級稀釋成標準工作溶液。

1.4 樣品前處理 稱取2 g(精確至0.01 g)樣品于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋使之充分混合，振蕩提取30 min，4 ℃下10000 r/min離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)移至含有1 g NaCl和2 g無水硫酸鎂的15 mL離心管中，搖勻，4 ℃下5000 r/min離心3 min。移取約5 mL上清液，備用固相萃取凈化。

PRiME HLB固相萃取柱凈化：取5 mL上清液上樣，棄去初始約1 mL初濾液，收集續(xù)濾液，精密移取2.5 mL續(xù)濾液于氮吹管中，50 ℃水浴下氮氣流吹干，用1 mL乙腈∶0.1%甲酸(50∶50,V/V)溶液復溶溶解殘渣，超聲15 min，渦旋1 min，過0.22 μm微孔濾膜，待測。

1.5 液相色譜-質(zhì)譜條件

1.5.1 色譜條件 色譜柱：Waters BEH C18柱(2.1×100 mm，1.7 μm)。流動相A：0.1%甲酸，流動相B：乙腈(含0.1 %甲酸，V/V)，梯度洗脫條件見表1。流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

1.5.2 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜分析采用PRM(平行反應監(jiān)測模式，parallel reaction monitoring, PRM)模式。測試前使用Thermo Pierce負離子校正液在m/z為265.14790、514.28440、1279.99721、1379.99083、1479.98444、1579.97805、1679.97166、1779.96528處校正，校正有效期維持在3 d內(nèi)。質(zhì)譜參數(shù)：噴霧電壓：-4500 V，霧化氣：40 L/h，輔助氣：15 L/h，離子傳輸溫度：350 ℃，輔助加熱溫度：400 ℃。分辨率：17500 FMWH@m/z200，AGC target：5×104，C-trap最大注入時間：50 ms。目標物及其定量子離子的精確質(zhì)量數(shù)見表2。

2 結果與分析

2.1 方法專屬性 空白雞蛋及雞肉、陽性添加的空白雞蛋及雞肉樣品用于評價方法的專屬性。結果表明，空白雞蛋及雞肉樣品中不含干擾測定的物質(zhì)；而在陽性添加樣品中，4種目標化合物保留時間在5.0～6.0 min之間，且峰形良好。標準溶液、空白雞蛋及雞蛋中陽性添加(添加量為1 μg /kg)色譜圖見圖1。同時獲得了氟蟲腈及其3種代謝物的子離子掃描圖(圖2)，在定量測定的同時，可以和標準品圖譜比對，進行定性判定。

2.2 基質(zhì)效應 質(zhì)譜分析過程中，樣品基質(zhì)中的干擾組分會對目標待測物產(chǎn)生影響，從而產(chǎn)生基質(zhì)增強或基質(zhì)抑制效應。本研究中評價基質(zhì)效應的方法是：基質(zhì)效應=空白基質(zhì)配制標準響應值/溶劑配制標準響應值×100%。當基質(zhì)效應在80%～120%之間時，可用標準曲線定量，當基質(zhì)效應<80%，為基質(zhì)抑制效應，當基質(zhì)效應>120%時，為基質(zhì)增強效應，此時可考慮用基質(zhì)標準曲線定量。

本研究在0.1 μg/kg(LOQ)、0.2 μg/kg(2LOQ)和1.0 μg/kg(10LOQ)3個加標水平上分別考察了雞蛋和雞肉中氟蟲腈及其3種代謝物的基質(zhì)效應。結果如表3所示。表中數(shù)據(jù)表明，氟蟲腈和氟蟲腈砜受基質(zhì)干擾較弱，而氟甲腈和氟蟲腈硫醚受到的基質(zhì)干擾作用較強；氟蟲腈的基質(zhì)效應在80%～120%之間，而它的3種代謝物在1個或多個水平上基質(zhì)效應<80%，因此，為了更為準確的定量，本研究中分別采用空白雞蛋和空白雞肉的基質(zhì)標準曲線進行定量。

2.3 標準曲線及線性范圍 準確稱取空白雞蛋及雞肉樣品各2 g，分別置于50 mL聚丙烯塑料離心管中，按樣品前處理步驟處理得到空白基質(zhì)液，分別加入混合標準溶液適量，制成一系列的基質(zhì)標準曲線，進行LC-HRMS測定。以試樣的藥物添加濃度為橫坐標，以目標化合物峰面積為縱坐標，進行標準曲線的繪制。按信噪比(S/N)為3確定檢測限(LOD)，按S/N為10確定定量限(LOQ)。雞蛋及雞肉中各化合物的線性范圍、回歸方程、相關系數(shù)以及方法靈敏度參數(shù)見表4。

2.4 精密度與回收率 分別稱量雞蛋及雞肉的空白樣品，進行氟蟲腈及其3種代謝物的1倍LOQ、2倍LOQ和10倍LOQ這三個濃度的加標回收實驗，并且在每個濃度水平進行5次平行實驗，分別考察3 d，根據(jù)檢測結果計算回收率，并用相對標準偏差值(relative standard deviation，RSD，%)評價日內(nèi)和日間精密度，雞蛋及雞肉中氟蟲腈及其代謝物檢測結果見表5。

從表5可以發(fā)現(xiàn)，在低、中、高3個濃度，雞蛋及雞肉中氟蟲腈及其3種代謝物的回收率均在75%～115%之間，日內(nèi)、日間精密度均小于20%。

3 討論與小結

3.1 液相色譜柱與流動相的選擇和優(yōu)化 根據(jù)氟蟲腈及其3種代謝物的化學結構，采用常規(guī)的C18柱即可有效分離，本研究中采用1.7 μm粒徑C18柱，柱效高，分離速度快；流動相體系采用乙腈-0.1%甲酸水溶液，乙腈黏度較小，可以有效降低色譜體系壓力，對設備起到一定的保護作用，實際分析過程中發(fā)現(xiàn)，4種待測物極性較小，保留較強，需要較高比例的有機相才能洗脫，在初始流動相設置為50%時，4種待測物在5～6 min內(nèi)逐步洗脫，并且均獲得良好的峰形。本研究中采用乙腈和低濃度甲酸水溶液作為流動相，檢測靈敏度可以達到0.1 μg/kg，在保證靈敏度的前提下獲得很好的色譜保留和分離效果。

3.2 平行反應監(jiān)測模式的選擇 本研究選用近年推出的具有快速二級質(zhì)譜功能的高分辨質(zhì)譜：四極桿-靜電場軌道阱質(zhì)譜(quadrupole-Orbitrap，Q-Orbitrap)作為檢測器，選擇其中的PRM模式(平行反應監(jiān)測模式)進行定性定量，PRM是相對于傳統(tǒng)的MRM(多反應監(jiān)測模式)建立起來的高分辨子離子監(jiān)測技術，屬于靶向MS/MS分析，和MRM只監(jiān)測目標離子對的模式不同，PRM在整個液相分離過程中會在給定電壓下不斷地對每一個目標母離子的全部碎片離子圖譜進行記錄，而且是全部高分辨/高質(zhì)量精度子離子。和經(jīng)典的MRM方法相比，PRM提供更高的專屬性，因為它在高分辨的模式下監(jiān)測子離子，很少受到干擾離子的影響，因而，PRM具有方法開發(fā)的潛在優(yōu)勢。

根據(jù)歐盟2002/657/EC[15]規(guī)定，當使用低分辨質(zhì)譜進行殘留分析時，要求LC-MS/MS在定性上提供一個母離子和兩個子離子，才能滿足法規(guī)中的“4分要求”；但是，部分化合物在復雜基質(zhì)中不易同時產(chǎn)生兩個子離子碎片，而使用高分辨質(zhì)譜對化合物進行定性確證時，一個母離子2分，一個子離子2.5分，本研究在PRM模式下選擇一個母離子和一個子離子進行定性和定量分析，超過歐盟的4分規(guī)定，并且方法抗干擾能力強，定性定量結果準確可靠。

3.3 離子檢測參數(shù)的選擇及定量子離子的確定 氟蟲腈及其3種代謝物化學結構中均含有-NH2等電負性較強的基團，因此在負離子模式下易失去H得到[M-H]-峰，在本研究中，采用蠕動注射泵將100 ng/mL的標準溶液注射入離子源，在負離子模式下分別進行了一級全掃描和二級質(zhì)譜掃描，通過手動調(diào)節(jié)碰撞能量，獲得不同碰撞能量下的子離子掃描圖，選擇母離子的豐度比約為5%時的碰撞能量作為實際測試用碰撞能量，選擇此碰撞能量下豐度最大的子離子作為定量子離子，本研究中的4種目標化合物，均在HCD電壓為20 eV時獲得較為理想的子離子信息。

3.4 樣品前處理方法的選擇和優(yōu)化

3.4.1 鹽的選擇 本研究中考察了不同用量的氯化鈉和無水硫酸鎂對提取效果的影響。分別取陰性雞蛋和雞肉樣品，在加標水平為1.0 μg/kg考察。結果表明，不加鹽時，氟蟲腈及其3種代謝物的回收率在25%～40%之間。而分別加入氯化鈉和無水硫酸鎂時，待測組分的回收率有了明顯提高，結果如圖3、圖4所示。圖表數(shù)據(jù)表明氯化鈉和無水硫酸鎂可以有效改變提取液中離子強度并起到除雜作用，提高4種待測物回收率，其中氯化鈉提高效率略明顯一些；但只加氯化鈉時，提取液中殘余的水分會延長氮吹時間，因此，考察氯化鈉和無水硫酸鎂作為復合鹽析試劑時的回收率情況，結果見表6。結果表明，氯化鈉的加入量對目標化合物的回收率影響不大，而當氯化鈉的量恒定時，無水硫酸鎂加入量由1.0 g 增加到2.0 g時，4種化合物的回收率均有一定提高，說明此時無水硫酸鎂可起到除雜凈化的作用，減弱基質(zhì)抑制；但當無水硫酸鎂的量繼續(xù)增加至3.0 g，部分目標化合物的回收率有所下降，說明此時在復合鹽析試劑的共同作用下，吸附作用開始逐漸占優(yōu)。綜合考慮實驗成本和回收率因素，最終選擇1.0 g氯化鈉和2.0 g無水硫酸鈉對樣品進行進化。

3.4.2 固相萃取方法的選擇與比較 本研究中涉及的雞蛋和雞肉兩種基質(zhì)，其中脂肪和蛋白含量較高，僅用乙腈提取和鹽析方法凈化樣品，對樣品的凈化程度不夠，不僅會對目標物產(chǎn)生干擾，同時也對色譜及質(zhì)譜系統(tǒng)有一定損傷。常用的固相萃取方法一般需經(jīng)過活化、上樣、洗脫3個步驟，整個流程時間較長，對于脂肪含量較高的基質(zhì)更是容易產(chǎn)生柱孔隙堵塞的現(xiàn)象。

本研究比較了不經(jīng)固相萃取、經(jīng)HLB柱凈化和PRiME HLB柱凈化3種方式的凈化效果。具體操作過程如下：分別取陰性雞蛋和雞肉樣品，在1.0 μg/kg水平下進行回收率考察。①不經(jīng)固相萃?。喊礃悠非疤幚眄椫幸译嫣崛?，鹽析步驟操作后，精密移取2.5 mL上清液，50 ℃水浴下氮氣流吹干，1 mL復溶液溶解復溶，過膜進樣；②HLB柱凈化：按樣品前處理項中乙腈提取、鹽析、離心后，精密移取2.5 mL上清液，加入8 mL水，混勻，作為固相萃取備用液。HLB小柱分別用3 mL甲醇、3 mL水活化后上樣，3 mL水淋洗，5 mL甲醇洗脫并收集，50 ℃水浴下氮氣流吹干，1 mL復溶液溶解復溶，過膜進樣；③PRiME HLB柱凈化：按樣品前處理項下操作。具體結果見圖5、圖6所示。

結果表明，經(jīng)固相萃取方法凈化的樣品回收率明顯優(yōu)于不經(jīng)固相萃取方法凈化的樣品，并且方法的平行性及精密度較鹽析方法有較明顯的提高；而經(jīng)PRiME HLB小柱進化的樣品，4種待測物回收率較HLB小柱凈化的更高，這與凈化過程的方式有關，PRiME柱的凈化方式在快速凈化的同時盡可能避免了損失，這種前處理方式無需活化和洗脫過程，上樣量小，速度快，整個凈化過程僅需5 min完成，能夠有效除去樣品中超過90%的磷脂和脂肪組分，最終回收率理想，基質(zhì)干擾在可以接受的范圍內(nèi)，大大縮短了前處理時間，適合大批量樣品的篩查工作。

本研究建立了雞蛋及雞肉中氟蟲腈及其代謝物(氟甲腈、氟蟲腈硫醚和氟蟲腈砜)LC-HRMS檢測方法，樣品經(jīng)提取、鹽析、PRiME HLB柱固相萃取凈化，LC-Q-Orbitrap MS測定，PRM模式檢測，本方法靈敏度高、專屬性強，簡便、高效，適用于雞蛋及雞肉中氟蟲腈及其代謝物的快速篩查、定性篩選和定量測定。

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A method was established for the determination of fipronil and its metabolites (fipronil-desulfiny, fipronil sulfide and fipronil sulfone) residues in chicken egg and muscle by LC-quadrupole-Orbitrap MS. Chicken egg and muscle samples was exacted with acetonitrile, salted out by sodium chloride and anhydrous magnesium sulfate. Then the supernatant was quickly purified by PRiME HLB solid phase extraction prior to analysis by LC-HRMS. The matrix-matched calibration curve showed a good linear within the concentration range from 0.1 to 5.0 μg/kg. The average recoveries of fipronil and its metabolites at 3 levels of 0.1, 0.2 and 1.0 μg/kg ranged from 75% to 115%, and the relative standard deviations were less than 20%. The method was rapid and high sensitive, which provided an accurate and effective solution for the international incident of “poisonous eggs”.

fipronil and its metabolites; chicken egg; chicken muscle; LC-quadrupole-Orbitrap MS

2017-08-24

A

1002-1280 (2017) 10-0029-10

S859.84

劉善菁，理學碩士，從事獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗檢測新技術新方法的研究。E-mail: liushanjing_1990@163.com

DeterminationofFipronilandItsMetabolitesResiduesinChickenEggandMusclebyLiquidChromatographyQuadrupole-orbitrap-highResolutionMassSpectrometry

LIU Shan-jing, LIU Yu-xin, LU Gui-ping, QU Bin, GENG Shi-wei

(JiangsuQualityInspectionandTestingCenterforAnimalProducts,Nanjing210036,China)

(編輯：侯向輝)