侯 露 張 娟 彭曉蔓 劉朝奇

(三峽大學醫(yī)學院，宜昌443002)

營養(yǎng)與免疫干預的非酒精性脂肪性肝病動物模型研究進展①

侯 露 張 娟 彭曉蔓 劉朝奇

(三峽大學醫(yī)學院，宜昌443002)

隨著人們生活水平的不斷提高，生活習慣和環(huán)境等多種因素的改變，非酒精性脂肪性肝病(Nonal-coholic fatty liver disease,NAFLD)的發(fā)病率逐年升高，發(fā)病年齡也越來越年輕化，除中老年人以外，年輕人也成為發(fā)病的高危人群；非酒精性脂肪肝已嚴重威脅著人類的公共健康。進行 NAFLD 的發(fā)病機制和防治基礎研究，都需要一種理想的實驗動物模型。本文通過查閱文獻資料，對目前廣泛研究及前沿性的NAFLD多種動物模型的研究進行綜述，為研究防治 NAFLD 提供基礎理論依據。

NAFLD是一種無過量飲酒史的以肝實質細胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合征，疾病譜隨病程的進展而表現不一，包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis,NASH)、肝硬化甚至肝細胞癌，是導致慢性肝病最常見的原因[1]。隨著人們飲食結構、生活方式的改變，NAFLD的發(fā)病率大幅上升。NAFLD和代謝綜合征關系密切，NAFLD是代謝綜合征的肝臟表現。同時，在2型糖尿病(Diabetes mellitus,DM)患者中NAFLD的患病率高達75%，己成為危害人類健康最常見的肝病[2]。因此，NAFLD及伴隨代謝性疾病的高發(fā)病率己成為全球關注的醫(yī)學研究熱點。

NAFLD的分子機制尚未清楚，可能的機制是“二次打擊”學說。其假說是第一次打擊涉及肝細胞內脂類的積累(脂肪變性)，從而激活免疫細胞；二次打擊涉及肝臟炎癥，導致NASH和其他嚴重的表現，而炎癥反應是NAFLD及代謝綜合征的共有特征。

肝臟是天然免疫系統(tǒng)的重要部位，它有各種各樣的免疫細胞，如淋巴細胞、 Kupffer細胞、巨噬細胞、自然殺傷(NK)細胞和NKT細胞。肝臟也合成參與天然免疫的多種急性期蛋白、補體因子及模式識別受體(PRRs)，調節(jié)機體的免疫反應。游離脂肪酸水平升高，氧化損傷，肝實質細胞的死亡，腸通透性改變都能激發(fā)肝臟相應部位的免疫反應；Kupffer細胞、樹突狀細胞、T細胞、NK細胞等免疫細胞激活，釋放出細胞因子刺激肝臟星狀細胞，從而啟動了組織纖維化修復反應，促進了NAFLD的發(fā)生和發(fā)展。 由組織損傷誘導的NAFLD激活了大量免疫細胞，導致非酒精性的脂肪性肝炎，進一步會導致肝纖維化、肝硬化、肝細胞癌等疾病的發(fā)展,同時也與心血管疾病的風險增加有關[3]。

為了研究NAFLD的發(fā)生發(fā)展機制，各種動物模型已廣泛應用，一方面從高營養(yǎng)引起代謝紊亂制作模型即營養(yǎng)模型，是國內學者研究較多的造模方法，但存在造模周期長，成本高，不符合臨床特征等缺點。越來越多的研究者通過基因操作方法建立NAFLD模型，也是當下研究的熱門，尤其是對免疫細胞相關基因進行敲除或過表達，改變肝臟免疫細胞的功能，同時進行營養(yǎng)干預，使造模的準確度和效率可明顯提升即免疫缺陷聯合營養(yǎng)模型，對此我們分別對如下兩個方面進行綜述。

1 營養(yǎng)誘導NAFLD模型

代謝綜合征是NAFLD的前驅癥狀和誘導因素，因此通過飲食干預導致代謝紊亂誘導NAFLD模型是目前最為常見的動物模型，其主要原理是通過攝入過多熱量，引起肥胖，導致肝細胞脂肪變性。

1.1 高脂飲食 脂肪提供總能量的比例為45%～75%。高脂飲食是造成代謝綜合征的直接且有效的方式，誘導的模型在病因、病理及發(fā)病背景方面與人類 NAFLD 發(fā)病機制最相似。該模型具有肥胖、高脂血癥、胰島素抵抗等代謝綜合征表現，鏡下可見大細胞性脂肪變性、肝小葉炎癥、氣球樣變性、纖維化、Mallory 小體。流行病學研究發(fā)現，肥胖和糖尿病是非酒精性脂肪性肝炎和肝細胞癌發(fā)展的獨立危險因素。高脂模型(脂肪、碳水化合物和蛋白質提供總能量的比例分別為71%、11%和18%)在生化方面較高程度地模擬了人NASH。有研究顯示模型產生了氧化應激及重要致炎因子TNF-α表達增強。當然，模型的缺點是許多NASH所具有的病理形態(tài)特點不明顯，如炎癥病灶較分離，脂肪變性的程度較輕，最重要的是無法觀察到肝組織的纖維化。Xu等[4]改良了模型飲食的成分與方法，采取豬油與膽固醇飲食，在第4周出現肝脂肪變性，第12～48周檢測到肝炎變現，具有一定效果，在第24周可觀察到明顯的肝竇周纖維化。

缺乏肝纖維化表現和造模時間長是目前此模型面臨的最大挑戰(zhàn)。采取胃內插管，顯著改善了高脂食物的攝取率及利用率，采用這種方法，模型會出現一系列癥狀，如高血糖、高胰島素血癥、高瘦素血癥、葡萄糖耐受不良以及胰島素抵抗。但組織病理學分析顯示肝臟僅有輕度的脂肪變性。加入反式脂肪，模型的病理變化與人NASH的特征有更多的相似之處，極大地提高了病理水平的模擬度。但此類模型存在一大缺點：從飲食攝入方式的角度來說，乳劑完全由人工直接灌入胃中，因而在臨床和病因學方面模擬程度差?？偟膩碇v，在嚙齒動物中高脂肪飲食可以很好地復制代謝參數的改變來觀察人類脂肪肝,但肝臟病理結果并不是那么嚴重[5]。值得注意的是，Kohli等[6]在高脂肪飲食中加入一定比例的碳水化合物，喂養(yǎng)的小鼠肝臟氧化應激增強,肝組織巨噬細胞浸潤、纖維化的發(fā)展也都明顯優(yōu)于單純的高脂飲食建模的小鼠。隨后，飲食中加入果糖運用類似的模式獲得肝細胞損傷、炎癥和纖維化的NASH的小鼠模型也被報道[7]。

1.2 果糖飲食 果糖不同于葡萄糖，它分布于全身的組織并被廣泛利用，果糖主要在肝臟代謝，并且它能促進氧化損傷和脂質過氧化。一方面，其中的不飽和脂質氧化降解為炎癥部位的各種介質。另一方面脂質過氧化反應的最終產物是4-羥基壬烯酸(4-hydroxynonenal，4-HNE)，其表現出對中性粒細胞趨化活性。有研究發(fā)現長期適量的果糖攝入能使從腸道進入門靜脈的脂多糖的轉運增加，此外，還能引起細菌過度生長以及腸滲透性的增加。這可能會導致肝Kupffer細胞活化，在肝臟中形成活性氧(ROS)，并通過核轉錄因子κB(NF-κB)誘導肝的TNF-α表達。TNF-α可以通過與肝細胞膜上的TNF-α Ⅰ型受體結合，促進肝細胞的凋亡，還可以抑制磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)活性，降低葡萄糖轉運子(GLUT)的基因表達，誘發(fā)機體產生胰島素抵抗，使機體空腹血糖含量增加。

在小鼠飲食中增加了30%的果糖，8周后顯示甘油三酯水平增加4倍，體重也有顯著增加，并且肝細胞發(fā)生脂肪變性[8]。雖然沒有明確的動物模型研究表明果糖可以改變和NASH有關的代謝指標,但果糖被證實改變的生化指標與促進胰島素抵抗密切相關[9]。

有實驗在果糖和脂肪的基礎上，加入膽固醇的飼料，得到了更好的小鼠模型：由脂肪占總能量的40%(12%的飽和脂肪酸,0.2%的膽固醇)和含有高果糖玉米糖漿的飲用水(42 g/L的濃度)組成，這個營養(yǎng)建模也被稱為高脂肪、果糖和膽固醇(FFC)飲食。FFC與高脂飲食相比[脂肪占總能量的60% (1%的飽和脂肪酸)]，兩種飲食都能夠引起特征性的代謝綜合征癥狀：肥胖、胰島素抵抗和脂肪變性，但是高脂飲食沒有肝纖維化的改變，FFC飲食小鼠病理結果展示了肝細胞有明顯的氣球樣變和進行性的纖維化，同時與纖維化、炎癥、內質網應激及脂性凋亡相關基因的表達也有增加[10]。FFC飲食強調了果糖和膽固醇膳食成分的添加對高脂飲食建立NAFLD和NASH模型的巨大貢獻[10]。因此在小鼠NASH模型的建立中，增加果糖到營養(yǎng)過剩的飲食能夠促進肝臟纖維化、肝細胞氣球樣病變、脂肪組織炎癥[11]。

自然界中的果糖以游離形式大量存在于水果漿汁和蜂蜜中。20世紀 70 年代高果糖玉米糖漿(HFCS)引入食品加工業(yè)后，果糖大量存在于軟飲料、糖果等食品中，如可樂HFCS熱量比高達50%，果糖的攝入量逐年增高，特別是一些青少年以軟飲料代水飲用。流行病學研究發(fā)現高果糖攝入與肥胖、血脂異常、代謝綜合征發(fā)病相關。動物實驗研究表明，高果糖飲食可致血脂異常、血糖增高、腹型肥胖以及血壓升高，表現為典型的代謝綜合征[12]。

1.3 蛋氨酸-膽堿缺乏飲食(Methionine and choline deficiency,MCD) 脂肪和蔗糖提供總能量的比例分別為10%和40%，蛋氨酸和膽堿在肝臟 β-氧化和VLDL生產的過程中起十分重要的作用。MCD飲食通過增加游離脂肪酸攝取和降低極低密度脂蛋白合成而導致肝內脂肪蓄積，造成肝細胞脂質積累和VLDL減少綜合征。MCD飲食會造成小鼠體重下降，肝臟脂肪變性，周圍組織伴發(fā)炎癥或壞死。MCD鼠表現出的強烈的炎性反應，NF-κB在其中起重要作用，另外還可以檢測到一些細胞因子的表達，如：TNF-α、IL-6 、TGF-β以及一些黏附分子的高表達，如：ICAM-1、VCAM-1和MCP-1，它們與免疫系統(tǒng)的活化密切相關。而有些炎性因子，例如肝細胞Cox-2的表達，可降低由MCD飲食引起的非酒精性脂肪肝炎癥和肝纖維化[13]。

MCD模型在分子機制上可較好模擬人NASH，但仍存在一系列問題，與肥胖的NAFLD/NASH 臨床患者相比，MCD飲食模型的甘油三酯和膽固醇水平降低；胰島素、葡萄糖和瘦素水平也降低，而這些會對NASH帶來的效應產生抵抗，從而影響造模。另外在病因學上，此模型也不具備很好的說服力。

2 免疫缺陷聯合營養(yǎng)模型

炎癥是非酒精性脂肪肝病發(fā)展中最重要的病理改變之一，也是肝臟從簡單的脂肪變性到非酒精性脂肪肝炎的標志。在非酒精性脂肪肝炎中，炎癥因子的水平(例如NLRPs、caspase-1、IL-1beta和 IL-18)均有升高。在肝臟，炎癥復合物主要是在免疫細胞中表達，先天免疫的激活是觸發(fā)和放大NAFLD/NASH相關病理改變的關鍵因素[14,15]。因此，弄清楚NAFLD/NASH所涉及的主要免疫細胞類型以及它們如何識別有關模式分子，或者弄清楚其模式分子通過結合表面模式識別受體，啟動級聯信號放大炎癥反應的過程，可以為研究新的治療策略提供幫助[16]。基于這樣的思路，很多的實驗利用基因敲除等技術制備免疫缺陷小鼠進行建模，結合傳統(tǒng)的營養(yǎng)建模方法，極大提高了建模的效率，成為先進的NAFLD/NASH建模方法。

2.1 TLR-2敲除聯合CD/MCDD模型 TLRs大量表達于Kupffer細胞膜表面，與NAFLD有密切關系。TLR-2通過運輸?；鞍自谥|運輸中起到了一定的作用。TLR-2基因敲除可提高實驗小鼠患非酒精性脂肪性肝炎的概率[17]。在研究TLR-2對NASH發(fā)病機理的實驗中，給 TLR-2-/-小鼠喂養(yǎng)CD或MCDD飲食8周后，對小鼠肝脂肪變性、炎癥和壞死組織各部分進行評估。組織學評分顯示，與野生型小鼠相比，TLR-2-/-小鼠的肝細胞損傷更嚴重。從冷凍肝臟樣本中提取總RNA和信使RNA，對TNF-α、膠原蛋白α1、IL-10、過氧物酶體PPAR-γ、CD14進行實時定量熒光PCR及蛋白質水平分析。生化檢查與組織學研究結果一致，與野生型相比，TLR-2-/-小鼠TNF-α的mRNA表達升高了大約3倍；而PPAR-γ的表達有所降低。實驗研究表明，TLR-2缺陷小鼠高脂飲食更易誘導NAFLD的機制可能與相應的信號通路的改變有關。

2.2 CD1d基因敲除聯合高脂飲食模型 自然殺傷T(NKT)細胞是一種先天性免疫細胞，肝臟中的含量尤其豐富，約占肝臟淋巴細胞的30%，容易被脂類抗原激活，他們是固有免疫和適應性免疫的橋梁，也是炎癥反應的重要監(jiān)控細胞[18,19]。 缺乏NKT細胞的小鼠通過高脂肪的飲食喂養(yǎng)更容易發(fā)生代謝紊亂。用CD1d-/-敲除的NKT細胞小鼠在喂養(yǎng)高脂肪食物之后更容易導致體重增加和脂肪肝。同時，CD1d-/-鼠在實驗中所表現的肝臟中炎癥基因大量表達的現象，說明了該品系的小鼠有更易發(fā)生NAFLD的趨勢。運用量熱法(Calorimetry)研究也證明了該品系小鼠對比于野生型小鼠有顯著的食物攝取量的增加和代謝率下降的趨勢。以上結果提示NKT細胞發(fā)揮炎癥監(jiān)管作用，有助于防止食源性肥胖和代謝功能障礙，同時NKT細胞可能在肝臟代謝和免疫系統(tǒng)之間的相互調節(jié)中發(fā)揮著重要作用，通過調節(jié)能量平衡，以保證肝臟的正常功能[20]。

2.3 CD40基因敲除聯合高脂飲食 肥胖和2型糖尿病的病理生理學特點在嚙齒動物和人類上的體現是脂肪組織和肝臟的慢性炎癥，而CD40受體及其配體CD40L啟動免疫細胞信號促進炎癥反應。有研究發(fā)現缺少CD40的小鼠給予高脂肪飲食，結果顯示了肝臟細胞因子水平的降低，但表現出肝脂肪變性、胰島素抵抗和葡萄糖耐受降低。進一步應用血糖-高血胰島素鉗夾技術也發(fā)現CD40-null小鼠葡萄糖利用率降低和胰島素抵抗。但是在CD40缺乏小鼠的脂肪組織有明顯細胞因子水平的升高和炎性細胞的浸潤，尤其是巨噬細胞和CD8(+)效應性T細胞。這些結果表明：①CD40-null小鼠的肝臟炎癥反應降低，但出現肝脂肪變性；②CD40在抑制脂肪組織炎癥上具有重要作用,從而防止肝脂肪變性[21,22]。

2.4 IFR-9基因敲除聯合高脂飲食的模型 干擾素調節(jié)因子(IRFs)是一類調控干擾素轉錄的因子，有九種類型(IRF-1～IRF-9)，參與天然免疫與病原體的防御。干擾素調節(jié)因子9(IRF-9)是一個主要的調節(jié)干擾素轉錄的因子，有研究發(fā)現 IRF-9 的表達在肥胖小鼠體內明顯降低。應用 IFR-9基因敲除小鼠，給予長期慢性高脂食物飼養(yǎng)，小鼠表現為肥胖、胰島素抵抗及肝脂肪變性和炎癥反應。而應用食源性或基因型(ob/ob)肥胖小鼠，通過腺病毒載體介導 IRF-9 的過表達，可明顯增加小鼠的肝胰島素敏感性，有效改善肝脂肪變性和炎癥反應。進一步采用酵母雙雜交文庫篩選系統(tǒng)研究IRF-9與輔酶因子之間的相互作用，發(fā)現IRF-9與過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR-α)具有相互作用，PPAR-α是一個重要的代謝相關的核受體，它能夠激活下游目標基因，降低胰島素耐受和改善IRF9缺乏的小鼠肝脂肪變性和炎癥。由此得出結論 IRF-9 通過與 PPAR-α 相互作用能夠降低肝臟的IR、脂肪變性和炎癥反應[23]。而IFR-9基因敲除小鼠在構建免疫缺陷聯合營養(yǎng)NALFD模型上提供了很好的條件。

2.5 精氨酸酶2基因敲除聯合高脂飲食 精氨酸酶是催化水解L-精氨酸生成鳥氨酸與尿素的反應酶。分為1和2型，1型主要表達于肝細胞，而2型主要表達于免疫細胞，尤其是巨噬細胞。精氨酸酶2可與誘導型一氧化氮合酶(iNOS)競爭底物，這兩種酶的平衡在調節(jié)免疫反應和巨噬細胞的激活中起著至關重要的作用。天然免疫包括巨噬細胞的激活在肝臟脂肪變性到脂肪性肝炎這一疾病進展中具有重要作用。

Navarro等[24]利用Arg2-/-小鼠建模，通過高脂肪喂養(yǎng)，來檢驗缺乏精氨酸酶2能夠促進小鼠從單純的肝脂肪變性進展為脂肪性肝炎這一假設。精氨酸酶2-因子敲除Arg2-/-小鼠經短期(7周)喂養(yǎng)高脂肪飲食后，發(fā)現小鼠肝臟以顯著的脂肪變性為特征。這些變化與全身的代謝無關，而與參與肝脂肪從頭合成的基因的mRNA水平顯著提高有關，肝損傷和炎癥伴隨著血清ALT的升高，標志著F4/80陽性細胞的浸潤，炎癥因子的基因表達水平增加。另外，Arg2-/-小鼠接受尾靜脈注射包裹了氯膦酸二鈉的脂質體(CLOD)，選擇性耗竭肝巨噬細胞，結果發(fā)現肝臟脂質沉積明顯減少，合成脂肪的mRNA表達趨于正?；＿@些結果顯示精氨酸酶2通過巨噬細胞介導肝脂質沉積和肝損傷，提示精氨酸酶2在脂肪性肝炎中的重要作用[24]。

3 展望

人類疾病動物模型在醫(yī)學發(fā)展中起著重要作用，以自然發(fā)生作為人類疾病研究的模型已經不能滿足科學研究的需要。最“準確”營養(yǎng)膳食模式包含了所有的西方飲食的膳食組成部分，包括脂肪、果糖和膽固醇，這樣的飲食復制NASH的組織病理學特征周期需要持續(xù)20周及以上。

通過基因改造構建的NASH模型，雖然先天免疫系統(tǒng)的激活介導的無菌性炎癥反應是一個非酒精性脂肪肝炎的關鍵特性，但是單純炎癥的建模會導致缺乏代謝疾病這樣一個關鍵的特征,在病因上，與人類由代謝綜合征引起的疾病有絕對的差異,這個方面是導致這類模型建模受限的主要原因。

隨著生物技術的不斷發(fā)展，復合模型結合了基因和飲食模型的雙重特征，可以縮短造模時間，最大程度上模擬人類NAFLD，有著廣闊的應用前景。

一個合格的動物模型應該具有所有人類NAFLD/NASH的特征性，包括：肥胖、胰島素抵抗、肝脂肪變性、炎癥和纖維化。理想狀態(tài)下，模型動物基因的轉錄的變化也要和人類NAFLD/NASH的一致，然而目前還并沒有一種理想狀態(tài)的小鼠模型建模，當前多數小鼠模型不能完全概括人類的全部特征[5]。相關文獻提出了一些參與無菌性炎癥應答的通路與NASH有關,凸顯了脂肪組織失調是人類NASH的關鍵特性[25，26]。

綜上，未來 NAFLD 動物模型應致力于：①為了最大程度的模擬 NAFLD的疾病進展尋找最佳的基因和飲食混合模型；②建立統(tǒng)一的模型評價標準;③對于高脂飲食模型應尋找一個重復性較好且能將食源性肥胖與肝臟和脂肪組織功能障礙相結合的模型,如FFC飲食；④除了關注實驗動物的肝脂肪變性、炎癥和纖維化，也應該多關注脂肪組織炎癥；⑤隨著對發(fā)病機制的研究逐步深入，篩選出與NASH相關性高的易感基因或者影響脂肪代謝途徑的相關基因和代謝通路，以培育出更多特殊品系的動物，逐步縮小動物模型與人類 NAFLD 間的差距。

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[收稿2016-08-15 修回2016-10-21]

(編輯 倪 鵬)

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.04.032

①本文受國家自然科學基金(81473461)資助。

侯 露(1995年-)，女，主要從事臨床醫(yī)學研究，E-mail：1026044915@qq.com。

及指導教師：劉朝奇(1962年-)，男，博士，教授，主要從事免疫學方面研究，E-mail：ctgulcq@163.com。

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1000-484X(2017)04-0630-05