鄭仲華 吳艷紅 張仕云 趙 明 楊 佩丘 峰 何洪洲 柳俏凡 陳園園 琚春梅*

(1.南沙出入境檢驗(yàn)檢疫局,廣東廣州 511457; 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東廣州 510642)

廣東地區(qū)PRV流行毒株gE基因的進(jìn)化分析及對(duì)育肥豬的致病性研究

鄭仲華1吳艷紅2張仕云1趙 明1楊 佩1丘 峰1何洪洲1柳俏凡1陳園園1琚春梅2*

(1.南沙出入境檢驗(yàn)檢疫局,廣東廣州 511457; 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東廣州 510642)

選取10頭4月齡PRV陰性育肥豬，隨機(jī)分為A、B兩組，A組免疫豬偽狂犬病活疫苗，B組不免疫，2周后兩組同時(shí)注射2 ml/頭的YJ株進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。遺傳進(jìn)化分析表明，與當(dāng)前流行毒株相比，YJ株gE糖蛋白存在多個(gè)氨基酸的改變；動(dòng)物攻毒試驗(yàn)中，疫苗免疫組全部健活，而非免疫組全部發(fā)病，且有3頭死亡，說明現(xiàn)有的PRV活疫苗免疫豬能完全抵抗YJ株的攻擊，而無偽狂犬病病毒抗體的育肥豬對(duì)YJ株無抵抗力，表明PRV YJ株對(duì)育肥豬具有很強(qiáng)的致病性。當(dāng)前的免疫程序缺少對(duì)育肥豬的免疫，因此應(yīng)合理的調(diào)整免疫程序，起到有效控制豬場(chǎng)PRV流行毒株的侵襲。

豬偽狂犬病 流行毒株 遺傳特性 致病性

豬偽狂犬病是由偽狂犬病病毒（PRV）引起的一種豬急性傳染病。豬是該病毒的主要天然宿主、貯存者和傳播者，不同年齡段的豬都可感染，主要引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，哺乳仔豬高死亡率，育肥豬的呼吸癥狀等。我國(guó)自20世紀(jì)60年代初在豬群中發(fā)現(xiàn)該病毒，至今豬偽狂犬病病毒仍在我國(guó)廣泛流行，嚴(yán)重威脅著我國(guó)豬群的健康，并造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。

從2011年開始，各地陸續(xù)報(bào)道規(guī)模化豬場(chǎng)出現(xiàn)母豬產(chǎn)弱仔、死胎、流產(chǎn)，仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀及死亡等偽狂犬病的臨床癥狀。多位學(xué)者從各地也陸續(xù)分離出眾多流行毒株，并對(duì)流行毒株進(jìn)行了抗原性差異分析及全基因組序列分析。從廣東省陽(yáng)江地區(qū)4月齡死亡的育肥豬體內(nèi)分離出PRV YJ株，本研究擬通過PRV YJ株gE基因的遺傳進(jìn)化分析及致病性分析，為當(dāng)前流行株的變異提供證據(jù)，并為豬場(chǎng)的防控提出建議。

1 材料與方法

1.1 病毒、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

PRV YJ株分離自廣東省陽(yáng)江某豬場(chǎng)，由南沙出入境檢驗(yàn)檢疫局微生物實(shí)驗(yàn)室保存；4月齡育肥豬購(gòu)自廣東永順生物制藥股份有限公司的PR陰性場(chǎng)，且通過IDEXX抗體檢測(cè)試劑盒證實(shí)為PRV g B、g E抗體均為陰性。DNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；PCR所用試劑購(gòu)自TaKaRa公司，g B、g E抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)IDEXX公司；PR活疫苗購(gòu)自廣東永順生物制藥股份有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中PRV基因組序列（NC-006151）設(shè)計(jì)擴(kuò)增g E基因全長(zhǎng)的引物，gE1：5‘-CGGGGTTGAGACCATGCG-3'，gE2：5'-GGGCGGGACATCAACGGA-3'，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 PCR擴(kuò)增

按照DNA提取試劑盒說明，PCR反應(yīng)體系：2×GC BufferⅡ12.5μL、2.5 mmol/L dNTP 2.5μL，引物（10μmol/L）各1μL，LA Taq 酶 0.5μL，模板2μL，加ddH2O至25μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，60℃退火45s，72℃延伸1 min進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物直接送上海生工測(cè)序。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

10頭豬平均分為A、B兩組。A組免疫PR活疫苗，B組不免疫，2周后全部頸部肌肉攻毒PRV YJ株，2 ml/頭，每天測(cè)量體溫1次，并觀察記錄臨床癥狀。

2 結(jié)果

（1）gE基因PCR擴(kuò)增結(jié)果通過PCR擴(kuò)增，得到大小約1713bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。

（2）gE基因的遺傳進(jìn)化分析 PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果用DNA Star軟件進(jìn)行序列拼接，并通過MegAlign進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，PRV YJ株與2012年、2013年流行的毒株存在一定的差異，與JS-2012親緣關(guān)系較近。與當(dāng)前流行毒株相比，YJ株的gE糖蛋白在主要抗原表位片段發(fā)生氨基酸突變，可能引起毒力增強(qiáng)，造成4月齡育肥豬的死亡。

（3）PRV YJ株動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果 A組免疫豬在攻毒之后，體溫、采食正常；B組未免疫豬，全部發(fā)病，在攻毒后3d體溫升高至41℃，并出現(xiàn)呼吸困難，咳嗽，食欲減退等癥狀，后期有3頭豬出現(xiàn)轉(zhuǎn)圈等神經(jīng)癥狀，一側(cè)倒地不起，呼吸衰竭死亡，死亡豬解剖后部分器官病變。

3 討論

豬偽狂犬病病毒YJ株從廣東陽(yáng)江某豬場(chǎng)的4月齡死亡育肥豬分離后，通過動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)。該毒株接種4月齡PRV陰性育肥豬后全部發(fā)病，死亡率高達(dá)60%，表明PRV YJ株對(duì)豬具有很強(qiáng)的致病性。通過遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，該毒株與2012年、2013年分離的流行株存在一定的差異，與流行株 PRV YJ株gE糖蛋白存在7個(gè)氨基酸的區(qū)別，是否會(huì)導(dǎo)致其毒力增強(qiáng)，引起4月齡育肥豬的高死亡率，有待進(jìn)一步證實(shí)。

通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，我們看到PRV YJ株會(huì)造成未接種PRV疫苗4月齡育肥豬的死亡，主要緣于其在不接種疫苗的情況下，未能在育肥豬體內(nèi)產(chǎn)生足夠的PRV抗體，在YJ株的感染下不能形成強(qiáng)有力的保護(hù)而致死，可見未能有效免疫PRV疫苗是豬場(chǎng)PRV感染育肥豬并致其死亡的重要原因。

2016年全國(guó)凍肉進(jìn)口量增長(zhǎng)明顯，在南沙港區(qū)的進(jìn)口量比去年驟增數(shù)倍，但進(jìn)口的全國(guó)凍肉量也只占全國(guó)肉類消費(fèi)量的1.5%左右。由于豬價(jià)處于波動(dòng)高峰期，穩(wěn)定的國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)養(yǎng)殖環(huán)境對(duì)于國(guó)內(nèi)豬肉價(jià)格的穩(wěn)定作用顯而易見，各種疫病的暴發(fā)都會(huì)將國(guó)內(nèi)豬肉價(jià)格推向新高，因而，豬場(chǎng)除了控制豬瘟、豬藍(lán)耳病、口蹄疫等疫病，還要特別注意防范豬偽狂犬病，因其對(duì)仔豬影響很大。國(guó)內(nèi)育肥豬舍是偽狂犬病病毒的“集轉(zhuǎn)地”，而免疫程序又有缺陷的情況下，我們只能盡可能地凈化國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖環(huán)境，做好育肥豬的免疫工作，才能保證育肥豬的健康出欄，更好地穩(wěn)定國(guó)內(nèi)豬肉價(jià)格。