鄧怡晨，劉云波

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，北京 100021)

綜述與專論

AAV載體靶向修飾策略在基因治療中的研究進展

鄧怡晨，劉云波

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，北京 100021)

腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)是微小病毒科的一種，它能以其廣泛的宿主范圍及低的免疫原性對人及靈長類進行感染，而且經(jīng)過改造后的 AAV 能夠更有效的轉(zhuǎn)導(dǎo)特異組織及細胞。腺相關(guān)病毒作為一種基因治療載體其生物學(xué)特性已被深入了解，通過改造腺相關(guān)病毒的血清型和蛋白衣殼結(jié)構(gòu)能夠擴寬其應(yīng)用范圍。本文對 AAV 病毒載體的衣殼蛋白基因工程修飾、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控修飾、基因改造和衣殼蛋白共價偶聯(lián)修飾的靶向機理以及相關(guān)的一些研究成果進行介紹。

腺相關(guān)病毒 靶向 基因治療

隨著對腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)AAV作為轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的載體有一定的局限性，如AAV宿主范圍廣泛、組織或細胞特性缺乏等，使得其作為基因的載體被用于臨床治療實驗中存在安全性、靶向性和轉(zhuǎn)染效率低的缺陷[1]。因此，AAV的靶向性對于基因治療的成功與否非常關(guān)鍵。具有靶向性的病毒載體是目前基因治療臨床試驗研究的主要載體，應(yīng)用AAV載體來轉(zhuǎn)導(dǎo)治療基因有宿主范圍廣泛及低免疫原性等優(yōu)點。而且經(jīng)過AAV改造后的重組腺相關(guān)病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)載體更能有效的轉(zhuǎn)導(dǎo)治療基因和靶向特定的組織或細胞[2, 3]。在AAV成功用于基因治療的研究中，需要盡可能提高基因治療的效率和努力使其造成的細胞毒性降到最低，探究AAV載體介導(dǎo)基因治療的最佳靶向策略。目前優(yōu)化AAV的感染靶向性有四種策略：一是衣殼蛋白基因工程修飾；二是在轉(zhuǎn)錄水平上進行靶向調(diào)控；三是通過基因改造；四是對衣殼蛋白通過共價偶聯(lián)進行修飾。

1 衣殼蛋白基因工程修飾

AAV對細胞的靶向性依賴于其衣殼和特異細胞表面受體的相互作用，是由受體和衣殼的相互作用介導(dǎo)的AAV內(nèi)化和細胞運輸?shù)冗^程。目前對構(gòu)成衣殼的cap蛋白 (capsid protein) 進行改造成為主要研究方向[4-6]。

在早期對AAV靶向性研究中一般是直接將目標配體插入到cap基因中。如Yang等首次構(gòu)建了一種以人類造血干細胞為靶點的AAV載體，方法是在AAV2的VP2蛋白N端插入了抗人CD34的單鏈抗體基因，結(jié)果顯著地增強了AAV對CD34細胞的感染率[7]。隨后的研究中，Buning等發(fā)現(xiàn)在AAV2衣殼蛋白的表面有6位點暴露出來，位點分別是261、381、447、534、573、587，且在這些位點插入一些氨基酸序列不會影響 病毒的衣殼包裝等正常生活周期并且能改變其轉(zhuǎn)染趨向性。如White等構(gòu)建了靶向人內(nèi)皮細胞的AAV載體，即在AAV2衣殼的587位點插入靶向人內(nèi)皮細胞的多肽序列，結(jié)果是大大增強了AAV2載體轉(zhuǎn)染人內(nèi)皮細胞的靶向性。而且該突變體感染途徑不依賴硫酸乙酰肝素(heparan sulfate proteoglycan，HSPG)而增強了其特異靶向性。因為野生型AAV2廣泛趨向性是在其感染各種細胞過程中先與HSPG結(jié)合，而大多細胞表面都表達葡萄糖胺聚糖[8]。

隨后，很多研究團隊也分別通過直接插入的方式在AAV衣殼上插入選擇配體從而構(gòu)建了具有不同靶向性的AAV載體。Grifman等用受體靶向性修飾AAV衣殼，將腫瘤靶向多肽序列NGRAHA插入至AAV衣殼的特定位點，使插入該靶向多肽的rAAV載體感染Kaposi肉瘤細胞和胚胎橫紋肌肉瘤細胞的能力遠高于用野生型AAV2的感染效果[9]。Nicklin等通過用多肽SIGYPLP修飾AAV衣殼，使構(gòu)建的AAV能人為靶向的感染多種腫瘤細胞株，包括惡性黑色素瘤細胞系(C8161)、前列腺癌細胞系(PC-3和LnCAP)、胃癌細胞系(MKN-45)、和肺腺癌細胞(A549)，而且不受AAV本身對細胞親噬性的影響[10]。這些研究有力的說明了野生型 AAV 經(jīng)過對衣殼蛋白進行插入和突變修飾能提高其對特異細胞的靶向性，從而提高AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)目的基因的轉(zhuǎn)染率。

2 在轉(zhuǎn)錄水平上進行靶向調(diào)控

在轉(zhuǎn)錄水平對AAV靶向調(diào)控方式包括：一、組織特異性啟動子調(diào)控AAV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的靶向性；二、轉(zhuǎn)錄后水平的 microRNA 靶向元件調(diào)控AAV的靶向性。

2.1 組織特異性啟動子對AAV的靶向性探究

在機體內(nèi)，幾乎所有的細胞都具有完整基因組，但在不同組織細胞中會呈現(xiàn)出不同的表型特征，這是因為由DNA中的啟動子、增強子元件及轉(zhuǎn)錄因子相互作用在基因組表達過程中調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。病毒啟動子如CMV具有廣泛的組織表達特性，也就是在多種細胞中均有活性，在傳統(tǒng)的基因治療研究中，經(jīng)常會選擇這類病毒啟動子來調(diào)控基因治療的表達，這就不可避免的對靶外細胞和組織產(chǎn)生毒副作用，并引起機體免疫反應(yīng)[11, 12]。而組織特異性啟動子則由于啟動子對細胞的特異性而限制基因只在靶細胞中才能得以表達，更加適合用于基因治療的靶向調(diào)控[13]。

目前，各類型的組織特異性啟動子已經(jīng)被報道并用于AAV載體靶向調(diào)控的研究中。但有些特異性啟動子的活性要低于病毒啟動子，如在肝臟細胞中，α-抗胰酶(hAA)、白蛋白(Alb)都是肝特異性蛋白基因，這兩種啟動子比CMV啟動子的活性低。Okuyama等在hAAT啟動子上插入了肝特異性增強子ApoE，較之前單一特異性啟動子表達水平提高15倍[14]。在用AAV介導(dǎo)的肝靶向性血友病基因治療中，Jenny McIntosh等用rAAV載體攜帶重組人類凝血因子VIII靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)肝細胞實驗中，選擇用一種肝臟細胞特異性的嵌合啟動子HLP，同時還優(yōu)化了B結(jié)構(gòu)域缺失的人凝血因子Ⅷ基因中226個氨基酸區(qū)域，用新型17-aa肽替換，用所構(gòu)建的新型rAAV載體(rAAV-HLP-codop-hFVIII-V3)通過外周靜脈注射靶向感染肝細胞，得到超生理水平表達目的基因的結(jié)果，且在小鼠和獼猴的體內(nèi)都得到有效的驗證[15]。

對于神經(jīng)系統(tǒng)疾病而言，由于血-腦屏障的存在，用基因治療的方法很難將外源的基因表達產(chǎn)物轉(zhuǎn)運到腦部進而達到治療效果。AAV是一類微小的，且在正常細胞中不發(fā)生產(chǎn)毒性感染的病毒，研究表明AAV9型載體不僅可以在腦中擴散，還能夠使目的基因進入腦部的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，所以AAV能夠用于研究各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療[16, 17]。特定神經(jīng)元的進行性變性死亡引起各種的神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默病(AD)患者表現(xiàn)為皮質(zhì)神經(jīng)元的丟失，帕金森病(PD)患者表現(xiàn)為黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的丟失。因此優(yōu)化AAV在神經(jīng)系統(tǒng)中的靶向性尤為重要。

Akiya Watakabe等在狨猴大腦皮層注射攜帶GFP的AAV病毒載體，得知在CMV啟動子調(diào)控下，血清型1,5,8,9的AAV的GFP都在膠質(zhì)細胞中大量表達，且表達效率沒有明顯的差異[18]。而AAV2表達范圍較其他4中血清型AAV明顯較小[19]。此外，狨猴腦池內(nèi)注射AAV9在整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的擴散較好，而小腦薄壁組織注射，其擴散程度相比腦池內(nèi)注射有局限性，其主要擴散至小腦皮層和小腦傳出神經(jīng)元。這兩種注射方式都會將目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至運動神經(jīng)元、神經(jīng)節(jié)、背根神經(jīng)節(jié)、背索內(nèi)側(cè)丘、脊髓小腦束。根據(jù)不同神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病變部位分析，前一種注射方式適用AD、溶酶體貯積癥(LSD)等疾病研究，后一種注射方式適合小腦的損傷、腦干中相關(guān)的神經(jīng)核團損傷而造成的神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)，如脊髓小腦病變癥。在前腦谷氨酸能神經(jīng)元特異性啟動子(CAMKⅡ)調(diào)控下，所有血清型AAV載體都能高效的在大腦皮層神經(jīng)元(cortical neurons)細胞中表達[16]。hSyn是人SYN1基因的啟動子，SYN1基因表達產(chǎn)生的Synapsin I蛋白，是在神經(jīng)元內(nèi)特異表達的蛋白。研究發(fā)現(xiàn)rSynI在狨猴浦肯野細胞中的表達極弱，但在嚙齒類動物浦肯野細胞中啟動子活性較好，說明在不同物種之間，組織特異性啟動子介導(dǎo)基因的途徑也會有差異。2.2 microRNA 靶向元件調(diào)控AAV的靶向性

miRNA是由其前體pri-RNA被RNaseIII核酸內(nèi)切酶Drosha和Dicer酶酶切和催化而形成的雙鏈miRNA，其一條鏈被降解，另一條鏈即具有內(nèi)源性的非編碼單鏈小分子RNA。miRNA先與基因沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)結(jié)合，然后在RISC的指導(dǎo)下，miRNA在與mRNA互補的位置結(jié)合，通過使mRNA降解或抑制mRNA翻譯來實現(xiàn)對目的基因表達的調(diào)控[20]。用AAV作為載體攜帶miRNA轉(zhuǎn)染特異性細胞較用其他病毒載體如慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等明顯降低了外源基因在某些非靶向組織和細胞中表達而產(chǎn)生的免疫反應(yīng)和毒副反應(yīng)[21, 22]。

3 基因改造

AAV載體在靶細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中雙鏈DNA(dsDNA)不穩(wěn)定嚴重影響了其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和持久性，研究者發(fā)現(xiàn)AAV的DNA中一個末端反向重復(fù)序列(inverted terminal repeats，ITR)中的串聯(lián)重復(fù)序列(tandem repeat sequences，TRS)缺失或突變產(chǎn)生的AAV病毒將以二聚體形式穩(wěn)定存在，即自身互補型腺相關(guān)病毒(scAAV)。與常規(guī)的重組腺相關(guān)病毒相比較，其主要特點是表達效率高且快速，所以在使用時能相對降低scAAV的使用量，進而降低機體可能會出現(xiàn)的免疫反應(yīng)[23, 24]。scAAV載體的出現(xiàn)促進了AAV載體在臨床試驗上的應(yīng)用。

4 衣殼蛋白共價偶聯(lián)修飾

近年來，用化學(xué)生物學(xué)方法修飾生物大分子得到了廣泛的應(yīng)用[25]，有關(guān)研究表明，用活化的高分子共價結(jié)合AAV衣殼蛋白氨基酸殘基能對病毒進行修飾，能改變其組織特異性，提高病毒載體靶向性。

分子的PEG化，即活化的聚乙二醇與AAV衣殼蛋白的α-以及ε-氨基偶聯(lián)使衣殼蛋白活性發(fā)生改變進而降低AAV抵抗蛋白酶水解的能力，減低免疫原性和毒副作用，延長體內(nèi)半衰期,降低血漿清除率等[26, 27]。一種水溶性高分子聚合物pHPMA對AAV進行修飾，使高分子直接與靶細胞受體反應(yīng)或通過高分子鏈將載體上的受體包裹，從而讓AAV喪失原本具有的趨向性，實現(xiàn)被動靶向[28]。

綜上可知，用化學(xué)方法修飾病毒能較大程度地優(yōu)化病毒載體在基因治療中的靶向性和轉(zhuǎn)染效率，為當(dāng)前解決AAV載體的靶向性等問題提供了新的思路和方法。

5結(jié)語和展望

基因治療中，應(yīng)用較早、較廣泛的兩類載體是腺病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄載體，但至今未取得令人滿意的臨床研究結(jié)果。AAV作為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的載體較腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒有很多優(yōu)點，如廣泛的宿主細胞范圍、低免疫源性、長時間在體內(nèi)表達外源基因等。為了能將AAV作為基因載體用于臨床的基因治療，研究者不斷改善AAV對宿主或靶向細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率及感染的選擇性。目前有四種調(diào)控AAV靶向的基本方式：一是衣殼蛋白基因工程修飾；二是通過轉(zhuǎn)錄水平進行調(diào)控；三是通過基因改造；四是衣殼蛋白共價偶聯(lián)修飾。為了將AAV載體作為基因治療的工具，需要研究更多的AAV亞型、在基因水平上將AAV感染靶向性和轉(zhuǎn)錄靶向性相結(jié)合，更加深入的了解AAV在機體內(nèi)的各種分子機制。

除了從以上這些基因分子水平上調(diào)控AAV的靶向性的策略，注射途徑的選擇及添加輔助藥物、不同物種的差異和病毒的多重感染都會影響到AAV對組織和細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶向性、感染率。為了解決這些問題，當(dāng)前有許多研究正致力發(fā)展其他策略，如構(gòu)建新型靶向AAV載體以降低免疫反應(yīng)和提高治療效果、在不同實驗動物疾病模型探究AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的異同等。相信隨著對靶向修飾 AAV的技術(shù)越來越成熟，會有力的促進人類疾病基因治療的發(fā)展。

[1] 趙麗琴, 席斌, 彭華松. 腺相關(guān)病毒(AAV)載體研究進展 [J]. 生物技術(shù)進展, 2012, 02(2): 110-115.

[2] 王毅剛, 黃芳, 蔡榮, 等. 腺相關(guān)病毒載體的靶向策略探討 [J]. 科學(xué)通報, 2007, 52(10): 1107-1115.

[3] 何茂銳, 黃愛龍. 感染靶向性重組腺相關(guān)病毒載體在基因治療中的研究進展 [J]. 國際病毒學(xué)雜志, 2005, 12(5): 136-140.

[4] Watakabe A, Ohtsuka M, Kinoshita M, et al. Comparative analyses of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 8 and 9 in marmoset, mouse and macaque cerebral cortex [J]. Neurosci Res, 2015, 93: 144-157.

[5] 王啟釗, 呂穎慧, 李招發(fā), 等. 腺相關(guān)病毒的衣殼裝配和DNA衣殼化機制 [J]. 生物工程學(xué)報， 2011, 27(4): 531-538.

[6] Van Vliet KM, Blouin V, Brument N, et al. The role of the adeno-associated virus capsid in gene transfer [J]. Methods Mol Biol, 2008, 437: 51-91.

[7] Okuyama T, Huber RM, Bowling W, et al. Liver-directed gene therapy: a retroviral vector with a complete LTR and the ApoE enhancer-α 1-antitrypsin promoter dramatically increases expression of human α 1 -antitrypsin in vivo [J]. Human Gene Ther, 1996, 7(5): 637-645.

[8] Strobel B, Klauser B, Hartig JS, et al. Riboswitch-mediated attenuation of transgene cytotoxicity increases adeno-associated virus vector yields in HEK-293 Cells [J]. Mol Ther, 2015, 23(10): 1582-1591.

[9] Rosas LE, Grieves JL, Zaraspe K, et al. Patterns of scAAV vector insertion associated with oncogenic events in a mouse model for genotoxicity [J]. Mol Ther, J 2012, 20(11): 2098-2110.

[10] Reynolds A, Leake D, Boese Q, et al. Rational siRNA design for RNA interference [J]. Nature Biotechnol, 2004, 22(3): 326-330.

[11] Rashnonejad A, Chermahini GA, Li S, et al. Large-scale production of adeno-associated viral vector serotype-9 carrying the human survival motor neuron gene [J]. Mol Biotechnol, 2015, 58(1): 1-7.

[12] Yang Q, Mamounas M, Yu G, et al. Development of novel cell surface CD34-targeted recombinant adenoassociated virus vectors for gene therapy [J]. Hum Gene Ther, 1998, 9(13): 1929-1937.

[13] Meng X, Feng Y, Ouyang T, et al. Specific gene expression in mouse cortical astrocytes is mediated by a 1740bp-GFAP promoter-driven combined adeno-associated virus 2/5/7/8/9 [J]. Neurosci Lett, 2015, 593: 45-50.

[14] Mclean JR, Smith GA, Rocha EM, et al. Widespread neuron-specific transgene expression in brain and spinal cord following synapsin promoter-driven AAV9 neonatal intracerebroventricular injection [J]. Neurosci Lett, 2014, 576: 73-78.

[15] Matsuzaki Y, Konno A, Mukai R, et al. Transduction profile of the marmoset central nervous system using adeno-associated virus serotype 9 vectors [J]. Mol Neurobiol, 2016, Feb 16. [Epub ahead of print] DOI 10.1007/s12035-016-9777-6

[16] Liu Q, Perez CF, Wang Y. Efficient site-specific integration of large transgenes by an enhanced herpes simplex virus/adeno-associated virus hybrid amplicon vector [J]. J Virol, 2006, 80(4): 1672-1679.

[17] Lee GK, Maheshri N, Kaspar B, et al. PEG conjugation moderately protects adeno-associated viral vectors against antibody neutralization [J]. Biotechnol Bioeng, 2005, 92(1): 24-34.

[18] Kohli M, Rago C, Lengauer C, et al. Facile methods for generating human somatic cell gene knockouts using recombinant adeno-associated viruses [J]. Nucleic Acids Res, 2004, 32(1): e3.

[19] Kelly EJ, Russell SJ. MicroRNAs and the regulation of vector tropism [J]. Mol Ther, 2009, 17(3): 409-416.

[20] Kelemen RE, Mukherjee R, Cao X, et al. A precise chemical strategy to alter the receptor specificity of the adeno-associated virus [J]. Angewandte Chemie, 2016, 55(36): 10645-10649.

[21] McIntosh J, Lenting PJ, Rosales C, et al. Therapeutic levels of FVIII following a single peripheral vein administration of rAAV vector encoding a novel human factor VIII variant [J]. Blood, 2013, 121(17): 3335-3344.

[22] Hutson TH, Verhaagen J, Moon LDF. Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector: Transduction of the CST using viral vectors [J]. Gene Ther, 2012, 19(1): 49-60.

[23] Guo P, Xiao X, Elgohary Y, et al. A simplified purification method for AAV variant by polyethylene glycol aqueous two-phase partitioning [J]. Bioengineered, 2012, 4(2): 103-106.

[24] Carlisle RC, Reuben B, Briggs SS, et al. Coating of adeno-associated virus with reactive polymers can ablate virus tropism, enable retargeting and provide resistance to neutralising antisera [J]. J Gene Med, 2008, 10(10): 400-411.

[25] Büning H, Ried MU, Perabo L, et al. Receptor targeting of adeno-associated virus vectors [J]. Gene Ther, 2003, 10(14): 1142-1151.

[26] Buie LKK, Rasmussen CA, Porterfield EC, et al. Self-complementary AAV virus (scAAV) safe and long-term gene transfer in the trabecular meshwork of living rats and monkeys [J]. Invest Ophthalmol Visual Sci, 2010, 51(1): 236-248.

[27] Buening H. Efficient and selective AAV2-mediated gene transfer directed to human vascular endothelial cells [J]. Mol Ther, 2001, 4(3): 174-181.

[28] Aydemir F, Salganik M, Resztak J, et al. Mutants at the 2-fold interface of adeno-associated virus type 2 (aav2) structural proteins suggest a role in viral transcription for AAV capsids [J]. J Virol, 2016, 90(16): 7196-7204.

Progress in targeting modification strategy of AAV vector in gene therapy

DENG Yi-chen， LIU Yun-bo

(Institute of Medical Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences. Beijing 100021)

Adeno-associated virus(AAV)belongs to the family of Parvoviridae. It is a small virus which can infect humans and some other primate species with extensive host cell and low-immunogenicity. Besides, modified AAV can target the specific tissues and cells effectively. As a kind of gene therapy vector，Adeno-associated virus have been widely known of its biological characteristics. By modification of the adeno-associated virus serotype and structure of capsid protein, we can extend the application range of AAV vectors. This article introduces the targeting mechanism and results of some related researches, the genetic engineering modification of AAV capsid proteins, the transcription regulation modification of target gene expression, and gene modification and the covalent coupling of AAV capsid proteins.

Adeno-associated virus (AAV); Targeting; Gene therapy

國家科技支撐計劃(No.2014BAI03B01)。

鄧怡晨(1991-)，女，碩士研究生，動物學(xué)，Email：yichendeng007@126.com。

劉云波(1962-)，男，研究員，Email：yunboliu@ 126.com。

R-33

A

1671-7856(2017) 02-0081-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.02.015

2016-11-15