馮麗萍， 楊 遲， 林金杏， 胡建華

(上海實驗動物研究中心，上海 201203)

研究報告

斑馬魚幾種病原菌監(jiān)測

馮麗萍， 楊 遲， 林金杏， 胡建華

(上海實驗動物研究中心，上海 201203)

目的 對斑馬魚進行幾種病原菌的流行病學(xué)調(diào)查，為后續(xù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。方法 基于細(xì)菌的形態(tài)學(xué)及生理生化特性為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)方法，并與分子生物學(xué)方法相結(jié)合，最后分離株人工感染健康斑馬魚，觀察實驗組發(fā)病、死亡情況以判定其對斑馬魚的致病性強弱，從而了解影響斑馬魚健康的主要病原菌。結(jié)果 在所有采樣單位共檢出3種病原菌，包括嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌和銅綠假單胞菌。嗜水氣單胞菌普遍存在于大多數(shù)被檢單位，且有較強的致病力。個別單位檢出溫和氣單胞菌和銅綠假單胞菌。溫和氣單胞菌致病力稍弱；銅綠假單胞菌致病力最弱，感染斑馬魚無典型臨床癥狀，無死亡。結(jié)論 嗜水氣單胞菌可能造成實驗用魚設(shè)施的污染，嗜水氣單胞菌已證明可以感染人類，此類潛在的人-魚感染途徑應(yīng)引起重視。由此建議，嗜水氣單胞菌應(yīng)成為重點監(jiān)控的病原菌。

斑馬魚；病原體檢測；PCR鑒定；人工感染；

斑馬魚屬于輻鰭亞綱鯉科短擔(dān)尼魚屬，其作為新型的模式生物，具有很多優(yōu)勢，比如體型小、飼養(yǎng)成本低、管理方便；體外受精、發(fā)育且早期胚胎透明等，同時在基因水平上與人類具有高度同源性，使其在生命科學(xué)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用日益廣泛[1-3]。隨著斑馬魚在生物醫(yī)學(xué)科研和環(huán)境監(jiān)測中的大量使用，國內(nèi)對高質(zhì)量斑馬魚供魚的需求也不斷增加。斑馬魚質(zhì)量對于試驗結(jié)果，和人員的健康安全都有重大的意義[4]。有報道表明斑馬魚質(zhì)量不同引起實驗差異，為了確?？茖W(xué)實驗的可靠性，對斑馬魚質(zhì)量的控制已成為一個不容忽視的重要環(huán)節(jié)，然而有關(guān)斑馬魚質(zhì)量控制的情況卻鮮有報道。其中細(xì)菌性病原作為目前影響實驗用斑馬魚健康的關(guān)鍵因素，備受國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[4-6]。本文通過檢測評估國內(nèi)斑馬魚細(xì)菌感染情況，為相關(guān)國家或地方標(biāo)準(zhǔn)的制定，提供臨床調(diào)研數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

根據(jù)斑馬魚繁殖生長周期、實驗動物等級及監(jiān)測國家標(biāo)準(zhǔn)(GB14922.2-2010)以及OIE診斷手冊要求, 按以下所述取樣：均選取成年斑馬魚，少于100尾，抽樣5尾或更多；100尾～500尾，抽樣不少于10尾，飼養(yǎng)群體500尾以上者，取樣不少于20尾。

1.2 主要培養(yǎng)基及陽性對照菌株

胰蛋白胨大豆肉湯瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)、羊血瓊脂平板、NAC液體培養(yǎng)基、NAC平皿。

陽性對照菌株僅有嗜水氣單胞菌，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)的編號為CGMCC 1.2017。

1.3 主要實驗儀器和試劑

Labconco Purifier Class II Biosafety Cabinet生物安全柜；奧林巴斯體視顯微鏡SZX7以及蔡氏光學(xué)顯微鏡Axiostar Plus；NanoDrop Spectrophotometer ND-1000分光光度計；PCR儀Biometra T-gradient Thermoblock；凝膠成像系統(tǒng)Bio-Rad Universal Hood II, GelDoc-It Imaging System；API生化鑒定系統(tǒng)為法國梅里埃公司產(chǎn)品。2× Es Taq Master Mix和細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；API ID32E試劑條購自法國梅里埃公司。

1.4 方法

1.4.1 采樣：選取上海5家不同的斑馬魚單位，各采斑馬魚20尾，共計采樣100尾。所有斑馬魚均在采樣地現(xiàn)場確認(rèn)活體，按采樣的飼養(yǎng)系統(tǒng)或水族箱分別標(biāo)號，依次為1-1#～20#，2-1#～20#，3-1#～20#，4-1#～20#，5-1#～20#。

1.4.2 檢樣方法：參照OIE Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals(OIE水生動物疫病診斷手冊，下文簡稱OIE手冊)中魚類病原體指標(biāo)及魚類常見病原體，即嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、海魚分支桿菌、黃桿菌、鏈球菌和銅綠假單胞菌等共計6種病原體指標(biāo)，對其進行分離培養(yǎng)鑒定及分子生物學(xué)檢測。

1.4.3 病原菌的分離培養(yǎng)及鑒定：無菌操作條件下取斑馬魚體表病灶組織及腹腔器官團進行組織勻漿，利用接種環(huán)平板劃線法接種于羊血平皿和NAC液體培養(yǎng)基，于30℃條件下恒溫培養(yǎng)10～24 h，觀察細(xì)菌的生長狀況及菌落特征。采用ID32E微量多項試驗鑒定系統(tǒng)對細(xì)菌純培養(yǎng)物進行生理生化試驗的檢測。

NAC液體培養(yǎng)基中均勻混濁生長、有菌膜或培養(yǎng)基中有綠色色素，部分菌株延長培養(yǎng)時間可產(chǎn)生色素，即可轉(zhuǎn)接到NAC平皿中42℃培養(yǎng)，純培養(yǎng)物可進行生理生化鑒定。

1.4.4 PCR鑒定：以魚體組織和水樣中分離純化所得的菌株制作模板。選擇黃桿菌屬、分枝桿菌屬、鏈球菌屬以及氣單胞菌屬等斑馬魚常見病原菌所屬的種屬特異性引物，分別對純培養(yǎng)的分離株進行PCR篩選。具體引物序列如表1所示。

表1 引物序列及擴增產(chǎn)物大小

PCR反應(yīng)體系：DNA模板1 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，2× Es Taq Master Mix10 μL，滅菌ddH2O 5 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min， 94℃變性45 s，退火溫度梯度范圍為45～60℃，退火時間45 s，72℃延伸，時間梯度范圍設(shè)定為30～60 s，共設(shè)35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.4.5 人工感染實驗：將平均體長約為4 cm，平均體重0.7～0.9 g斑馬魚隨機進行分組，每組6條，移至感染實驗室飼養(yǎng)以適應(yīng)環(huán)境。按1∶100比例轉(zhuǎn)接，30℃恒溫培養(yǎng)4～10 h至菌液渾濁后，利用分光光度計測量菌液A600值并控制在0.8～1.0的范圍內(nèi)，12 000 r/min離心1 min，棄上清液，收集菌體，用PBS洗1次，細(xì)菌懸液濃度調(diào)節(jié)為1×1010CFU/mL，注射劑量為10 μL/條，采用腹腔注射的方法感染斑馬魚，并設(shè)置1組PBS對照組。實驗周期內(nèi)，注意隨時觀察斑馬魚的活力、攝食、發(fā)病癥狀和死亡情況，并及時做好相關(guān)記錄。

2 結(jié)果

2.1 菌落形態(tài)特征

不同樣品在羊血平皿上長出同一種菌落，編為同一個細(xì)菌標(biāo)號Z1～Z5。其中 Z1分離于1-3#，3-5#，5-15#；Z2分離于1-11#、20#，3-3#，4-13#，5-1#；Z3分離于1-5#；Z4分離于2-7#；Z5分離于4-10#。

在羊血平皿上挑取可疑菌落純化培養(yǎng)，涂片鏡檢均為革蘭氏陰性桿菌?？梢删鋃1菌落邊緣整齊，中央凸起，濕潤有光澤、灰白色、溶血。Z2菌落表面光滑、中央微微凸起、圓整、無色，并有特殊芳香氣味，β溶血。Z3在NAC平皿上菌落扁平，邊緣不齊鋸齒狀，并產(chǎn)生綠色色素，42 ℃可以生長。Z4菌落表面光滑，邊緣整齊，圓形，濕潤，呈不透明淡黃色，菌落偏小。Z5菌落邊緣光滑整齊，中央凸起，生長良好，溶血。

2.2 生化鑒定

采用ID32E微量多項試驗鑒定系統(tǒng)分別分離株純培養(yǎng)物進行生理生化特征的檢測，其自動鑒定結(jié)果顯示Z1～Z5依次對應(yīng)為：溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、銅綠假單胞菌，類志賀鄰單胞菌和泛菌屬2其主要生理生化特征如表2所示。

表2 可疑菌株的生理生化鑒定結(jié)果

注：“+”表示陽性；“-”表示陰性

Note.“+”means positive reaction; “-” means negative reaction

2.3 PCR鑒定

將純培養(yǎng)后的Z1～Z5菌作為模版，利用黃桿菌屬、分枝桿菌屬、鏈球菌屬以及氣單胞菌屬4類細(xì)菌種屬的特異性引物進行PCR擴增，僅Z1、Z2擴增出了目的條帶，與氣單胞菌屬的目標(biāo)產(chǎn)物大小相一致，具體如圖1所示。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序，確定鑒定可靠。

注：M：DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；-：陰性對照； +：陽性對照；Z1、Z2: 分離株Z1和Z2。圖1 Z1～Z2 PCR擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果Note. M: DL2000 DNA marker; -: negative control; +: positive control; Z1, Z2: the Z1 and Z2 isolates.Fig.1 Electrophoretic results of PCR amplification products from the Z1 and Z2 isolates

確定可疑菌株中僅有Z1～Z3為所需檢測病原體，其中Z1溫和氣單胞菌，Z2為嗜水氣單胞菌，Z3為銅綠假單胞菌。

2.4 人工感染斑馬魚

以檢測分離菌株Z1～Z3感染斑馬魚，以確定分離株的致病力強弱。感染實驗周期內(nèi)觀察并記錄斑馬魚的活力、攝食、發(fā)病癥狀和死亡情況，可初步判斷出Z1～Z3菌株對斑馬魚的致病性強弱，臨床表現(xiàn)為：Z1實驗組存在斑馬魚個體出現(xiàn)食欲減退，活動緩慢，尾部發(fā)紅，尾鰭受損且無法正?；顒拥牟“Y，10 d內(nèi)全部存活，提示該菌致病力較弱；Z2實驗組感染的斑馬魚，出現(xiàn)食欲不振，游動緩慢，腹部紅腫等病癥，24 h內(nèi)死亡率為75%，提示該菌株為一種較強的致病菌；Z3實驗組感染的斑馬魚，體表正常，活動緩慢，食欲減退，未見明顯異常癥狀，10 d內(nèi)全部存活，初步判定為一種非致病菌或者條件致病菌。由此可見嗜水氣單胞菌為致病性嗜水氣單胞菌，具有較強的致病力，可能是引發(fā)實驗室斑馬魚患病的主要病原菌。溫和氣單胞菌能夠引起斑馬魚臨床病癥，但致病力較弱。銅綠假單胞菌能夠引起斑馬魚食欲不振等輕微癥狀，提示其為條件致病菌，并無需監(jiān)控。

3 討論

斑馬魚作為近年來新興的一種非常有價值的模式生物，其健康狀態(tài)常受到水體中病原體的影響，其中最重要的是病原菌[7, 8]。目前所發(fā)現(xiàn)的斑馬魚常見致病菌主要包括分支桿菌、黃桿菌、嗜水氣單胞菌及溫和氣單胞菌等。為了確保用于科學(xué)實驗的斑馬魚質(zhì)量，定期對斑馬魚進行細(xì)菌學(xué)監(jiān)測，并建立起疾病快速準(zhǔn)確的診斷方法顯得非常重要。

已知病原體的經(jīng)典檢測方法是分離培養(yǎng)鑒定確診耗時耗力，不便于多個指標(biāo)同時開展檢測[9]。本實驗考慮到大多數(shù)實驗室無法收集完備的病原體或相應(yīng)的診斷抗體作為對照，并且某些病原體對于培養(yǎng)所需的細(xì)胞株還有特定要求，故選用核酸診斷中的PCR方法處理可疑樣品。本方法無需特殊的病原體或抗體對照，同時結(jié)合PCR產(chǎn)物測序方法以作為PCR方法的驗證。

本文監(jiān)測工作中魚體主要檢出嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌。嗜水氣單胞菌同樣可能造成對養(yǎng)魚設(shè)備和水體的污染。由于銅綠假單胞菌為條件性致病菌，對斑馬魚危害較小，可以不作為監(jiān)控的病原菌。致病性嗜水氣單胞菌可感染人類，須引起重視做好操作人員的防護和培訓(xùn)[10, 11]。

斑馬魚易受水質(zhì)的影響，因此對水的監(jiān)測也應(yīng)該引起重視并建立監(jiān)測方法。控制斑馬魚質(zhì)量應(yīng)該從以下幾個方面著手，首先應(yīng)規(guī)范實驗室引魚流程，只引入被認(rèn)可的斑馬魚，引入時盡量以魚卵的形式方便消毒，切斷病原體來源；如若引入幼魚或成魚應(yīng)在隔離檢疫后，才能于本魚房的魚合群。其次，養(yǎng)魚飼料必須能排除病原體，并采用過濾消毒的水體養(yǎng)魚。最后要注意的是成魚應(yīng)定期做常規(guī)病原體檢測，試驗前后應(yīng)根據(jù)具體試驗抽樣進行必要的病原體檢測。

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Monitoring of pathogenic bacteria in zebrafish

FENG Li-ping, YANG Chi, LIN Jin-xing, HU Jian-hua

(Shanghai Laboratory Animal Research Center, Shanghai 201203, China)

Objective To conduct an epidemiological investigation of several pathogens in zebrafish, and to provide the basis for subsequent development of relevant standards. Methods This study mainly used traditional methods based on morphological, physiological and biochemical characteristics of bacteria, combined with molecular biology methods, to isolate bacteria and artificially infect healthy zebrafish with the bacteria. Through investigating the incidence and mortality in the experimental group, we distinguished the virulent effect of the pathogens, and further understanding the pathogens affecting the health of zebrafish. Results There were three kinds of pathogens identified in all sampling institutions, including pathogenicAeromonashydrophila,AeromonassobriaandPseudomonasaeruginosa.Aeromonashydrophilawas detected in most sampling institutions, and showed to possess strong virulence.AeromonassobriaandPseudomonasaeruginosawere detected in some sampling institutions, and the virulence ofAeromonassobriawas revealed to be weaker than that ofAeromonashydrophila. The virulence ofPseudomonasaeruginosawas the weakest among these three bacteria, did not induce typical clinical symptoms and death in the zebrafish. ConclusionsAeromonashydrophilamay cause contamination of fish experimental facilities, and it has been shown to be potentially able to infect humans. Thus regarding the fish infection routes, enough attention should be payed toAeromonashydrophila, and it should be the focus in the pathogens monitoring.

Zebrafish; Pathogen detection; PCR identification; Artificial infection;

國家科技支撐計劃課題(No.2013BAK11B02)和上海市科技發(fā)展基金(No.15140901000)資助。

馮麗萍，女，碩士，助理研究員，研究方向：斑馬魚質(zhì)量控制，Email：flp2013@foxmail.com。

胡建華，男，研究員，主要從事實驗動物質(zhì)量控制研究，Emial：jhhu@live.cn。

R-33

A

1671-7856(2017) 02-0025-04

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.02.005

2016-06-16