洪焜，刁乃超，李建明，時坤*，杜銳,3*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科技技術學院，長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，長春 130118；3.教育部動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，吉林省梅花鹿生產(chǎn)與產(chǎn)品應用研究室，長春 130118)

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反向遺傳操作技術在瘟病毒屬研究中的應用

洪焜1，刁乃超1，李建明2，時坤2*，杜銳2,3*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科技技術學院，長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，長春 130118；3.教育部動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，吉林省梅花鹿生產(chǎn)與產(chǎn)品應用研究室，長春 130118)

反向遺傳操作技術已經(jīng)成為研究瘟病毒屬的一條有效的途徑。針對反向遺傳技術在瘟病毒屬基因結構和功能研究、致病機制研究和新型疫苗研制中的應用以及瘟病毒屬的感染性克隆策略的選擇進行了綜述，以期為預防、控制和消滅瘟病毒屬病毒提供參考。

反向遺傳操作技術；瘟病毒屬；致病機制；應用

瘟病毒屬(Pestivirus)屬于黃病毒科(Flaviviridae)，包括典型的豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)、牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)、綿羊邊界病毒(Border disease virus，BDV)[1]、非典型的Hobi樣病毒(Hobi-like virus)[2]、Bungowannah瘟病毒(Bungowannah virus)[3]等。由CSFV和 BVDV引起的豬瘟和牛病毒性腹瀉-粘膜病給各國畜牧業(yè)造成了嚴重的危害和經(jīng)濟損失[4]。瘟病毒屬病毒的全基因組為單股正鏈RNA，長度約為12.3 kb，兩端包含5′非編碼區(qū)(untranslated region，UTR)和3′非編碼區(qū)(UTR)，中間是一個大的開放性閱讀框架(open reading frame，ORF)；ORF翻譯成含約3898個氨基酸殘基、分子量約438 kD的多聚蛋白，在病毒和宿主細胞酶的作用下加工成結構蛋白C、Erns、E1、E2和非結構蛋白Npro、p7、NS2-3(NS2，NS3)、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B[5]。

反向遺傳學通常是在獲得生物基因信息的基礎上，建立一個基因組的全長cDNA感染性克隆，對基因有目的地進行定點突變、基因的插入/缺失和基因置換等重組操作，來研究生物基因結構和功能的策略；其目的是研究病毒的復制，病毒蛋白的功能，病毒重組的發(fā)生率，病毒與宿主相互作用以及防治病毒策略和研發(fā)標記疫苗等[6]。

1 反向遺傳技術在瘟病毒屬研究中的應用

1.1 在瘟病毒屬基因組結構和功能研究中的應用

Moormann等通過反向遺傳操作技術成功構建了瘟病毒屬CSFV的第一個感染性cDNA克隆，同年Meyers 等成功構建了BVDV感染性cDNA克隆，并都得到了各自的感染性病毒粒子[7-8]。Pankraz等通過對感染性BVDV cDNA克隆的3′UTR的莖環(huán)結構引入堿基的缺失，去研究基因3′UTR的功能，發(fā)現(xiàn)3′UTR調(diào)節(jié)基因的復制[9]。

Mischkale等在BVDV-2 890株全長cDNA感染性克隆p890的基礎上通過基因缺失構建了BVDV-2 890株C蛋白基因的缺失克隆p890△C，體外轉(zhuǎn)錄后的p890△C RNA轉(zhuǎn)染細胞，發(fā)現(xiàn)病毒亞基因組的自主復制和病毒蛋白表達，但未獲得感染性病毒粒子；但是把p890△C RNA轉(zhuǎn)染進能穩(wěn)定表達BVDV-1蛋白C-Erns-E1-E2的互補細胞WT-R2，在72 h后能檢測到病毒的自主復制，在轉(zhuǎn)染后的上清和轉(zhuǎn)染的細胞傳代中存在感染性假病毒粒子v890△C-trans，但是v890△C-trans不能在沒有互補的KOP-R細胞上傳代[10]。Gladue等通過酵母雙雜交系統(tǒng)對CSFV的C蛋白基因的OS9結合位點進行替換，得到的重組CSFV在豬實驗沒有發(fā)現(xiàn)毒力的改變，但是在細胞培養(yǎng)中能顯著降低病毒復制效率[11]。

Risatti等通過反向遺傳技術構建了CSFV高致病性Brescia株和減毒疫苗CS株的嵌合體，又構建了含BVDV NADL株E2的同源氨基酸序列的Brescia突變體去研究E2糖蛋白的毒力作用，發(fā)現(xiàn)在E2基因特定位置的氨基酸替換能導致CSFV毒力的部分或完全衰減[12-13]。Fahn?e等對CSFV Koslov 株全長cDNA克隆的氨基酸序列重組，并在豬上實現(xiàn)病毒拯救，發(fā)現(xiàn)在Koslov株E2蛋白的兩個單一氨基酸(S763L和P968H)的變化，導致病毒感染豬時感染能力的衰減，在非結構蛋白NS3的單一氨基酸(D2183G)的突變能減少病毒在體外細胞內(nèi)生長[14]。

Tratschin等在CSFV Alfort/187株感染性克隆的基礎上用鼠泛素基因代替Npro基因，得到重組病毒vA187-Ubi，發(fā)現(xiàn)Npro對病毒的復制不是必須的[15]。Mischkale等構建了BVDV 890株的全長cDNA感染性克隆p890和缺失克隆p890△Npro，得到感染性病毒粒子v890FL和缺失Npro基因的病毒粒子v890△Npro，發(fā)現(xiàn)v890FL與親本毒株生長特性相似；而v890△Npro與親本毒株相比，生長速度明顯偏低，表明Npro蛋白對病毒的復制不是必須的，但能影響病毒的生長[10]。陶潔構建了BVDV SH-28株的全長cDNA感染性克隆，和缺失Npro基因的亞克隆，得到感染性病毒vASH和缺失Npro基因病毒vASH△Npro，發(fā)現(xiàn)vASH△Npro的復制速度遠低于vASH和親本病毒；進一步研究發(fā)現(xiàn)Npro的過量表達可顯著抑制MDBK細胞內(nèi)抗病毒蛋白OAS、Mx1和ISGIS的表達，而缺失Npro蛋白后胞內(nèi)抗病毒蛋白OAS、Mxl和ISG15的表達量顯著增加，可能是Npro影響復制的原因[16]。

NS2蛋白對病毒RNA復制和感染性病毒產(chǎn)生是重要的。Ling L等構建了含有海腎熒光素酶2A(Rluc2A)報告基因的CSFV嵌合cDNA克隆pA187-Rluc，并對NS2的N端的幾個代表性的保守殘留序列進行了基因突變；發(fā)現(xiàn)在NS2的N-末端的2個天冬氨酸(NS2/D60A或NS2/D60K和NS2/D78K)的突變導致感染性病毒不能產(chǎn)生，并且在NS2100處的丙氨酸(NS2/R100A)被精氨酸取代后導致病毒滴度顯著降低。含有突變病毒基因組RNA分子(NS2/A60D、NS2/K60D和NS2/K78D)的細胞在連續(xù)傳代后，產(chǎn)生恢復突變，導致感染性病毒的恢復。在NS2/R100A突變體上游NS2/I90L的突變能恢復感染性病毒產(chǎn)生。揭示CSFV的NS2N-末端在調(diào)節(jié)病毒RNA中的新功能，NS2的氨基酸殘基在RNA復制水平上發(fā)生作用[17]。Risager等在大腸桿菌內(nèi)對含有CSFV全長病毒cDNA的細菌人工染色體(Bacterial artificial chromosome，BAC)通過進行靶向重組修飾，添加熒光素酶(Rluc)報道序列，體外轉(zhuǎn)錄RNA并通過電穿孔轉(zhuǎn)染細胞。通過熒光素酶蛋白表達的積累以及檢測胞內(nèi)的CSFV NS3蛋白產(chǎn)生去檢測RNA的翻譯和復制。發(fā)現(xiàn)復制子中包含的病毒E2編碼區(qū)對于復制效率是有利的。用來自高毒力的Koslov株或疫苗株Riems的等同序列取代來自Paderborn株的NS2和NS3編碼區(qū)的嵌合RNA，復制被阻斷[18]。

Tamura等構建了CSFV的GPE-疫苗株與高毒力Eystrup株的NS4B嵌合病毒復制子，發(fā)現(xiàn)攜帶完整Eystrup NS4B基因嵌合低毒力GPE-衍生的病毒在豬中致病性增強。嵌合GPE-NS4B復制子的體外復制效率顯著高于在NS4B中僅攜帶兩個Eystrup特異性氨基酸的復制子。發(fā)現(xiàn)NS4B的N-末端結構域可以確定細胞培養(yǎng)中的CSFV基因組復制和在豬中的病毒致病性[19]。

Sheng Chun等構建了CSFV Shimen株全基因克隆，并在病毒cDNA相應的NS5B、NS3、NS5A位置進行突變，發(fā)現(xiàn)NS5B上的依賴RNA的RNA聚合酶(RdRp)活性位點的突變能使CSFV病毒包裝失敗，額外添加 NS5B 不能使病毒的可育性恢復，但NS5A 卻可以用反式作用因子發(fā)揮作用[20]。姬偉等通過對CSFV疫苗C株基因組NS5B分段改造后，結果發(fā)現(xiàn)該病毒復制、包裝失敗，將NS5B從基因組缺失之后額外補充NS5B 同樣不能恢復病毒的可育性。可能是因為 NS5B 上有CSFV復制或組裝所需的順式作用元件，其缺失后導致缺失該基因的部分不能復制或正常組裝到子代病毒[21]。Risager等用來自Koslov株的RNA聚合酶編碼序列替換Paderborn 株NS5B編碼序列能大大增強了復制子報道蛋白的表達。相比之下，用Riem NS5B序列替換顯著降低復制子的復制效率[18]。

1.2 在瘟病毒致病機制研究中的應用 Tamura等從豬扁桃體分離出的弱化疫苗CSFV “GPE-”株在傳11代后的GPE-/P-11病毒存在E2(T830A)、NS4B (V2475A和A2563V) 3個氨基酸突變位點，用反向遺傳學重建了這3個氨基酸突變的病毒，通過在豬的感染性實驗證實這3個氨基酸取代是致病性下降的原因，而且E2中基因的置換影響病毒擴散，并且NS4B的改變增強了病毒RNA的復制[22]。

Wu Rd等以高毒力CSFV的Shimen株 (vSM)為主干，構建的包含CSFV疫苗C株E2基因的嵌合病毒(CSFV) vSM/CE2，在豬的攻毒實驗中出現(xiàn)毒力的致弱，但是vSM/CE2在PK15細胞中傳了幾代后毒力能被恢復，進一步研究發(fā)現(xiàn)，vSM/CE2第11代的突變體vSM/CE2-p11在E2的T745I和M979K處有2個氨基酸突變。通過感染豬的試驗表明在M979K氨基酸的置換是致病性改變的主要原因。體外研究表明，E2的T745I和M979K能增加感染性病毒的復制和產(chǎn)生。同時發(fā)現(xiàn)，位于E2蛋白的745和979位置的2個氨基酸殘基對嵌合病毒(CSFV)vSM/CE2體外的復制和體內(nèi)的致病性改變是重要的[23]。

Velazquez-Salinas等通過基因突變構建了CSFV強毒株Brescia(BICv)株E2基因的4個不同的突變克隆(pCSFm1～pCSFm4)，但只有三個克隆產(chǎn)生了感染性病毒粒子(CSFm2v、CSFm3v和CSFm4v)。豬感染CSFm2v后呈現(xiàn)病毒血癥減少和擴散，但沒有顯現(xiàn)出任何與豬瘟(CSF)相關的臨床癥狀，原因是在感染豬后，CSFm2v復制能力與親本BICv相比嚴重下降。動物感染CSFm2v后檢測到動物感有病毒血癥的減少和擴散，但沒有顯示任何豬瘟(CSF)相關的臨床癥狀，并能耐受親本病毒BICv的攻毒[24]。

Tamura等通過活減毒CSF疫苗株GPE-的全長cDNA感染性克隆體外拯救了多個含有Npro突變和缺失Npro的病毒，并接種豬，發(fā)現(xiàn)攜帶在Npro的N136D取代的病毒恢復了降解IRF3和體外抑制IFN-α/β誘導的能力。并且在豬中，Npro顯著降低淋巴器官中的局部IFN-α mRNA表達，同時增加循環(huán)中IFN-α/β的量，并增強中等毒性病毒的致病性。缺失Npro可以減少毒性和誘導免疫無特定病原體(SPF)的豬[25]。Lamp B等將以CSFV p447株為模板的NS3突變序列插入到cp CSFV復制子克隆 p447rep中，得到NS3編碼區(qū)突變的病毒，發(fā)現(xiàn)NS3的編碼區(qū)是瘟病毒屬基因組復制和編碼的一個關鍵組件；NS3編碼區(qū)突變，并不直接影響病毒基因組的復制速度[26]。Fahn?e等在研究CSFV高毒力的Koslov株時，從感染Koslov株的豬血液中提取RNA，得到非功能性的cDNAs，通過逐步定點突變，消除非同義突變,得到了與CSFV高毒力株Koslov全部功能性一致的CSFV的cDNA。通過感染豬的實驗，發(fā)現(xiàn)通過功能cDNA重組得到的病毒在強毒力上與親本病毒(Koslov株)一致，伴隨著感染動物出現(xiàn)明顯的臨床癥狀并導致高的死亡率，證明了幾個氨基酸的改變能有效改變病毒的功能，在自然宿主動物上降低病毒的毒力[14]。

1.3 在新型疫苗研制中的應用 反向遺傳操作技術已經(jīng)成為研究新型疫苗的實用的工具，如研發(fā)標記疫苗，減毒疫苗，嵌合疫苗等。Holinka LG等構建了CSFV的FlagT4v 株的雙抗標記疫苗，在FlagT4v的E1處插入19mer，作為陽性標記，并在E2處引入單克隆抗體WH303(mAbWH303)表位的結合位點作為陰性標記，用于區(qū)分天然感染的和接種的豬，突變FlagT4v在接種豬后的早期(2 d或3 d)和后期(28 d)的豬能CSFV Brescia株感染，F(xiàn)lagT4V在豬中誘導的抗體反應對Flag?表位強烈反應，但不能抑制mAbWH303與代表WH303表位的合成肽的結合[27]。付強等通過構建具有T7 RNA聚合酶活性和較好穩(wěn)定性的MDBK-T7RNAP細胞，構建了BVDV NADL毒株的E2和NS4B定點突變株BVDV E2M和NS4BM；與親本NADL株相比，BVDV E2M和NS4BM mRNA的復制水平能力和增殖能力有所下降；并且得到的BVDV點突變株 E2M和NS4BM具有好的遺傳穩(wěn)定性[28]。

Li Yongfeng等以高毒性CSFV石門株的遺傳背景構建了含有EGFP標簽和自疫苗株HCLV(C株)3′UTR的標記嵌合病毒。標記嵌合病毒與僅有EGFP標簽的重組CSFV病毒或親本病毒相比，有低約100倍的病毒滴度，更低的病毒基因組復制水平和更弱的熒光強度。并且標記嵌合體在接種的豬后沒有顯示病毒血癥，接種15 d后能免于致死性CSFV攻擊[29]。

高飛等在高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)細胞致弱疫苗株HUN4-F112的全長感染性克隆上，插入CSFV疫苗株C株的E2基因，得到能表達豬瘟C株E2蛋白的重組PRRSV vA-C-E2。重組病毒vA-C-E2傳代過程中至少在20代保持遺傳穩(wěn)定；且發(fā)現(xiàn)此突變病毒與親本病毒vHuN4-F112在病毒滴度、空斑形態(tài)、蛋白表達等方面差異不顯著；在病毒的峰滴度和病毒增殖趨勢上相似[30]。董超等在CSFV疫苗C株和強毒石門株感染性克隆的基礎上，對兩個毒株不同蛋白區(qū)段進行相互置換，構建了一系列重組嵌合病毒，發(fā)現(xiàn)非結構蛋白NS2-NS4B區(qū)以及NS2跨膜區(qū)域?qū)ωi瘟病毒的增殖是重要的，在疫苗C株基因組兩端的UTR以及結構蛋白區(qū)域能夠介導兔體發(fā)熱反應[31]。

2 感染性克隆策略的選擇

目前，國內(nèi)外構建感染性克隆構建方法，主要有典型的細菌質(zhì)粒載體重組策略、基于細菌人工染色體(BAC)重組策略和酵母菌的重組策略。由于瘟病毒屬的基因組對大腸桿菌質(zhì)粒載體具有毒性，存在不穩(wěn)定性，所以典型的瘟病毒屬全長cDNA克隆大都需在細菌低拷貝質(zhì)粒載體中構建，但是重組克隆質(zhì)粒在大腸桿菌傳代過程中也存在不穩(wěn)定性。

2.1 基于細菌人工染色載體的克隆 BAC載體已經(jīng)被用于多種病毒全基因感染性克隆的構建，如人巨細胞病毒(HCMV)等[32]。Rasmussen等通過RT-PCR擴增與參考毒株基因一致的全長CDNA復制子，插入到單拷貝的BAC載體pBeloBAC11的策略，構建了4個病毒(BVDV-CP7、BDV-Gifhorn、CSFV-C、CSFV-Paderborn)的全長cDNA克隆[33]。Risager PC等通過BAC構建CSFV的復制子去分析影響病毒RNA復制的因素[19]。Kamboj等通過over-lap PCR和重組技術在BAC載體構建了CSFV野生分離株感染性cDNA克隆，通過使用CSFV特異多克隆血清的FAT實驗和RT-PCR對拯救出的vCSFV與親本CSFV進行分析，發(fā)現(xiàn)兩者的特性相似[34]。

2.2 基于酵母同源重組的克隆 酵母菌同源重組的方法已經(jīng)應用在多種病毒的cDNA克隆的構建，如登革熱病毒[35]。與其他重組DNA技術相比，酵母菌同源重組克隆是一個有效率的和節(jié)約成本的方法，酵母菌同源重組中，需DNA片段末端含有與載體末端同源的序列，兩者在宿主細胞內(nèi)經(jīng)過同源重組能直接克隆[36]。Arenhart等通過酵母同源重組在非致細胞病變型 BVDV的Npro和C蛋白編碼區(qū)插入Gluc報告基因，構建全長cDNA克隆，得到能表達Gluc報告基因且能復制的病毒，拯救病毒在細胞培養(yǎng)中能穩(wěn)定傳15代以上，與母本的病毒復制動力學，大小，形態(tài)學保持相似性；通過Gluc活性檢測證明了報告蛋白能正確表達，表明基因增加了555 bp后在酵母菌重組中能被簡單組裝并且cDNA克隆能穩(wěn)定表達[37]。Arenhart等又通過酵母同源重組技術把BVDV NADL株的兩端的UTRs和巴西BVDV IBSP4ncp株的ORF的連接起來，成功得到BVDV的嵌合cDNA感染性克隆，通過病毒拯救，得到了能擴增的病毒IBSP4ncp，病毒IBSP4ncp在復制動力學、大小和形態(tài)學上與親本病毒具有相似性。而且病毒IBSP4ncp能夠在細胞培養(yǎng)中能夠穩(wěn)定傳10代，并且在細胞中能維持其復制能力不被改變[38]。

3 展 望

隨著反向遺傳操作技術在基因組操作中的出現(xiàn)，推進了瘟病毒屬病毒研究的發(fā)展。我們就反向遺傳技術在過去和當前在瘟病毒屬的研究和應用展開描述，雖然對病毒的復制和翻譯的研究已經(jīng)有很多，但是病毒蛋白質(zhì)的機制研究仍處于起步階段。反向遺傳技術可能為瘟病屬的急需解決的問題如疾病防治、致病機制、持續(xù)性感染機制、疫苗研究等提供一個實用的工具。我們認為關鍵的是通過該技術推進瘟病屬的病毒毒力、病毒種群適應性、病毒致病機制，病毒疫苗方面的研究。通過整合反向遺傳技術、動物實驗，設計新穎的宿主細胞等方法的優(yōu)點，對下一代疫苗的開發(fā)、應對未來瘟病毒屬乃至其他黃病毒科的病毒爆發(fā)是至關重要的。

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(編輯：李文平)

Application of Reverse Genetics Technology inPestivirusResearch

HONG Kun1, DIAO Nai-chao1, LI Jian-ming2, SHI Kun2*, DU Rui2,3*

(1.CollegeofAnimalScience&Technology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China; 2.CollegeofChineseMedicineMaterials,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China; 3.KeyLaboratoryofAnimalProduction,ProductQualityandSecurity,MinistryofEducationofthePeople’sRepublicofChina,LaboratoryofProductionandProductApplicationofSikaDeerofJinlinProvince,Changchun130118,China)

SHIKun,E-mail:sk1981521@126.com;DURui,E-mail:104974602@qq.com

In this paper, the application of reverse genetics in the study of the structure and function, the pathogenic mechanisms, the novel vaccines ofPestivirus, and the selection of infectious cloning strategies ofPestivirushas reviewed in order to provide reference for the prevention, control and eradication ofPestivirus.

reverse genetics technology;Pestivirus; pathogenesis; application

國家自然科學基金(31372436)；吉林省科技廳產(chǎn)業(yè)聯(lián)盟項目(2014030918YY)；吉林農(nóng)業(yè)大學校內(nèi)啟動基金(201425) 作者簡介： 洪焜，男，碩士研究生，從事經(jīng)濟動物疫病研究。

時坤，E-mail: sk1981521@126.com；杜銳，E-mail: 104974602@qq.com

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.7.11

2017-01-17

A

1002-1280 (2017) 07-0057-07

S852.65