李元新 劉來利 王必成 馮玲霞 張鵬岳

（甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅平?jīng)?744000）

家畜C型肉毒梭菌脫毒干粉苗研制及免疫效果觀察

李元新 劉來利 王必成 馮玲霞 張鵬岳

（甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅平?jīng)?744000）

采用具有良好免疫原性的菌株Nb6514，成功研制牛羊C型肉毒梭菌脫毒干粉苗。用其免疫牛羊血清作小白鼠體外中和試驗(yàn)進(jìn)行免疫效果和免疫期測定。結(jié)果顯示：免疫組牛羊體重可抗62000個/kg小白鼠MLD（全部健活），而對照組牛羊按體重抗17500個/kg小白鼠致死量（全部死亡），試驗(yàn)證實(shí)，牛羊免疫后21d左右，即可產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)免疫力；免疫10d的牛羊均可抗10個小鼠最小致死量/ml血清；30d分別可抗28～260和18～220個最小致死量/ml血清；180d達(dá)到高峰，分別可抗300～1500和200～1100個小白鼠最小致死量/ml血清；至550（一年半）仍可抗10個最小致死量/ml血清，結(jié)果表明免疫期在一年以上。研制的牛羊C型肉毒梭菌脫毒干粉苗具有良好的免疫效果，能有效預(yù)防牛羊C型肉毒梭菌中毒癥。

牛 羊 C型肉毒梭菌 干粉苗

肉毒梭梭菌（C.botulinum），也稱肉毒梭狀芽孢桿菌，為自養(yǎng)型革蘭氏陽性厭氧菌。動物C型肉毒梭菌中毒癥最初由Seddon氏發(fā)現(xiàn)并證明，肉毒中毒分布于世界各地，多呈散發(fā)，偶有群發(fā)。我國主要分布在新疆、西藏和甘肅西部等地區(qū)，其他地區(qū)偶有散發(fā)病例，發(fā)病主要以青壯年牛羊?yàn)橹?，病死率高，常?guī)治療無效。C型肉毒梭菌苗在我省應(yīng)用后，免疫效果良好，對牛羊的C肉毒梭菌中毒癥得到了有效的控制。但因注射劑量大（牛10ml、羊4ml），給預(yù)防注射帶來一定的困難，菌苗生產(chǎn)成本也較高。為此進(jìn)行了牛羊C型肉毒梭菌干粉苗的試驗(yàn)研究，現(xiàn)報告如下：

1 材料與方法

1.1 種毒

中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定為C型肉毒梭菌菌株Nb6514。

1.2 試驗(yàn)動物

試驗(yàn)動物：豚鼠，體重300～400g；家兔，體重1.5～2.0kg；小白鼠，體重18～22g。

1.3 菌液培養(yǎng)

制苗用培養(yǎng)基魚（或牛）肉胃酶消化肉肝湯培養(yǎng)基，用玻璃瓶培養(yǎng)法進(jìn)行生產(chǎn)，每ml菌液對小白鼠的致死量不低于5萬個，種子培養(yǎng)、純檢、殺菌脫毒等方法均按部頒“規(guī)程”進(jìn)行。

1.4 干粉苗的制造

在完成脫毒滅活后，采用70%硫酸銨飽和溶液提取毒素，冷凍干燥后保存分裝。按14～16g小白鼠測毒培養(yǎng)液毒力50000MLD/ml的濕苗制苗標(biāo)準(zhǔn)，和提取干粉毒的重量折算干毒素的毒力含量，確定干粉苗每頭份的干毒重量。經(jīng)過計(jì)算確定出干毒重量。羊：18mg/頭份，牛：每30mg/。干粉苗的稀釋劑采用20%的氫氧化鋁膠生理鹽水。其他成品各項(xiàng)檢驗(yàn)、用途、用量（用量可根據(jù)毒力提高而降低，是一個優(yōu)點(diǎn)）等同濕苗。

1.5 成品檢驗(yàn)

1.5.1 無菌檢驗(yàn)：按“規(guī)程”進(jìn)行，厭氣肉肝湯應(yīng)加新鮮生肝塊。

1.5.2 安全檢驗(yàn)：用5個免疫劑量的干粉苗注射體重300～350g豚鼠4只，觀察21d。

1.5.3 效力檢驗(yàn)：對不同批次的牛羊肉毒梭菌（C型）干粉劑苗用體重1.5～2kg家兔4只，各皮下注射1ml。21d后連同條件相同的對照兔2只，各靜脈注射10個致死量的毒素，觀察14d。

1.6 免疫效果測定

試驗(yàn)牛羊分為免疫組和對照組，干粉苗分別注射牛30mg/頭和羊18mg/只，經(jīng)10至20d后分別采血作中和試驗(yàn)，用血清能抗10個/ml小白鼠MLD用C型肉毒梭菌毒素按動物體重計(jì)量進(jìn)行攻毒。

1.7 免疫期測定

用免疫牛羊血清作小白鼠體外中和試驗(yàn)，分別在10d、30d、180d、550d進(jìn)行抗體效價測定。

2 結(jié)果

2.1 無菌檢驗(yàn)

觀察發(fā)現(xiàn)，接種干粉苗硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（T.G）小管、酪胨瓊脂斜面（G.A）和葡萄糖蛋白胨湯（G.P）及厭氣肉肝湯培養(yǎng)基均無細(xì)菌生長。無菌檢驗(yàn)合格。

2.2 安全檢驗(yàn)

3批干粉苗接種檢驗(yàn)用豚鼠后，試驗(yàn)豚鼠食欲正常，精神狀態(tài)良好，10d后觀察注射部位無壞死，均健活，安全檢驗(yàn)合格。

2.3 效力試驗(yàn)

三個批次其中二個批次對10個致死量的C型肉毒梭菌毒素的保護(hù)率為100%，一個批次對10個致死量的C型肉毒梭菌毒素保護(hù)率為80%，對照組的死亡率為100%.

2.4 免疫效果測定

免疫組牛羊體重可抗62000個/kg小白鼠MLD（全部健活）；而對照組牛羊按每公斤體重抗17500個小白鼠鼠致死量，則全部死亡。試驗(yàn)證實(shí)，牛羊經(jīng)過免疫后21d左右，即可產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)免疫力。

2.5 免疫期測定

結(jié)果顯示，免疫10d的牛羊均可抗10個/ml小鼠最小致死量；30d分別可抗28～260和18～220個/ml最小致死量血清；180d達(dá)到高峰，分別可抗300～1500和200～1200個/ml小白鼠最小致死量血清；至550（一年半）仍可抗10個/ml最小致死量血清。從干粉苗抗體效價動力態(tài)消長規(guī)律上可以看出，免疫期在一年以上。

3 小結(jié)

（1）本項(xiàng)目雖用一株菌體制苗，但該菌株Nb6514和已發(fā)現(xiàn)其他幾株c型肉毒梭菌菌株具有交叉保護(hù)作用，因此對C型肉毒梭菌中毒癥具有好地預(yù)防作用。

（2）對研制的牛羊肉毒梭菌（C型）干粉苗進(jìn)行了安全檢驗(yàn)和效力檢驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明安全可靠。

（3）免疫效果測定結(jié)果顯示牛羊免疫后21即可產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)免疫力。

（4）免疫期測定結(jié)果顯示免疫期在一年以上，這對今后制定牛羊C型肉毒梭菌干粉苗的免疫程序和注射后抗體的跟蹤監(jiān)測提供了依據(jù)。

甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開發(fā)項(xiàng)目，項(xiàng)目編號：GNSW-2012-15。

李元新（1971-），男，甘肅平?jīng)鋈耍F醫(yī)碩士，副研究員，主要從事動物疫病防治與疫苗開發(fā)研究工作。