唐翔 陶怡 黃文輝 黃成輝 于水蓮△

(1.廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院婦科；2.廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院風濕免疫科，廣州 廣東 510006)

Toll樣受體9在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者高人乳頭瘤病毒感染中的作用

唐翔1陶怡2黃文輝2黃成輝2于水蓮2△

(1.廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院婦科；2.廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院風濕免疫科，廣州 廣東 510006)

目的 初步探討TLR9在SLE、HPV、SLE+HPV感染患者宮頸上皮細胞中的表達及意義。方法 行子宮頸液基細胞學檢查(LCT)的患者20例，均分為如下四組：SLE組、SLE&HPV組、HPV組、正常對照組四組：LCT其中一份用于LCT檢查，剩余的標本用于高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)及低危型人類乳頭瘤病毒(LR-HPV)檢測；另一份用于流式鑒定及胞內TLR9受體檢測。結果 合并HPV陽性的患者其SLEDAI疾病活動性評分6(4～7)顯著高于HPV陰性組2(0～3)，且更容易合并器官損傷，其中SLE&HPV組共5例(100%)合并器官損傷≥2，而SLE組僅2例(40%)：合并HPV感染的SLE患者其病情復發(fā)指數(shù)flare5例(100%)也明顯高于HPV陰性患者1例(20%)；同樣，SLE&HPV組患者全部為Anti—dsDNA陽性(100%)，而SLE組僅1例(20%)陽性。流式cytokeratin+CD45-設門鑒定的上皮細胞內TLR9表達的平均熒光強度，SLE&HPV組

Toll樣受； 系統(tǒng)性紅斑狼瘡； 人類乳頭狀病毒

人類乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是子宮頸癌的致病因素，高危型HPV感染(如HPV16、18)的持續(xù)存在是子宮頸癌的重要風險因素之一。一項納入85例系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者和2 080例普通女性的橫截面研究[1]，結果發(fā)現(xiàn)前者出現(xiàn)子宮頸細胞異常的比率為16.5%，是后者5.7%的3.3倍；此外，有11.8%的SLE患者被檢出攜帶HPV，其中10.6%患者的病毒更屬高度致瘤風險型，感染率較普通女性高1.7倍，但在前瞻性隊列研究中其致高危致病因素及預測因子并未得到證實[2-3]。Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)家族在早期固有免疫中對入侵病原微生物的識別發(fā)揮重要作用，胞內TLR3、TLR7、TLR8、TLR9通過識別病毒核酸成分通過介導下游信號轉導誘導免疫反應。研究提示腫瘤相關的高危型HPV細胞株亦可通過抑制TLR7和TLR9轉錄、下調受體表達及功能致 HPV逃避宿主免疫防御而長期潛伏[4]。另一方面，TLR9由于特異性識別非甲基化的CpG-DNA序列，在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用，而細菌或病毒的CpG-DNA 具有激活TLR9 的性質，故一旦感染就可能引起 SLE 的發(fā)作或者非活動性SLE的復發(fā)。相反，本組前期研究探討TLR受體通路在宿主SLE抗HPV感染中的作用，結果提示藥物因素如TLR拮抗劑(羥氯喹)和強的松治療可能引起SLE患者體內TLR7和TLR9表達下調，從而抑制固有免疫系統(tǒng)對外源侵入性病原體HPV的識別致高危型HPV感染持續(xù)存在[5]。綜上，多種因素包括病毒感染本身、藥物因素以及病情活動復發(fā)均可致SLE患者體內HPV持續(xù)易感，而我們的研究將在上述橫截面及前瞻性研究基礎上進一步通過體外研究初步探討TLR9在SLE、HPV、SLE+HPV感染及不同HPV亞型宮頸癌細胞株中表達及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 橫截面病例對照研究納入2014年1-12月就診于廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院婦科及風濕免疫科行子宮頸液基細胞學檢查(liquid cytology test，LCT)的患者20例，均分為如下四組：(1)SLE組；(2)SLE&HPV組；(3)HPV組；(4)正常對照組。其中SLE患者均符合1997年美國風濕病學會分類診斷標準[6]，12例均行HR-HPV檢測。所有納入患者均已結婚或性生活活躍，未接受過任何HPV疫苗接種，均已征得知情同意。所有納入SLE患者均進行臨床病情評定及血液學檢查評估病情活動性：(1)疾病活動性及嚴重性評估：狼瘡國際合作組/美國風濕病學院損傷指數(shù)(SLICC)[6]評價SLE器官/損傷；狼瘡疾病活動指數(shù)(SLEDAI)[7]評價SLE疾病活動性；復發(fā)(flare)是指與上一次就診相比，SLE患者當次就診的SLEDAI疾病活動性積分增加≥3分[8]。(2)實驗室炎癥活動指標：檢測血清補體C3(g/L)、C4、Anti-dsDNA(免疫熒光法)。(3)主要損傷器官：神經系統(tǒng)、腎臟系統(tǒng)、心臟系統(tǒng)、血液系統(tǒng)(白細胞少于4×109/L或血小板少于100×109或溶血性貧血)。(4)免疫抑制劑，包括強的松、羥氯喹、硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺(口服或靜脈給藥)、環(huán)孢素A及霉酚酸酯；婦科相關評估，收集的宮頸脫落細胞進一步行LCT檢查及高危型人乳頭狀瘤病毒(high risk human papilloma virus，HR-HPV)檢測評估及診斷。

1.2 研究方法 細胞取材：(1)受檢者受檢3 d前禁止性生活、陰道沖洗和上藥，將子宮頸采樣刷置于子宮頸口后插入子宮頸內，直到只有刷子最下面的刷毛暴露在子宮頸外口為止，慢慢地將子宮頸刷向同一方向360°轉3～5圈并停留數(shù)秒，將毛刷采集到的脫落細胞分為兩份轉移到標本保存液中送檢。其中一份用于LCT檢查，剩余的標本用于高危型人乳頭瘤病毒(high risk human papilloma virus，HR-HPV)及低危型人類乳頭瘤病毒(low risk human papilloma virus，LR-HPV)檢測，另一份用于流式鑒定及胞內TLR9受體檢測。(2)LCT宮頸細胞學檢查及診斷，LCT將收集的宮頸脫落細胞制成直徑13 mm的細胞層于載玻片上，并在全自動制片中完成染色，再人工透明、封固，由有經驗的病理細胞學醫(yī)師閱片。細胞學診斷標準采用2001年國際癌癥協(xié)會TBS(the bethesda system)分級系統(tǒng)。宮頸外口和頸管的脫落細胞經 Thinprep 2000系統(tǒng)自動制片機處理后，制成直徑2 cm薄層細胞涂片、固定、染色。采用2001年國際癌癥協(xié)會推薦的新TBS分類標準分為[9]，未見上皮內病變細胞或惡性細胞、其他(子宮內膜細胞出現(xiàn)在40歲以后婦女的涂片)和上皮細胞異常(鱗狀上皮異常和腺上皮異常)。鱗狀上皮異常分為,①非典型鱗狀細胞，包括非典型鱗狀細胞(atypical squamous cell，ASC)、不除外高度鱗狀上皮內病變的不典型鱗狀細胞(ASC-H )，統(tǒng)稱ASCUS。②鱗狀上皮內瘤變，包括低度鱗狀上皮內瘤變(LSIL)，高度鱗狀上皮內瘤變(HSIL)。③鱗狀細胞癌(SCC)。腺上皮異常分為，不明確診斷意義的不典型腺細胞(AGUS)、腺癌(AC)。ASCUS診斷比例，不超過鱗狀上皮內病變的2～3倍，為統(tǒng)一細胞學和組織學診斷術語，LSIL即宮頸上皮內瘤樣病變Ⅰ級(CIN Ⅰ)，HSIL包括CIN Ⅱ和CIN Ⅲ或原位癌(CIS)。細胞學陽性診斷是指ASCUS以上病變。子宮頸組織病理學檢查：對 LCT 檢查為 ASC-US 并且HR-HPV 檢測為陽性的患者在陰道鏡下多點或病變明顯處取活檢，送病理檢查，由高年資病理醫(yī)師做最后診斷，組織病理學結果分為,炎癥、 CIN1-3、浸潤癌、其它。(3)HR-HPV檢測:采用第2代基因雜交捕獲技術檢測13種高危型人乳頭瘤病毒(HPV-16、-18、-31、-33、-35、-39、-45、-51、-52、-56、-58、-59、-68 型)，將收集的上皮細胞通過裂解、雜交、捕獲、反應、沖洗和信號收集等步驟，在DML2000系統(tǒng)上進行判讀，分析演繹結果。參考范圍為0～1.00 pg/mL，檢測結果>1.00 pg/mL 時判定 HR-HPV 檢測陽性，表示存在 HR-HPV 感染。(4)宮頸上皮細胞流式鑒定:將收集的宮頸脫落細胞用PBS 清洗2次離心后重懸，調整細胞密度為(1×106/mL)/100 μL加入BD公司專用試管中，加入2%人血清封閉胞膜表面Fc受體，減少非特異性的結合。細胞鑒定分型，首先加入R-藻紅蛋白(PE)標記的細胞表面Anti-CD45抗體及鼠IgG1κ同型對照(Biolegend公司，美國)標記白細胞4 ℃孵育30 min；接下來行胞內染色，首先用固定破膜液常溫進行30 min固定/破膜處理(BD公司，美國)，加入純化的鼠anti-cytokeratin抗體(Millipore公司，美國)及IgG1κ同型對照(BD公司，美國)標記上皮細胞，4 ℃孵育45 min再加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記的二抗，(Zymed Laboratories公司，美國)。采用FACS Calibur流式細胞儀(BD公司，美國)，488 nm激發(fā)光源，應用CellQuestTM軟件進行分析。在使用熒光微球校準及調整機器熒光補償后，做雙色熒光標記同型陰性對照，排除非特異染色的熒光。每管獲取并分析10 000個細胞，用側向角散射(SSC)及前向角散射(FSC)設門分析。根據(jù)FSC、SSC顆粒度大小將細胞分為R1上皮細胞群、R2白細胞群、R3細胞碎片群，接下來分析抗原表達情況，經過熒光標記后確定R1 anti-cytokeratin+CD45-上皮細胞群、R2 anti-cytokeratin-CD45+白細胞群、R3 anti-cytokeratin-CD45-細胞碎片群。(5)宮頸上皮細胞內TLR9表達流式檢測：將收集的宮頸脫落細胞用PBS清洗2次離心后重懸，調整細胞密度為(1×106/mL)/100 μL加入BD公司專用試管中，同樣加入2%人血清封閉胞膜表面Fc受體，減少非特異性的結合。接下來行胞內染色，首先用固定破膜液常溫進行30 min固定/破膜處理，加入FITC標記的Anti-TLR9抗體(Imgenex公司，美國)及IgG同型對照(BD公司)4 ℃孵育30 min后上機檢測。熒光較正后同樣采用FACS Calibur流式細胞儀，488 nm激發(fā)光源，應用CellQuestTM軟件進行分析，每管獲取并分析10 000個細胞，用SSC及FSC設門分析，記錄R1 上皮細胞群中FITC標記的Anti-TLR9平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI)。

2 結 果

2.1 SLE患者的基本臨床特點 10例SLE患者納入本研究根據(jù)HPV陽性/陰性分為兩組：SLE組；SLE&HPV組；病程分別為17.2(12.0～23.4)年、17.7(12.4～20.0)年。合并HPV陽性的患者其SLEDAI疾病活動性評分6(4～7)顯著高于HPV陰性組2(0～3)，且更容易合并器官損傷，其中SLE&HPV組共5例(100%)合并器官損傷≥2，而SLE組僅2例(40%)；合并HPV感染的SLE患者其病情復發(fā)指數(shù)flare有5例(100%)也明顯高于HPV陰性患者1例(20%)；同樣，SLE&HPV組患者全部為Anti-dsDNA陽性(100%)，而SLE組僅1例(20%)陽性，上述差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。10例(100%)SLE患者均曾經或正在接受強的松+羥氯喹治療，1例(20%)予硫唑嘌呤治療。見表1。

表1 SL E患者的基本臨床特點

2.2 研究人群感染HPV類型 研究人群感染的HPV類型見表2。

表2 研究人群感染HPV類型

2.3 宮頸上皮細胞內TLR9表達流式檢測 來自3個不同樣本的宮頸脫落細胞鑒定，流式斑馬圖可見前向角散射/側向角散射設門鑒定上皮細胞(R1: cytokeratin +CD45-)、白細胞(R2：cytokerati-CD45+)及細胞碎片(R3：cytokeratin-CD45-)。平滑直方圖可見cytokeratin +CD45-設門鑒定的R1上皮細胞內TLR9表達的平均熒光強度，結果示SLE&HPV組

注：來自3個不同樣本的宮頸脫落細胞鑒定，流式斑馬圖可見前向角散射/側向角散射設門鑒定上皮細胞(R1: cytokeratin +CD45-)、白細胞(R2：cytokerati-CD45+)及細胞碎片(R3：cytokeratin-CD45-)。圖1 宮頸上皮細胞流式鑒定

注：平滑直方圖可見cytokeratin +CD45-設門鑒定的R1上皮細胞內TLR9表達的平均熒光強度，可見SLE&HPV組

3 討 論

慢性持續(xù)性高危型HPV感染是宮頸癌發(fā)生的必要因素，主要經性接觸傳播，大部分人感染一年后會自動清除病毒。 SLE患者免疫系統(tǒng)功能較差，病毒停留在體內的時間較長，致SLE患者感染高危型HPV病毒風險增加。墨西哥瓜達拉哈拉大學的Rojo-Contreras等[10]開展的橫斷面研究發(fā)現(xiàn)上標：SLE患者HPV感染風險低于類風濕關節(jié)炎(rheumatoidarthritis，RA)患者和健康對照組，但高危HPV型最常見于SLE患者，提示醫(yī)生應提高警惕，預防SLE患者宮頸癌患病風險。研究納入34例SLE患者、43例趾患者以及146健康婦女，結果顯示：SLE患者、SLE&HPV患者及健康對照組HPV陽性率分別為14．7%、27．9%和30．8%。高危型HPV陽性率分別為11．7%、27．9%和26%。但高危型HPV 58、35和18最常見于SLE患者，其中2例SLE患者發(fā)生宮頸癌前病變，l例患宮頸癌。長期應用甲氨蝶呤、硫唑嘌嶺及強的松與 RA或SLE患者發(fā)生HPV感染有關。2002年來自香港的一項研究發(fā)現(xiàn)有3例30多歲的SLE患者同時被發(fā)現(xiàn)患上末期子宮頸癌，他們隨即展開研究，納入 85例SLE患者和2080名普通女性進行病例對照研究，結果發(fā)現(xiàn)前者出現(xiàn)子宮頸細胞異常的比率為16。5%，是后者(5.7%)的3．3倍；此外，有11．8%的 SLE患者被檢出攜帶HPV，其中10，6%患者的病毒更屬高度致瘤風險型，感染率較普通女性高1.7倍，提示伴高炎癥狀態(tài)及長期多重高危型HPV感染的SLE患者其子宮頸巴氏涂片異常和宮頸癌的發(fā)病率顯著高于對照人群，但在前瞻性隊列研究中其致高危致病因素及預測因子并未得到證實。

TLR是最具特征性的病原模式識別受體，在機體的感染防御中發(fā)揮重要作用，胞內TLR3、TLR7、TLR8、TLR9通過識別病毒核酸成分通過介導下游信號轉導誘導免疫反應。NPV癌基因蛋白或HPV病毒樣顆粒等可經由HPV通路，通過多種目前仍不清晰的機制調節(jié)宿主免疫；同時在腫瘤的微環(huán)境中，TLR直接或間接調控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，TLR在宮頸高危型HPV感染轉歸及致癌過程中發(fā)揮著重要作用。研究提示腫瘤相關的高危型HPV細胞株亦可通過抑制 TLR7和TLR9轉錄、下調受體表達及功能致HPV逃避宿主免疫防御而長期潛伏。而我們的結果首先對上述研究予以證實。首先，SLE&HPV組與HPV組感染HR-HPV機率分別達4例(80%)、5例(100)，100%均合并≥2種感染：兩組在HR-HPV感染中，以HPV-16感染機率最高，分別達2例 (40%)、3例(60%)；從平滑直方圖可見cytokeratin+CD45-設門鑒定的宮頸上皮細胞內TLR9表達的平均熒光強度，結果示HPV組<正常對照組，提示下調的TLR9受體可能與HPV逃避宿主免疫防御從而導致病情長期潛伏相關。

TLR9由于特異性識別非甲基化的CpC-DNA序列，在自身免疫性疾病中同樣發(fā)揮重要作用。Wong對研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比[11]，胞內TLR9高表達于SLE患者外周血單核細胞、CD4T淋巴細胞、CD8T淋巴細胞及B淋巴細胞。而細菌或病毒的CpC-DNA具有激活TLR9的性質，故一旦感染就可能引起SLE的發(fā)作或者非活動性SLE的復發(fā)。體外研究亦發(fā)現(xiàn) 13，CpC-DNA刺激后，SLE患者外周血單核細胞高表達促炎細胞因子白細胞介素(interleukin，IL) -1β、IL-6,IL-10,IL-12。同樣我們的研究發(fā)現(xiàn)，合并HPV陽性的者其SLEDAI疾病活動性評分6(4～7)顯著高于HPV陰性組2(0～3)，且更容易合并器官損傷，其中SLE&HPV組共5例(100%)合并器官損傷≥2，而SLE組僅2例(40%)；合并HPV感染的SLE患者其病情復發(fā)指數(shù)flare5例(100%)也明顯高于HPV陰性患者1例(20%)：同樣，SLE&HPV組患者全部為Anti-dsDNA陽性(100%)，而SLE組僅1例(20%)陽性，提示HPV病毒能通過核酸特異性的TLR9激活固有免疫和調節(jié)免疫系統(tǒng)，導致病情發(fā)作或者非活動性SLE的復發(fā)。

而另一方面，早期研究探討TLR受體通路在宿主SLE抗HPV感染中的作用，結果提示藥物因素如TLR拮抗劑(羥氯喹)和強的松治療可能引起SLE患者體內TLR7和TLR9表達下調，從而抑制固有免疫系統(tǒng)對外源侵入性病原體HPV的識別致高危型HPV感染持續(xù)存在。本研究納入的10例(100%)SLE患者均曾經或正在接受強的松+羥氯喹治療，1例(20%)予硫唑嘌嶺治療。進一步流式檢測結果提示cytokeratin+CD45-設門鑒定的上皮細胞內TLR9表達的平均熒光強度示SLE&HPV組

本研究仍有許多局限性，首先，所有病例及對照人群僅來自華南區(qū)一家醫(yī)院，存在選擇偏倚；其次，橫截面病例對照研究雖可判斷暴露與疾病之間是否存在有統(tǒng)計學上的聯(lián)系，但不易作出有因果聯(lián)系的結論，而前瞻性隊列研究結果較易作出是否有因果聯(lián)系的結論，其結果更有說服力，需在進一步研究中完善：第三，由于SLE同時合并HPV患者發(fā)病率及樣本量制約(n=20)及取材限制，研究納入病例較少。

綜上，首先，本研究進一步支持下調的TLR9受體可能與HPV逃避宿主免疫防御從而導致病情長期潛伏相關；其次，作為核酸病毒，HPV可能通過核酸特異性的TLR9激活固有免疫和調節(jié)免疫系統(tǒng)，導致病情發(fā)作或者非活動性SLE的復發(fā)；再次，多種因素包括病毒感染本身、藥物因素以及病情活動復發(fā)均可致SLE思者體內HPV持續(xù)易感。而我們的研究拋磚引玉，提示cytokeratin+CD45-設門鑒定的上皮細胞內TLR9表達的平均熒光強度示SLE&HPV組

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Recognition of oncogenic viruses by host Toll-like receptor-9 in patients with systemic lupus erythematosus

TangXiang,TaoYi,HuangWenhui,HuangChenghui,YuShuiliang.

1.DepartmentofGynecology,ThesecondaffiliatedhospitalofGuangzhoumedicaluniversity; 2.DepartmentofRheumatologyandImmunology,ThesecondaffiliatedhospitalofGuangzhoumedicaluniversity,Guangzhou,Guangdong, 510006

Objective To explore the expression of TLR9 in cervical epithelial cells and high-risk and lov isk HPV types in lupus patlents and controls with or without HPV infeotion．Methods Protein levels of TLR9 in cervical epitheliai cellS of lupus patients and controlS with or withorn HPV infection were assessed using flow cytometry．Characteristics associated with the differential expression of TLRs in systemic lupus erythematosus(SLE)were elucidated．Results For subjects with HPV infection，levels Of TLR9 were lower in lupus patlents compared with controls．Decreased FLR9 levels were observed in HPV-negative SLE compared to healthy controls．For SLE with and without HPV infection，TLR9 levels were lower in infected SLE than those in HPV-negative patients．Conclusions This study reveals the hypothesis used by HPV to suppress the host immune response by deregulating the TLR9 transcript，providing evidence that abolishing innate responses may be a crucial step involved in the carcinogenic events mediated HPVs.Upon infection，HPV further down-regulate TLR9 level for viral persistence．Then，prednisolone and TLR antagonist (hydroxychloroquine) may down-regulate protein levels of TLR9 in lupus patlents，thereby decreasing the innate immune response against HPV infection．

toll-like receptor 9 (TLR9); systemic lupus erythematosus (SLE); human papillomavirus infection (HPV)

2013年度國家自然科學基金項目(81300585)；2014年廣東省公益研究與能力建設專項資金項目(2014A020212322)；2015年度廣東省自然科學基金項目(2015A030313477)

R34；R593.24

A

1000-744X(2016)06-0575-06

2016-04-20)

△通信作者，E-mail:shuilian2008@gmail.com