田沂凡，劉春楠，佟繼銘，劉永平

(河北省中藥開(kāi)發(fā)與研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，承德 067000)

赤雹根總皂苷緩釋片含量測(cè)定的方法學(xué)研究

田沂凡，劉春楠，佟繼銘，劉永平*

(河北省中藥開(kāi)發(fā)與研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，承德 067000)

目的：建立赤雹根總皂苷(TSTR)緩釋骨架片的含量測(cè)定方法。方法：采用單因素考查的方法考查溶出條件對(duì)藥物體外釋藥可能產(chǎn)生的影響，對(duì)TSTR緩釋骨架片的含量測(cè)定方法進(jìn)行方法學(xué)考查。結(jié)果：赤雹皂苷F在4.84～309.76 μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 7)。藥物的體外釋放條件為：以500 ml脫氣后的pH 6.8的磷酸鹽緩沖液(PBS)作為溶出介質(zhì)，溫度為(37±0.5) ℃，轉(zhuǎn)速為100 r/min。結(jié)論：建立了穩(wěn)定可靠的TSTR骨架緩釋片的含量測(cè)定方法。

赤雹根，總皂苷，含量測(cè)定，骨架緩釋片

赤雹為葫蘆科多年蔓生草本植物，是我國(guó)滿族民間長(zhǎng)期沿用藥材，多用來(lái)治療風(fēng)濕腰腿痛、軟組織損傷[1]。前期研究表明，TSTR具有顯著的鎮(zhèn)痛抗炎作用[2,3]，對(duì)佐劑誘導(dǎo)的類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠治療效果明顯[4,5]。本試驗(yàn)針對(duì)臨床治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎普通片劑給藥頻繁等缺點(diǎn)，并結(jié)合前期研究，制備TSTR緩釋片，并對(duì)TSTR緩釋片含量測(cè)定的方法學(xué)進(jìn)行考查，預(yù)期建立穩(wěn)定可靠的TSTR骨架緩釋片的含量測(cè)定方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent HPLC-1260型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；依利特色譜柱(Hypersil ODS2，250 mm×4.6 mm，5 μm，批號(hào)11109)；ZDY-8型重型單沖壓片機(jī)(上海遠(yuǎn)東制藥機(jī)械總廠)；RC806溶出試驗(yàn)儀(TDTF/天大天發(fā))；YP1200型電子天平(上海精科天美科學(xué)儀器有限公司)；AG-245型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；YPD-300型片劑硬度儀(上海黃海藥檢儀器有限公司)；熱風(fēng)循環(huán)干燥箱(吳江華飛電熱設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥 赤雹根總皂苷(TSTR，實(shí)驗(yàn)室自制，純度大于50%)；赤雹皂苷F(實(shí)驗(yàn)室自制，純度大于96%)；甲醇、乙腈均為色譜純；羥丙甲纖維素(HPMC K4M、HPMC K15M、HPMC K100M，安徽山河藥用輔料股份有限公司，批號(hào)依次為140607、141017、140209)；微晶纖維素(B型，湖州展望藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)20150631)；硬脂酸鎂(湖州展望藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)20150604)；羧甲淀粉鈉(CMS-Na，湖州展望藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)20150233)；聚維酮 K30(PVP K30，湖州展望藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)20150410)；純凈水(高碑店娃哈哈啟力飲料有限公司)；氫氧化鈉(分析純，天津市佳興化工玻璃儀器工貿(mào)有限公司)；磷酸二氫鉀(分析純，西隴化工股份有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 TSTR緩釋片的制備 綜合考慮TSTR的提取率，擬定片重450 mg，每片中TSTR干膏150 mg。根據(jù)赤雹根藥材的常用劑量考慮，擬定服用方法為：1次/d，2片/次。由前期預(yù)試驗(yàn)得知，當(dāng)TSTR作為主藥時(shí)，由于TSTR干膏本身具有一定的黏度，濕法制粒后片劑硬度過(guò)大，不利于緩釋的進(jìn)行，故根據(jù)輔料性質(zhì)及其余輔料的組成，將TSTR與各輔料充分混合，采用粉末壓片法直接壓片即得。

2.2 體外釋放條件的考查

2.2.1 溶出介質(zhì)對(duì)藥物體外釋放的影響 釋放介質(zhì)的選擇與藥物的理化性質(zhì)、生物學(xué)特性及服用后所遇到的生理環(huán)境等因素有關(guān)。模擬人體胃腸道的生理環(huán)境，考查不同的pH值下溶出介質(zhì)對(duì)藥物釋放的影響，對(duì)于研究藥物服用后在不同生理環(huán)境下的敏感性及不同處方在不同釋放介質(zhì)中的釋藥差異具有重大意義[6]。本研究根據(jù)人體胃腸道中的生理環(huán)境不同，選擇三種不同pH值下的釋放介質(zhì)，即1 mol/L的稀鹽酸、脫氣后的新鮮蒸餾水、pH 6.8的PBS緩沖液[7]。取上述同一批次制備的TSTR骨架緩釋片各1片，分別在以上3種不同的釋放介質(zhì)中溶出，在相同位置定時(shí)取樣，每次取樣1 ml迅速過(guò)濾。以赤雹皂苷F的累積釋放度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用HPLC法測(cè)定每一份樣品的峰面積，計(jì)算其累積釋放度。結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，溶出介質(zhì)對(duì)藥物的體外釋藥過(guò)程影響較大，藥物在人工胃液環(huán)境中的累積釋放度較低，在水和pH 6.8的PBS緩沖液中緩慢釋放，符合Higuchi釋放曲線。結(jié)果表明藥物具有良好的體外緩釋作用，無(wú)明顯突釋。

圖1 不同溶出介質(zhì)對(duì)皂苷F體外釋放的影響

2.2.2 溶出介質(zhì)溫度的選擇 溶出介質(zhì)溫度對(duì)藥物體外釋放的影響大小主要由藥物與輔料的溶解性所決定。人體正常體溫為(37±0.5) ℃，《中國(guó)藥典》一部2015版規(guī)定溶出介質(zhì)溫度為(37±0.5) ℃，更能夠準(zhǔn)確反應(yīng)藥物在體內(nèi)的釋藥過(guò)程。

2.2.3 轉(zhuǎn)速對(duì)藥物體外釋放的影響 采用籃法對(duì)同一批次的TSTR緩釋片進(jìn)行體外釋放測(cè)定試驗(yàn)，考查轉(zhuǎn)速對(duì)體外釋藥行為的影響，轉(zhuǎn)速分別設(shè)定為50 r/min和100 r/min，保持其他條件不變，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定其累積釋放度。結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，轉(zhuǎn)速大小對(duì)藥物的體外釋放速率影響較大，其大小與藥物體外釋放速率呈正相關(guān)關(guān)系。溶出度測(cè)定方法中轉(zhuǎn)速的大小范圍一般在50～100 r/min，籃法和槳法分別以100 r/min、50 r/min為主[8]。測(cè)定藥物體外釋放度時(shí)轉(zhuǎn)速應(yīng)選擇100 r/min。

圖2 轉(zhuǎn)速不同時(shí)對(duì)皂苷F體外釋放的影響

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 Discovery-C18色譜柱(Hypersil ODS2，250 mm×4.6 mm，5 μm，批號(hào)11109)；流動(dòng)相：乙腈-水(24∶76)；檢測(cè)波長(zhǎng)：200 nm；柱溫：35 ℃；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：20 μl[9]。

2.3.2 溶液的制備

2.3.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)定赤雹皂苷F 10 mg，用25%乙腈水溶解并定容至10 ml，分別精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)液3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1和0.05 ml于10 ml量瓶中，用25%乙腈水定容，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

2.3.2.2 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取預(yù)制備的TSTR緩釋片研碎后的粉末10 mg，用25%乙腈水超聲溶解并定容至10 ml，搖勻，即得。

2.3.2.3 陰性對(duì)照溶液 取TSTR緩釋骨架片的陰性制劑，粉碎，混勻后精密稱(chēng)取20 mg，置于10 ml量瓶?jī)?nèi)，加25%乙腈水超聲30 min后定容，搖勻。過(guò)0.45 μm濾膜，精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各20 μl，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，對(duì)比樣品和對(duì)照品的HPLC圖譜，空白制劑的HPLC圖譜在58 min左右赤雹皂苷F出峰處沒(méi)有干擾峰。結(jié)果見(jiàn)圖3。

1.赤雹皂苷F圖3 供試品(A) 對(duì)照品(B)陰性對(duì)照(C)HPLC色譜圖

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別取上述對(duì)照品溶液各1 ml于上樣瓶中，按照上述色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定其每份對(duì)照品溶液的峰面積。以對(duì)照品峰面積值(Y)為縱坐標(biāo)，赤雹皂苷F的濃度X(μg/ml)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程：Y=11 148X-40 230(r=0.999 7)。表明赤雹皂苷F在4.84～309.76 μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 移取40 μg/ml的對(duì)照品溶液各1 ml于上樣瓶中。按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，并記錄峰面積。結(jié)果6份供試品的峰面積均值為369 600，RSD為0.77%，表明該儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 移取供試品溶液1 ml于上樣瓶中。按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分別在1、2、4、8、12和24 h進(jìn)樣1次，測(cè)定樣品的峰面積。結(jié)果所測(cè)得峰面積的平均值為455 825，RSD為0.31%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取5份TSTR緩釋片粉末各10 mg于10 ml量瓶?jī)?nèi)，加25%乙腈水超聲溶解并定容至10 ml，各取1 ml于上樣瓶中，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積并記錄。結(jié)果所測(cè)得TSTR緩釋骨架片中赤雹皂苷F含量的平均值為4.45%，RSD值為0.50%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)定9份已知赤雹皂苷F純度的TSTR緩釋片粉末各10 mg于10 ml量瓶中，依次編號(hào)1～9號(hào)，1～3號(hào)、2～6號(hào)和7～9號(hào)量瓶?jī)?nèi)依次加入0.36、0.45和0.53 mg的對(duì)照品，分別加入25%乙腈水超聲溶解30 min，定容至10 ml。按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件依次測(cè)定其峰面積，并計(jì)算加樣回收率。平均回收率為101.1%，RSD為1.27%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.3.8 緩釋片中赤雹皂苷F的含量測(cè)定 取預(yù)制備的TSTR緩釋片(片重依次為458、452和457 mg)3片，粉碎后分別置于3支500 ml量瓶?jī)?nèi)，加純水超聲溶解并定容。在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下分別測(cè)定以上3份樣品中赤雹皂苷F的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 緩釋片中赤雹皂苷F的含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

根據(jù)《中國(guó)藥典》規(guī)定，緩釋制劑在體外釋放過(guò)程中，溶出介質(zhì)的體積一般為500～900 ml。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溶出介質(zhì)為900 ml時(shí)，皂苷F在溶出介質(zhì)中的濃度過(guò)低，小于含量測(cè)定的線性范圍，通過(guò)對(duì)比不同體積對(duì)結(jié)果的影響，最終確定溶出介質(zhì)的體積為500 ml。

通過(guò)對(duì)陰性制劑、TSTR緩釋骨架片樣品和赤雹皂苷F對(duì)照品的HPLC譜圖進(jìn)行比較，陰性制劑譜圖在赤雹皂苷F的保留時(shí)間附近未出現(xiàn)干擾峰，說(shuō)明骨架材料和輔料對(duì)赤雹皂苷F的HPLC檢測(cè)沒(méi)有影響。

1 宋立人，紅恂，丁緒亮，等．現(xiàn)代中藥大辭典(上冊(cè))[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：1022

2 劉永平，陳建雙，張玉玲，等.赤雹根總皂苷鎮(zhèn)痛作用研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2001,38(5):993-995

3 陳建雙，張玉玲，趙波，等.赤雹根總皂苷抗炎作用研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012,18(8):163-166

4 張玉玲，趙波，陳建雙，等．赤雹根鎮(zhèn)痛作用及有效部位研究[J]．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21(10)：2483-2484

5 劉永平，陳建雙，趙波，等．赤雹根總皂苷對(duì)實(shí)驗(yàn)性佐劑型關(guān)節(jié)炎鎮(zhèn)痛作用的研究[J]．遼寧中醫(yī)雜志，2011，38(8)：1659-1661

6 周松，陳騰.鹽酸偽麻黃堿緩釋制劑的研制及其體外釋放度測(cè)定[J].中國(guó)藥師，2006,9(8):60-62

7 彭芝萍.三七總皂苷緩釋片的制備工藝及其體內(nèi)外釋藥的研究[D].武漢：湖北中醫(yī)藥大學(xué)，2012：28-29

8 魏農(nóng)農(nóng)，王霞，蘇敏.藥物溶出度試驗(yàn)方法研究進(jìn)展[J].中國(guó)新藥雜志，2013,22(17):1119-1124

9 毛曉霞，苗光新，趙春穎，等.赤雹根中Dubioside F的分離純化及含量測(cè)定[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014,20(24):62-65

安全用藥

2016-09-13

河北省科技廳支撐項(xiàng)目(No.14272502D)，河北省教育廳重大項(xiàng)目(No.ZD 2016013)

R927.2

A

1006-5687(2016)06-0024-03

*通訊作者:劉永平，E-mail:lyp@cdmc.edu.cn。