劉一鑫，薛禾菲，許海艦，劉喜綱，劉翠哲

(河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，承德 067000)

實驗研究

不同方法制備黃芩苷及其鎂鹽體外抑菌實驗

劉一鑫，薛禾菲，許海艦，劉喜綱，劉翠哲*

(河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，承德 067000)

目的：比較三種不同方法制備的黃芩苷及其鎂鹽的體外抑菌效果。方法：采用紙片擴散法觀察不同方法制備的黃芩苷及其鎂鹽對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌的體外抑菌效果。結(jié)果：合成法制備的黃芩苷鎂鹽對金黃色葡萄球菌的抑制作用較強，不加酸提取精制法制備的黃芩苷鎂鹽對綠膿桿菌的抑制作用較強，黃芩苷及其鎂鹽對大腸埃希菌的抑制作用均較弱。結(jié)論：不同方法制備的黃芩苷及其鎂鹽對三種耐藥性細菌均有一定程度的抑制作用。

黃芩苷，黃芩苷鎂鹽，體外抑菌

黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)為唇形科植物黃芩的干燥根，又名黃金茶、空心草、山茶根[1]。本品味苦，性寒，歸肺、膽、脾、胃、大腸、小腸經(jīng)，具有清熱燥濕、瀉火解毒、涼血止血、安胎的功效[2]。黃芩苷是黃芩中的一種黃酮類化合物，具有抗菌、抗炎、抗過敏、抗氧化、解熱和清除自由基等多種藥理作用[3]。2015年版《中國藥典》載錄的黃芩藥材規(guī)定含有黃芩苷的量不得少于8%，載錄的黃芩提取物項下含有黃芩苷的含量不得少于85.0%[4]。目前黃芩多以黃芩苷作為主要有效成分入藥，臨床應(yīng)用十分廣泛。

《中國藥典》載錄的黃芩苷是通過黃芩藥材水提酸沉純化法得到，目前市場上出售的黃芩苷，均是此方法提取得到。但此方法提取得到的黃芩苷幾乎不溶于水，口服生物利用度低[5]。而黃芩苷在黃芩中的原本存在形式是鎂鹽形式，這種形式的水溶性很好，可以通過水溶解的方法提取得到。但《中國藥典》方法加酸后破壞了黃芩苷的原本存在形式，使黃芩苷的水溶性變差，吸收速度慢，生物利用度低。本課題組經(jīng)過前期研究，在不改變黃芩中黃芩苷的原本存在形式基礎(chǔ)上，采用不加酸提取精制的方法，從黃芩中提取出黃芩苷鎂鹽；同時也發(fā)明了以《中國藥典》方法提取得到的黃芩苷為原料，合成黃芩苷鎂鹽的方法，還原了黃芩苷在黃芩中的存在形式。經(jīng)過四大光譜檢測驗證，可以確定黃芩苷和黃芩苷鎂鹽為相同結(jié)構(gòu)，并且已經(jīng)申請國家發(fā)明專利。本文對這三種方法制備的黃芩苷及其鎂鹽的體外抑菌效果做了以下研究，比較三種樣品對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌三種耐藥性細菌的抑制作用強弱，為篩選較好的黃芩苷及其鎂鹽的臨床用藥提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 藥物 黃芩苷對照品(含量為98%，購自中國食品藥品檢定研究院，批號110715-201318)；《中國藥典》方法制備的黃芩苷(含量為72%，本實驗室自制)；合成方法制備的黃芩苷鎂鹽(含量為72%，本實驗室自制)；不加酸提取精制方法制備的黃芩苷鎂鹽(含量為51%，本實驗室自制)。

1.2 儀器 安捷倫1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(北京五洲東方科技有限公司)；AG-245型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ2200D型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；YXQ-LS-SⅡ型電熱壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實業(yè)有限公司)；HZQ-C氣浴恒溫振蕩器(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)；GHX-9080B型隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海福瑪實驗設(shè)備有限公司)；pHS-3C型酸度計(上海偉業(yè)儀器廠)。

1.3 菌株 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌，均購自上海魯微科技有限公司(三種細菌均為第2代菌種，菌種使用5代后棄置)。

1.4 試劑 牛肉膏、營養(yǎng)瓊脂粉、酵母、蛋白胨和氯化鈉均購自北京索來寶生物科技有限公司；蒸餾水(本實驗室自制)；大孔吸附樹脂(HPD-100型)。

2 實驗方法

2.1 三種黃芩苷及其鎂鹽的制備方法

2.1.1 《中國藥典》方法制備黃芩苷(樣品一) 取黃芩藥材適量，加水煎煮，合并水煎液，濃縮水煎液至適量，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為1.0～2.0，80 ℃保溫，靜置，濾過，沉淀物加適量水?dāng)噭?，然后?0%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為7.0，加等量乙醇溶液，攪拌使之溶解，濾過，濾液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1.0～2.0，60 ℃保溫，靜置，濾過，沉淀物依次用適量水及不同濃度的乙醇溶液洗至pH值為7.0，揮干乙醇溶液，減壓干燥，即得[4]。

2.1.2 不加酸提取精制法制備黃芩苷鎂鹽(樣品二) 取黃芩藥材100 g，加入1 000 ml 50%乙醇溶液，水浴加熱到60 ℃進行提取2次，每次1 h，合并提取液，回收乙醇，得到適量濃縮液，并過處理好的HPD-100型大孔吸附樹脂柱進行吸附，用5 BV的蒸餾水洗去雜質(zhì)，再用5 BV的50%乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液(5 BV)，減壓濃縮，冷凍干燥，即得。大孔吸附樹脂預(yù)處理方法：將大孔吸附樹脂在濃度為95%的乙醇溶液中浸泡20 h，濕法裝柱，然后用濃度為95%的乙醇水溶液以1.5 BV/h流速通過該大孔吸附樹脂柱，直到流出液與水按照體積比為1∶5混合后不再呈現(xiàn)白色渾濁狀，用蒸餾水以1.5 BV/h流速洗脫，將液體洗脫至無色[6]。

2.1.3 合成法制備黃芩苷鎂鹽(樣品三) 稱取樣品一 5 g，置于圓底燒瓶中，加入125 ml純化水，使黃芩苷呈混懸液狀態(tài)；精密稱取氫氧化鎂0.16 g，加入黃芩苷混懸液中，在60 ℃條件下充分?jǐn)嚢枋蛊浠旌暇鶆?，反?yīng)4 h，溶液由渾濁逐漸變?yōu)榘导t色，最后得到溶液的顏色澄清透明；將反應(yīng)液濾過，取濾液，冷凍干燥，即得。

2.2 黃芩苷及其鎂鹽的紫外吸收光譜和紅外吸收光譜分析 本研究將黃芩苷與黃芩苷鎂鹽在200～400 nm下儀器自動掃描紫外吸收光譜，檢測結(jié)果見圖1。黃芩苷與黃芩苷鎂鹽的紫外最大吸收波長(λmax)相同，均在216、276與317 nm處有最大吸收。本研究采用常規(guī)溴化鉀壓片法測定紅外吸收光譜，于紅外光譜儀上500～4 000 cm-1處，分別對黃芩苷和黃芩苷鎂化合物進行紅外吸收光譜掃描，紅外吸收光譜掃描結(jié)果見圖2-圖4。分析結(jié)果如下：通常C=O吸收峰位于1 850～1 600 cm-1，在黃芩苷紅外光譜中，葡萄糖醛酸上的羰基吸收峰位于1 727 cm-1，在形成化合物后該峰消失。1 660 cm-1為4位C=O吸收峰，1 202 cm-1為5位C-O的伸縮振動吸收峰，在形成化合物后無明顯變化，位于1 600～1 400 cm-1的苯環(huán)骨架吸收峰也無變化，這說明反應(yīng)產(chǎn)物對苯環(huán)共軛體系無影響。通過對黃芩苷和黃芩苷鎂紅外光譜主要特征峰的比較分析，說明黃芩苷與Mg2+在葡萄糖醛酸上的羧基發(fā)生反應(yīng)。

圖1 紫外吸收光譜檢測黃芩苷和黃芩苷鎂鹽

圖2 紅外吸收光譜檢測黃芩苷

圖3 紅外吸收光譜檢測黃芩苷鎂鹽(提取方法得到)

圖4 紅外吸收光譜檢測黃芩苷鎂鹽(合成方法得到)

2.3 黃芩苷及其鎂鹽的含量測定

2.3.1 色譜條件 十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2)為流動相；檢測波長為:280 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μl；理論板數(shù)按黃芩苷峰計算應(yīng)不低于2 500。

2.3.2 對照品溶液的制備 取黃芩苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含有60 μg的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 取黃芩苷及其鎂鹽約10 mg，精密稱定，置25 ml量瓶中，加甲醇溶液適量使之溶解，再加甲醇溶液至刻度，搖勻。精密量取5 ml，置25 ml量瓶中，加甲醇溶液至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 測定法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μl，注入HPLC中，測定，即可(黃芩苷鎂鹽含量以黃芩苷計)，結(jié)果見表1。

表1 不同方法制備的黃芩苷及其鎂鹽的含量

2.4 體外抑菌試驗 根據(jù)徐淑云編寫的《藥理實驗方法學(xué)》(第三版)，第63章中抗菌藥物實驗法，進行體外抑菌實驗。

2.4.1 液體培養(yǎng)基的制備 精密稱取牛肉膏2 g、酵母3 g、氯化鈉5 g、蒸餾水700 ml混合，調(diào)節(jié)液體培養(yǎng)基的pH值為7.0左右，在蒸汽滅菌鍋里高壓滅菌30 min，溫度調(diào)至120 ℃，滅菌完畢后取出，分別放入6個錐形瓶中，每一個錐形瓶中液體培養(yǎng)基的體積為100 ml，密封好，備用[7]。

2.4.2 藥液的制備 精密稱取樣品一和樣品三各13.9 mg，加蒸餾水定容至10 ml；精密稱取樣品二 19.6 mg，加蒸餾水定容至10 ml。使藥液的濃度均為1 g/ml，高壓滅菌30 min，溫度調(diào)至120 ℃，滅菌后冷藏備用。

2.4.3 菌液的制備 將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌三種第二代細菌從營養(yǎng)瓊脂斜面上分別挑取一接種環(huán)的量，接種到三個帶有液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，輕輕搖晃錐形瓶后，放置在氣浴恒溫振蕩器中，溫度調(diào)節(jié)至37 ℃，培養(yǎng)24～48 h后，觀察液體變渾濁，即細菌復(fù)活成功。

2.4.4 固體培養(yǎng)基的制備 取另外三個帶有液體培養(yǎng)基的錐形瓶，每瓶分別加入瓊脂粉5 g，輕輕搖勻，放置在蒸汽滅菌鍋里高壓滅菌30 min，溫度調(diào)節(jié)至120 ℃，傾入培養(yǎng)皿，使液體均勻分散在培養(yǎng)皿中，冷卻3～5 min，變?yōu)楣虘B(tài)，即可使用。

2.4.5 紙片擴散法 實驗前，用紫外燈消毒實驗室30 min。在無菌操作條件下，用無菌接種環(huán)(接種環(huán)在酒精燈上灼燒，顏色變紅即可)分別挑取三種目標(biāo)菌液單菌落，用平板劃線法在固體培養(yǎng)基表面分別均勻涂布3次，每種細菌平行涂布兩個培養(yǎng)皿，室溫干燥3～5 min后，滴加20 μl黃芩苷藥液(1 g/ml)在0.5 cm直徑的濾紙片上；陰性對照滴加20 μl蒸餾水在0.5 cm直徑的濾紙片上。將濾紙片完全貼到培養(yǎng)基上，陰性對照的濾紙片貼到培養(yǎng)基中心。再次放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，觀察有無抑菌圈[8]。

2.4.6 抑菌效果評價 由于《中國藥典》中沒有明確關(guān)于中藥抑制細菌的效果評價指標(biāo)，因此本試驗只能通過精確測量抑菌圈的直徑，根據(jù)抑菌圈的大小對樣品的抑菌效果進行評價，3次重復(fù)實驗均有抑菌效果，視為抑菌作用有效。

3 結(jié)果

根據(jù)測量抑菌圈直徑，確定三種不同方法制備的黃芩苷及其鎂鹽對三種耐藥性細菌均有一定的抑制作用。通過對比抑菌圈直徑得出結(jié)果:合成方法制備的黃芩苷鎂鹽對金黃色葡萄球菌的抑制作用較強；提取精制方法制備的黃芩苷鎂鹽對綠膿桿菌的抑制作用較強；但三者對大腸桿菌的抑制作用均不是很明顯。陰性對照蒸餾水組對三種細菌均沒有抑菌效果，結(jié)果見表2。

表2 不同方法制備的黃芩苷及其鎂鹽的抑菌效果

4 討論

根據(jù)表2可知，黃芩苷鎂鹽的抑制細菌效果比黃芩苷好。合成方法制備的黃芩苷鎂鹽和不加酸提取精制方法制備的黃芩苷鎂鹽在同等劑量下，前者抑制細菌效果更好，推測可能是由于制備方法不同，其雜質(zhì)對抑菌效果有無影響還未可知，需要繼續(xù)探究。

耐藥性細菌的出現(xiàn)，增加了感染性疾病治愈的難度，在西藥效果不佳的情況下，迫使人們尋找新的對抗微生物感染的方法，紛紛將目光投向中藥對細菌的抑制作用。黃芩是臨床常用中藥，現(xiàn)代研究結(jié)果表明，黃芩及其有效成分黃芩苷具有較強的抗菌作用和較廣的抗菌譜，有著巨大的應(yīng)用價值和開發(fā)前景，值得深入研究[9]。本實驗證明了黃芩苷及其鎂鹽對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌三種耐藥性細菌的體外抑制作用，黃芩苷鎂鹽的抑菌效果明顯高于黃芩苷，為后續(xù)研究黃芩苷鎂鹽抑制細菌和其他致病菌提供了實驗基礎(chǔ)。

1 文敏,李雪,付守廷. 黃芩苷藥理作用研究新進展[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報, 2008,25(2):158-161

2 付國輝,馬香芹.黃芩的化學(xué)成分及藥理作用研究進展[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥,2015,22(22):18-20

3 張有志,王美玲,李存保.黃芩提取物抑菌實驗研究[J].內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2014,S1:171-176

4 中國藥典[S].一部.2015：282,391,457-458

5 王春民,劉剛,費艷,等.大孔吸附樹脂法純化黃芩總黃酮工藝的研究[J].中草藥,2010,4(1): 58-606 袁媛.黑參中人參皂苷的大孔吸附樹脂純化工藝研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2016,12(5):41-43

7 孫冬梅,祁棗園,李巖,等.黃芩苷對耐藥性金黃色葡萄球菌的抑菌作用研究[J].吉林醫(yī)學(xué), 2011,32(13):2587-2588

8 曾祥吉,李東霞.中藥抑菌實驗方法的研究[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2011,20(4):518-520

9 劉彬,盧軍.黃芩苷對單核細胞增生李斯特氏菌的體外抑菌作用研究[J].安徽醫(yī)藥, 2016,20(2):244-245

2016-05-18

河北省自然科學(xué)基金資助項目(No.H2014406036)，河北省教育廳重點研究項目(No.ZH2012050)，河北省高校百名優(yōu)秀創(chuàng)新人才支持計劃(No.BR2-103)。

*通訊作者：劉翠哲，E-mail：liucuizhexy@163.com。

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