肖瑞穎，王 偉，錢(qián)俊峰

(天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司樂(lè)仁堂制藥廠，天津 300112)

五味子不同產(chǎn)地、部位及提取工藝對(duì)木脂素成分含量影響的研究

肖瑞穎，王 偉*，錢(qián)俊峰

(天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司樂(lè)仁堂制藥廠，天津 300112)

目的：探究五味子藥材不同產(chǎn)地、不同部位及不同提取方式對(duì)木脂素成分含量的影響，為本廠含有五味子的品種選擇適宜的藥材產(chǎn)地及工藝提供科學(xué)的理論依據(jù)。方法：采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定不同產(chǎn)地、不同部位五味子中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的含量；同時(shí)，分別考查不同提取工藝(水煮、不同乙醇體積分?jǐn)?shù)熱回流、滲漉)對(duì)木脂素類(lèi)含量的影響，使用正交試驗(yàn)方法進(jìn)一步優(yōu)化確定五味子滲漉工藝對(duì)四種木脂素類(lèi)成分的最佳提取條件。結(jié)果：不同產(chǎn)地五味子木脂素成分都主要集中在種仁中，果皮中的含量較少；以乙醇熱回流及滲漉提取工藝對(duì)木脂素成分的含量提取效果好，正交試驗(yàn)中以乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響最為顯著，其次是提取倍數(shù)。結(jié)論：五味子中有效成分主要存在于種仁中，在大生產(chǎn)工藝中，需將五味子破碎，有利于有效成分的煎出；在提取工藝中，提示在工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中，盡量選取體積分?jǐn)?shù)較大的乙醇，以便提取完全。

五味子，木脂素，提取法，正交試驗(yàn)

五味子具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心的功效[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[2]，列為上品?，F(xiàn)代藥理研究證明五味子具有增強(qiáng)心血管功能[3，4]、降血糖[5]、保肝[6]、抗氧化抗疲勞，延緩衰老[7，8]、鎮(zhèn)靜催眠[9]、保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞[10]、抗腫瘤[11]等作用，而木脂素成分是五味子的主要活性成分。本廠目前有多個(gè)品種處方中含有五味子藥材，其提取方式及檢測(cè)指標(biāo)各異。故本試驗(yàn)擬對(duì)五味子不同產(chǎn)地、不同部位、不同提取方式進(jìn)行木脂素含量測(cè)定，分析五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素在不同部位中的分布規(guī)律，根據(jù)成藥的功效需求選擇適宜的藥材產(chǎn)地及提取工藝，以期可為本廠現(xiàn)有品種的工藝優(yōu)化提供依據(jù)，對(duì)今后大品種開(kāi)發(fā)及新品研發(fā)中的工藝選擇也具有指導(dǎo)意義。

1 儀器與試藥

Waters e2695高效液相色譜儀(美國(guó)Waters)；超聲清洗器SK8200LH(天津星亞玻璃儀器銷(xiāo)售公司)；sartorius CP225D(十萬(wàn)分之一天平)；sartorius CP224S (萬(wàn)分之一天平)；電熱鼓風(fēng)干燥箱DGG-101-1(天津天宇)；調(diào)溫電熱套ZDHW(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52AA(上海亞榮)；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)。北五味子(批號(hào)1507336，1509231)、南五味子(批號(hào)1509232)藥材均購(gòu)自天津中藥飲片廠，均符合2015年版《中國(guó)藥典》規(guī)定。五味子醇甲(批號(hào)110857-200405)、五味子酯甲(批號(hào)111529-200604)、五味子甲素(批號(hào)110764-201111)、五味子乙素(批號(hào)110765-200407)均為含量測(cè)定用，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。甲醇(天津市康科德科技有限公司)為色譜純；乙腈(EMD Millipore Corporation)為色譜純；甲醇(EMD Millipore Corporation)為色譜純；95%乙醇(天津市康科德科技有限公司)；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Shim-pack C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，以甲醇流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫(0～25 min，62%A；25～37min，62%A～80%A，37～50 min，80%A～90%A)，檢測(cè)波長(zhǎng)：217 nm，流速：1.0 ml/min，柱溫：35 ℃，進(jìn)樣量：10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素對(duì)照品適量，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得含五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素分別為69.20、36.2、40.8和48.2 μg/ml的混合對(duì)照品溶液，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取樣品粉末約0.25 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，超聲處理30 min，冷卻至室溫，加甲醇補(bǔ)足減少的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。分別精密吸取對(duì)照品和供試品溶液各10 μl注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1。

1. 五味子醇甲 2. 五味子酯甲 3. 五味子甲素 4. 五味子乙素

2.3 線性關(guān)系考查 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2、4、6、8、10和12 μl，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的回歸方程分別為Y=884 789X+881 473(r=0.999 3)、Y=367 322X+366 547(r=0.999 3)、Y=601 100X+561 909(r=0.998 2)和Y=676 157X+705 425(r=0.999 6)，結(jié)果表明五味子醇甲在138.4～830.4 μg、五味子酯甲在72.4～434.4 μg、五味子甲素在81.6～489.6 μg、五味子乙素在96.4～578.4 μg范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣6次，計(jì)算五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素峰面積的RSD分別為0.92%、0.82%、1.10%和0.90%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性考查 精密稱(chēng)取同批五味子樣品6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為1.8%、1.4%、2.0%和1.7%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12和24 h進(jìn)樣10 μl進(jìn)行分析，測(cè)定峰面積值，計(jì)算五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素峰面積的RSD值分別為0.96%、0.86%、1.04%和0.98%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知指標(biāo)成分含量的五味子藥材粉末9份，每份約0.125 g，分別精密加入高、中、低質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的平均加樣回收率分別為97.23%、97.67%、98.38%和96.14%，RSD依次為1.8%、1.4%、1.8%和1.6%。

2.8 樣品測(cè)定 精密稱(chēng)取不同樣品0.25 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算各指標(biāo)成分含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

3 工藝路線的確定

3.1 水提取工藝 取批號(hào)為1507336的五味子100 g，用水煮兩次，第一次4倍量4 h，第二次2倍量2 h，合并水煮液，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.18～1.20，烘干，稱(chēng)重，備用。

3.2 乙醇熱回流工藝 取批號(hào)為1507336的五味子100 g，分別選用60%乙醇、80%乙醇和90%乙醇熱回流兩次，第一次4倍量4 h，第二次2倍量2 h，合并水煮液，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.18～1.20，烘干，稱(chēng)重，備用。

表1 不同產(chǎn)地、不同部位五味子4種木脂素成分的含量及占比

3.3 滲漉工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 參考企業(yè)品種含有五味子的工藝參數(shù)，取批號(hào)為1507336的五味子藥材，平均分成若干份，每份100 g，以五味子木脂素的轉(zhuǎn)移率及出膏率為考查指標(biāo)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇用量、滲漉速度為考查因素，對(duì)五味子滲漉工藝進(jìn)行考查。試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平因素見(jiàn)表2。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)水平因素表

3.4 各提取方式對(duì)4種木脂素含量的影響 取各提取樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算各指標(biāo)成分含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同提取方式對(duì)五味 子中4種木脂素含量的影響

3.5 滲漉工藝樣品含量測(cè)定及結(jié)果 取9份樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算各指標(biāo)成分含量。對(duì)正交結(jié)果進(jìn)行多指標(biāo)綜合評(píng)分[12]。評(píng)分時(shí)以各指標(biāo)最大值作為參照對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，再給出不同權(quán)重，總木脂素轉(zhuǎn)移率與出膏率權(quán)重系數(shù)分別設(shè)為0.7和0.3。以綜合值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)表4。綜合評(píng)分(M)=[(PA×Ai/A優(yōu))+(PB×Bi/B優(yōu))]×100，式中PA為轉(zhuǎn)移率權(quán)重系數(shù)，Ai為轉(zhuǎn)移率指標(biāo)測(cè)定值，A優(yōu)為轉(zhuǎn)移率指標(biāo)最大值；PB為出膏率權(quán)重系數(shù)，Bi為出膏率指標(biāo)測(cè)定值，B優(yōu)為出膏率指標(biāo)最大值。

表4 L9(34)正交試驗(yàn)各指標(biāo)測(cè)定值分析結(jié)果

3.6 正交試驗(yàn)結(jié)果分析 正交試驗(yàn)各指標(biāo)測(cè)定結(jié)果及極差分析結(jié)果見(jiàn)表5。由直觀分析結(jié)果看出：各因素對(duì)結(jié)果的影響次序?yàn)锳>B>C，最佳提取工藝為A2B3C3。但以極差最小的C因素為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析發(fā)現(xiàn)，因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果均無(wú)顯著性差異，且綜合考慮大生產(chǎn)時(shí)成本問(wèn)題及操作問(wèn)題，確定最佳提取工藝為A2B2C3，即用80%乙醇，滲漉速度為6 ml/kg·min-1，收集7倍量滲漉液。

4 討論

4.1 五味子木脂素含量在方法學(xué)試驗(yàn)中采用單因素方法，考查了不同提取方式(回流和超聲)、不同溶劑(50%甲醇、甲醇、60%乙醇和95%乙醇)、不同提取時(shí)間(10、20和30 min)對(duì)五味子木脂素的影響，結(jié)果顯示甲醇超聲提取30 min效果最好。

4.2 通過(guò)考查不同產(chǎn)地五味子，發(fā)現(xiàn)其木脂素成分都主要集中在種仁中，果皮中的含量較少；提示在大生產(chǎn)過(guò)程中，需將五味子破碎，將果仁充分暴露，這樣有利于有效成分被完全提取。

4.3 本文通過(guò)對(duì)五味子不同提取方式進(jìn)行試驗(yàn)，可以看出：水提取時(shí)出膏率高，但其總木脂素含量較低，因?yàn)槲逦蹲幽局赜H脂性較強(qiáng)，在水中溶解度較低，盡管加熱木脂素類(lèi)成分轉(zhuǎn)移率也較低；同時(shí)通過(guò)正交試驗(yàn)方法對(duì)五味子滲漉工藝進(jìn)行優(yōu)化篩選，發(fā)現(xiàn)乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，對(duì)五味子木脂素的提取率越高，提取倍數(shù)越多，出膏率也隨之增加，從效果及成本方面綜合考慮，建議選取80%乙醇，7倍量進(jìn)行滲漉；而較高濃度乙醇熱回流方式與滲濾工藝效果相當(dāng)，提取木脂素效果均較好，分析是因?yàn)橛H脂性較強(qiáng)的五味子木脂素在高濃度的乙醇中溶解度較大，說(shuō)明五味子適合較高濃度乙醇提取。

1 中國(guó)藥典[S].一部.2015：66-67

2 張樹(shù)生譯. 神農(nóng)本草經(jīng)譯注[M].北京：中國(guó)人民大學(xué)出版社，2010:46

3 劉菊秀，陳靜，苗戎，等. 北五味子對(duì)心臟電活動(dòng)及收縮力的影響[J].中草藥，1999,30(4):280-282

4 Chin P Y，Mak D H，Poon M K，etal.Role of cytochrome P-450 in schisandrin B- induced antioxidant and heat shock responses in mouse liver[J].Life Sci，2005,77 (23):2887- 2895

5 馬育軒，范越，張曉娟，等．五味子多糖干預(yù)胰島素抵抗大鼠作用研究[J].中醫(yī)藥信息，2014,31(2):7-8

6 Lam P Y，Chiu P Y，Leung H Y，etal．Schisandrin B cotreatment ameliorates the impairment on mitochondrial antioxidant status in various tissues of long-term ethanol treated rats[J].Fitotcrapia，2010,81(8):1239-1245

7 王文燕，陳建光.五味子的藥理作用及開(kāi)發(fā)研究[J].華北大學(xué)學(xué)報(bào)·自然科學(xué)版， 2007,8(2):128-133

8 文惠玲，李曼莎，宋文瑤，等．五味子低溫水提取物HPLC特征圖譜的研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2009,20(3):244-246

9 高家榮，季文博，姜輝，等．酸棗仁-五味子藥對(duì)醇水雙提物對(duì)PCPA 致失眠大鼠氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的影響[J].中藥材，2013,36(10):1635-1639

10 姜恩平，王帥群，王卓，等．北五味子總木脂素對(duì)腦缺血模型大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡及p- AKT表達(dá)的影響[J].中國(guó)中藥雜志，2014,39(9):1680- 1684

11 姜恩平，李賀，于春艷，等．五味子乙素通過(guò) p38MAPK信號(hào)通路對(duì)結(jié)腸癌 SW480 細(xì)胞凋亡和侵襲的影響[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)·醫(yī)學(xué)版，2015,41(4):675-679

12 徐連明，邵杰，付小環(huán)，等.正交試驗(yàn)優(yōu)選全蝎鹽制工藝的研究[J].中草藥，2010,41(11)：1811-1812

2016-07-15

R94

A

1006-5687(2016)05-0008-04

*通訊作者：王偉，E-mail: lrtjs@126.com。