楊渝平 張繼英 段小寧 胡曉青 孟慶陽 劉振龍 史尉利 敖英芳北京大學第三醫(yī)院運動醫(yī)學研究所（北京100191）

兔同種異體新鮮半月板移植后組織學變化

楊渝平 張繼英 段小寧 胡曉青 孟慶陽 劉振龍 史尉利 敖英芳
北京大學第三醫(yī)院運動醫(yī)學研究所（北京100191）

目的：探討兔同種異體新鮮半月板移植后，移植物形態(tài)結(jié)構(gòu)的組織學衍變過程。方法：成年新西蘭大白兔12只，分為3組：6周組、12周組和24周組，每組4只。每次2只兔同時接受手術(shù)，將2只兔實驗側(cè)的內(nèi)側(cè)半月板互換，進行同種異體新鮮內(nèi)側(cè)半月板移植。術(shù)后6周、12周、24周處死，觀察大體半月板愈合情況，并行HE染色、天狼星紅染色等組織學檢查。結(jié)果：術(shù)后6周半月板移植物與周圍組織愈合情況良好，但存在明顯異物反應表現(xiàn)。12周和24周時，每組各有50%的半月板出現(xiàn)肉眼可見的明顯皺縮，鏡下可見基質(zhì)松散。HE染色顯示3組均存在血管增生、纖維化和淋巴細胞浸潤等表現(xiàn)。天狼星紅染色顯示：6周組75%的標本Ⅲ型膠原占比少于1/3；12周組50%的標本Ⅲ型膠原占比介于1/3和2/3之間；24周組全部標本Ⅲ型膠原占比均超過2/3。6周組有25%出現(xiàn)膠原纖維少量松散；12周組100%出現(xiàn)少量松散，且主要位于中心區(qū)；24周組50%出現(xiàn)大量松散，而且這種松散的表現(xiàn)擴展到整個半月板區(qū)域。三組間差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論：兔同種異體新鮮半月板移植術(shù)后6周愈合良好，但存在明顯異物反應表現(xiàn)，12周和24周部分移植物會出現(xiàn)明顯肉眼可見的皺縮和鏡下可見的基質(zhì)松散現(xiàn)象。而且隨著時間推移，內(nèi)部膠原纖維從Ⅰ型膠原為主逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)棰笮湍z原為主。這種變化先從中心區(qū)開始，范圍逐漸擴大，使移植物的結(jié)締組織結(jié)構(gòu)逐漸弱化，可能最終導致移植物的失效。

同種異體半月板；移植；膠原；組織學

半月板是膝關節(jié)的重要功能結(jié)構(gòu)，因其承載力量大、力學功能復雜，因此成為膝關節(jié)中最易導致運動損傷的結(jié)構(gòu)之一。如果膝關節(jié)失去半月板的保護，會導致過早的、進行性的關節(jié)軟骨退變，最終導致膝關節(jié)骨性關節(jié)炎的發(fā)生[1]。雖然臨床上隨著手術(shù)技術(shù)和手術(shù)器械的發(fā)展，部分半月板撕裂可以被縫合修補[2，3]，但仍有大量嚴重的或復雜的半月板損傷，無法進行縫合修復，位于非血供豐富區(qū)的嚴重撕裂的半月板往往還免不了要接受部分切除、次全切除和全切除手術(shù)。為了避免半月板缺失后膝關節(jié)退變的發(fā)生，很多學者都采用不同種類的半月板移植手術(shù)，試圖重建膝關節(jié)力學秩序，恢復半月板功能。

近年來，同種異體半月板移植作為國際上已經(jīng)比較成熟的手術(shù)方式，其臨床療效和預后已經(jīng)被證實[4-6]。Jiang等[7]和李學金等[8]分別在人體和動物實驗中還發(fā)現(xiàn)了半月板切除的同時進行半月板移植效果更好。但是，臨床和實驗室的研究發(fā)現(xiàn)也有很多不滿意的結(jié)果：謝興等[9]采用深低溫冷凍處理的豬半月板進行兔的異種異體半月板移植，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植物在半年以內(nèi)逐漸溶解吸收；Hommen等[10]和Verdonk等[11]發(fā)現(xiàn)移植物的生存率會隨著時間的延長越來越低。

鑒于此，我們設計了本實驗，用以觀察新鮮移植的同種異體半月板是否會隨著時間推移，組織結(jié)構(gòu)逐漸弱化而導致移植物的失效。

1 材料與方法

1.1 半月板移植手術(shù)

12只成年新西蘭白兔，雌性，體重2.8～3.2 kg。準備接受同種異體半月板移植的一側(cè)膝關節(jié)作為實驗側(cè)，另一側(cè)不接受任何手術(shù)作為對照側(cè)。麻醉后后腿脫毛，消毒鋪單。于膝關節(jié)內(nèi)側(cè)切長度4 cm的切口，逐層分離，暴露內(nèi)側(cè)副韌帶，從近端橫行切開關節(jié)囊。注意保護內(nèi)側(cè)副韌帶完整性，如果關節(jié)間隙過緊，難以完成半月板切除和移植操作，則部分切斷內(nèi)側(cè)副韌帶于上止點附近，操作完成后，再良好吻合韌帶斷端。每次2只序號相鄰的兔同時接受手術(shù)，將實驗側(cè)的內(nèi)側(cè)半月板互換，即刻進行同種異體新鮮內(nèi)側(cè)半月板移植。植入時，將被植入的半月板的前角縫合于前交叉韌帶脛骨平臺止點，后角縫合于后交叉韌帶脛骨平臺止點內(nèi)側(cè)后方的關節(jié)囊上，體部則縫合于內(nèi)側(cè)副韌帶上。中間加固縫合幾針于脛骨平臺周邊組織及關節(jié)囊上。然后縫合關節(jié)囊和皮膚。術(shù)后青霉素80萬單位每天1次肌肉注射，共3天，分籠飼養(yǎng)。于術(shù)后第6周、第12周、第24周分別處死新西蘭兔，每個時間段處死4只。取兩側(cè)膝內(nèi)側(cè)半月板備用。

本研究的所有動物實驗設計和手術(shù)方法都經(jīng)過北京大學第三臨床醫(yī)學院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 組織學觀察

將半月板組織按常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋后，5微米厚的連續(xù)切片，分別采用HE、天狼星紅染色法染色。其中，天狼星紅染色的標本采用帶偏振光功能的光學顯微鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)情況。

采用Kurth等[12]和Kon等[13]的評分方法，評估移植后半月板大體情況和組織學變化。針對半月板組織天狼星紅染色結(jié)果目前尚無統(tǒng)一的評估方法，故本研究將代表退變的Ⅲ型膠原占比、主要分布區(qū)域和有無結(jié)締組織結(jié)構(gòu)松散作為三個主要的觀察指標。將Ⅲ型膠原占比分為少于1/3、多于1/3少于2/3和多于2/3三組；將Ⅲ型膠原主要分布區(qū)域分為周邊區(qū)和中心區(qū)兩組；將有無結(jié)締組織結(jié)構(gòu)松散分為不明顯、少量和大量三組，觀察其結(jié)果并進行統(tǒng)計學分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

研究數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用例數(shù)（百分率）進行統(tǒng)計描述，不同組間構(gòu)成比的差異檢驗采用Fisher’s Exact Test，所有檢驗以雙側(cè)P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

所有結(jié)果按照動物取材周數(shù)進行自然時間分組，分為6周組、12周組和24周組。

2.1 大體觀察

移植術(shù)后動物患肢切口均愈合良好，未采用特殊外固定。無1例感染，無1例下肢活動受限，3周內(nèi)所有動物活動完全恢復正常。

2.2 移植后半月板大體情況評估結(jié)果

術(shù)后第6周，關節(jié)內(nèi)半月板前角與體部愈合均良好，有滑膜包繞，完全愈合并且連接緊密。僅有2例為后角不完全愈合并且連接處比較松弛。該組術(shù)后6周時半月板位置良好，形態(tài)基本正常，但顏色略發(fā)黃。術(shù)后第12周，其中2例移植的內(nèi)側(cè)半月板明顯變小接近消失。術(shù)后第24周，2例形態(tài)基本正常，顏色略黃，2例體積明顯變小。但整體半月板位置良好（參見圖1）。各組間結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義，具體結(jié)果詳見表1。

圖1 同種異體內(nèi)側(cè)半月板移植術(shù)后的大體情況

表1 同種異體移植后半月板大體情況評估結(jié)果

2.3 移植后半月板組織學情況評估結(jié)果

圖2 標本的HE 染色結(jié)果

表2 同種異體移植后半月板組織學情況評估結(jié)果（HE染色）

術(shù)后3組標本的HE染色結(jié)果顯示，所有移植半月板都一直存在一定的異物反應，有淋巴細胞和/或漿細胞浸潤，無中性粒細胞浸潤，有血管增生和部分組織纖維化。但除6周時有1例標本表現(xiàn)為愈合情況不佳外，其余各組所有移植半月板都表現(xiàn)出良好的愈合，且未見明顯的細胞壞死區(qū)域或無細胞區(qū)。見圖2和表2。示可能開始有退變的表現(xiàn)。C：B圖的局部放大?？梢郧宄乜吹郊舛烁浇仔约毎櫤徒Y(jié)構(gòu)基本正常的半月板細胞。D：12周時移植的內(nèi)側(cè)半月板組織結(jié)構(gòu)，尖端更加圓鈍，甚至跟正常半月板的游離邊緣形態(tài)有明顯差異；半月板細胞中類似纖維母細胞的細胞數(shù)量明顯增加，基質(zhì)出現(xiàn)更加明顯的松散（“?”指示），而且范圍擴展到接近游離緣。E：24周時移植的內(nèi)側(cè)半月板組織結(jié)構(gòu)，基質(zhì)松散更加明顯，擴展到幾乎全部半月板范圍。F：24周時未手術(shù)側(cè)內(nèi)側(cè)半月板組織結(jié)構(gòu)，細胞組成雖然表現(xiàn)接近正常，但也出現(xiàn)了類似于移植的半月板6周時基質(zhì)松散的表現(xiàn)，少量松散的基質(zhì)主要位于靠近中心的區(qū)域。（A、C、E圖放大倍數(shù)200倍，B、D、F圖放大倍數(shù)100倍）

天狼星紅染色可以對半月板組織的纖維結(jié)締組織結(jié)構(gòu)組成進行很好的半定量染色顯示。正常半月板90%以上為Ⅰ型膠原，僅含有微量的Ⅲ型膠原。Ⅲ型膠原一般被認為主要是在組織退變或者纖維性修復時才會出現(xiàn)，故正常的半月板天狼星紅染色應該整體顯示主要為紅色，結(jié)締組織纖維排列比較整齊，粗細均勻，而退變的半月板則會出現(xiàn)較多的黃綠色纖維，即Ⅲ型膠原[14]。正常半月板和3組同種異體移植術(shù)后標本的天狼星紅染色結(jié)果參見圖3。圖3顯示隨著移植時間的延長，移植物中Ⅰ型膠原逐漸減少，Ⅲ型膠原逐漸增加，而且Ⅲ型膠原從中心區(qū)開始出現(xiàn)，范圍逐漸擴大。

圖3 標本的天狼星紅染色結(jié)果

表3可見，隨著移植時間的延長，移植物中代表退變和修復的Ⅲ型膠原占比逐漸增加，并逐漸由中心區(qū)擴展到周邊區(qū)域。同時，還出現(xiàn)結(jié)締組織結(jié)構(gòu)逐漸松散的表現(xiàn)。各組間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討論

人類半月板的總重量的72%～77%為水分，其余基質(zhì)由膠原纖維、彈性纖維、葡糖胺聚糖及少量的殘余DNA和粘附分子組成，而其干重的85%～89%為膠原纖維[15]。人類的半月板內(nèi)部主要有四種膠原纖維，其中90%以上為Ⅰ型膠原，Ⅱ型膠原占到半月板膠原總量的1%～2%，同時含有少量的Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ型膠原[16-19]，這與我們實驗中得到的天狼星紅染色的非手術(shù)側(cè)內(nèi)側(cè)半月板染色表現(xiàn)一致。另外，半月板的膠原并非均勻分布，游離緣的1/3部分主要由Ⅰ型膠原和少量Ⅱ型膠原構(gòu)成，靠近滑膜緣的2/3部分幾乎全部由Ⅰ型膠原構(gòu)成[20]。本實驗中天狼星紅染色的結(jié)果（參見圖3）可以明顯看出：隨時移植時間延長，Ⅰ型膠原逐漸減少，尤其在靠近滑膜緣一側(cè)的偏中央?yún)^(qū)域比較明顯，逐漸被Ⅲ型膠原所替代。這也與HE染色所看到的表現(xiàn)符合，即結(jié)締組織的松散由靠近滑膜緣一側(cè)的中心區(qū)內(nèi)先出現(xiàn)。

另外，病理切片結(jié)締組織的松散，可能也會由于不恰當?shù)闹破僮饕?。但是，我們對本組中所有半月板組織都進行同樣的取材和制片處理，正常側(cè)的內(nèi)側(cè)半月板在6周取材時的組織學結(jié)構(gòu)并未顯現(xiàn)出結(jié)締組織的松散的表現(xiàn)，而24周取材時卻出現(xiàn)了比較明顯的結(jié)締組織松散表現(xiàn)（參見圖2和3）。即使是因為半月板組織相對于皮膚、肌肉等軟組織更加硬韌，制片、切片時相對容易出現(xiàn)組織松散，但鑒于前述原因，很可能是由于隨著移植時間的延長，移植的半月板內(nèi)部的纖維結(jié)締組織出現(xiàn)了微觀上組織結(jié)構(gòu)的退行性改變，引起其力學結(jié)構(gòu)弱化，最終導致在病理切片上表現(xiàn)為更多的組織松散。

臨床上應用最多的是經(jīng)過消毒滅菌和低溫保存的同種異體半月板，因為這種方法比較安全，來源相對比較充足。但正像Hommen等[10]、Jiang等[21]、余家闊等[22]和康曉琪等[23]的研究顯示出的結(jié)果一樣，他們都觀察到類似的結(jié)果：移植后的同種異體半月板組織，早期都會出現(xiàn)明顯的組織壞死表現(xiàn)，也就是會呈現(xiàn)為一個明顯的宿主細胞爬行替代的過程，與膝關節(jié)前交叉韌帶重建后移植物的塑性改建過程類似。其主要原因可能是他們都是采用經(jīng)鈷60γ射線輻照滅菌的同種異體半月板，用低溫冰箱保存，移植手術(shù)時取出再用。有實驗證實，γ射線輻照滅菌會對移植效果產(chǎn)生直接影響，并存在明顯的劑量相關性[24]。另外，半月板經(jīng)低溫冷凍后，其內(nèi)的細胞基本無存活。作為半月板重要成分的細胞外基質(zhì)是靠活的纖維軟骨細胞分泌的，所以冷凍半月板其生物活性會有一定程度的降低。此外還有冷凍干燥和深低溫保存等處理方法。冷凍干燥方法可破壞半月板原有的結(jié)構(gòu)成分，致其緊縮、基質(zhì)退變[25]。同時，深低溫保存的半月板其內(nèi)部膠原破壞較多，生物力學性能下降，且費用高昂[26]。

于是我們這個實驗采用了新鮮的同種異體半月板移植，同時對移植半月板的大體情況和組織學情況進行了觀察、記錄和統(tǒng)計。發(fā)現(xiàn)本組實驗術(shù)后6周、12周和24周移植的同種異體半月板都有比較好的愈合能力，明顯優(yōu)于Hommen等、Jiang等、余家闊等和康曉琪等[10，21-23]的利用經(jīng)過消毒滅菌和低溫保存的同種異體半月板移植的組織學表現(xiàn)。這與其它應用新鮮同種異體半月板移植的文獻的研究結(jié)果表現(xiàn)相似[27-29]。另外，Verdonk[30]用達爾伯克必需基本培養(yǎng)基（DMEM）加20%受者血清在37℃、95%空氣和5%CO2的條件下保存異體半月板，證實該種方法可使半月板保存活性，能產(chǎn)生纖維軟骨細胞、蛋白多糖及膠原纖維結(jié)構(gòu)，并證實該種方法優(yōu)于冷凍保存的半月板。當然，目前新鮮半月板移植在動物實驗中應用相對較多，由于保存時限的制約，取材后最好在24小時內(nèi)完成移植，所以臨床廣泛應用受到一定的限制。而且，新鮮半月板移植因未進行消毒，能否帶來疾病傳播尚未可知[11]。

同時，新鮮移植的同種異體半月板中有能分泌細胞外基質(zhì)的活的纖維軟骨細胞存在，而細胞膜是重要的免疫源，所以新鮮半月板移植仍可能會有輕度的免疫排斥[31，32]。我們的研究有著類似的表現(xiàn)，表現(xiàn)出持續(xù)存在的異物反應表現(xiàn)：在實驗取材的所有時間節(jié)點上，移植的半月板周緣幾乎都可以看到明顯的滑膜增生、小血管增生以及淋巴細胞和/或漿細胞的浸潤，半月板游離緣明顯變鈍等。這種現(xiàn)象也許就是新鮮半月板移植后的爬行替代表現(xiàn)，只是不像經(jīng)過消毒和低溫保存后的半月板移植那么明顯，而且移植的半月板和周圍的滑膜及其它軟組織能夠很快、很好地愈合在一起。李學金等[27]對兔進行新鮮半月板同種異體移植的實驗觀察，顯示術(shù)后12個月時，移植體能夠成活，而且具有正常的結(jié)構(gòu)和功能，防止了膝關節(jié)退變，但這個研究并沒有進行其它時間段例如術(shù)后3個月、6個月的觀察，而且僅僅進行了HE染色的組織學觀察。其它一些新鮮半月板移植的動物實驗，例如Kelly等[28]、Szomor[29]和Rijk等[33，34]的文獻都主要關注于半月板移植后對于脛骨和股骨骨軟骨的保護作用，而并未對移植半月板本身的組織學變化進行病理學觀察和分析。

考慮到免疫排斥的因素，也許新鮮半月板移植因為存在相對更多的免疫原性物質(zhì)而更容易受到受體機體的排異，但目前無論是臨床試驗還是動物實驗，都沒有明確證實新鮮的移植的半月板比消毒保存后的移植半月板壽命更短[8，10，35，36]，這可能跟半月板本身屬于移植免疫優(yōu)勢組織有關[27，37]。即便如此，本實驗的結(jié)果還是顯示出，隨著移植的時間推移，新鮮同種異體移植的兔半月板組織內(nèi)部膠原纖維還是在不斷退變，使結(jié)締組織結(jié)構(gòu)逐漸弱化，很可能最終導致移植物的失效。另外，如果要比較新鮮的同種異體半月板和經(jīng)過消毒和低溫保存的半月板在移植后兩種移植物的病理結(jié)構(gòu)、尤其是膠原結(jié)構(gòu)變化的異同，顯然需要進一步的對照研究來證實。

當然，我們采用的移植方法主要是將移植物進行軟組織固定，而一般文獻認為半月板前后角骨性固定具有良好的初步穩(wěn)定性，半月板移植最好用前后骨栓進行固定[38]。但絕大多數(shù)的動物實驗研究都采用軟組織固定，可能跟我們同樣考慮到動物尤其是兔子的半月板體積非常小，很難進行良好的前后骨栓固定。而且多位作者的研究也證實了這種固定方式可以在短期內(nèi)獲得滿意的移植效果[21-23]。另外，文獻認為移植半月板和原有半月板大小的誤差在10%以內(nèi)被認為是可接受的[39]。本組中所有進行同種異體移植的半月板都是采用相同月齡的兔子，而且都是采用內(nèi)側(cè)半月板移植物，故在尺寸上的差異都小于10%，基本能夠保證移植物跟脛股關節(jié)的匹配。

本研究的局限性。第一，可以進一步進行掃描電鏡的研究，來觀察移植后半月板纖維結(jié)締組織的微觀結(jié)構(gòu)變化，可能會更加直觀。第二，本研究未對半月板組織進行Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的特異性免疫組化染色，天狼星紅染色可能會因為方法的問題，產(chǎn)生對膠原種類和定量觀察的局限性。第三，因為本組實驗動物數(shù)量不多，觀察時間最長也僅僅為半年，故也許需要時間更長、樣本量更大的實驗來進一步驗證本實驗結(jié)果。第四，本組沒有設置其它的對照組，今后的研究中可以設計與經(jīng)過消毒和深低溫保存過的同種異體半月板或者異種異體半月板進行對照研究。

4 結(jié)論

兔同種異體新鮮半月板移植術(shù)后6周愈合良好，但存在明顯異物反應表現(xiàn)，12周和24周部分移植物會出現(xiàn)明顯肉眼可見的皺縮和鏡下可見的基質(zhì)松散現(xiàn)象。而且隨著時間推移，內(nèi)部膠原纖維從Ⅰ型膠原為主逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)棰笮湍z原為主。這種變化先從中心區(qū)開始，范圍逐漸擴大，使移植物的結(jié)締組織結(jié)構(gòu)逐漸弱化，可能最終導致移植物的失效。

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Macroscopic and Histological Evaluations of Allogeneic Fresh Meniscus Transplantation in Rabbits

Yang Yuping，Zhang Jiying，Duan Xiaoning，Hu Xiaoqing，Meng Qingyang，Liu Zhenlong，Shi Weili，Ao Yingfang
Institute of Sports Medicine，Peking University Third Hospital，Beijing 100191，China Corresponding Author：Ao Yingfang，Email：yingfang.ao@vip.sina.com

ObjectiveTo investigate the morphological transmutation of the allogeneic fresh meniscus trans?plantation in rabbits.MethodsTwelve adult New Zealand white rabbits were divided into 3 groups according to the time they were executed after transplantation：6 weeks，12 weeks and 24 weeks，each of 4.Every two rabbits underwent surgery at the same time to exchange the medial meniscus on the experimental side.The allogeneic fresh medial meniscus transplantation was thus performed.Then they were killed to get the meniscus.The heal?ing of the meniscus was observed and histological examination was conducted using HE staining and Sirius red staining.ResultsSix weeks after the transplantation，the transplanted meniscus and its surrounding issues healed well.In both the 12-week and the 24-week groups，50%of the menisci showed visible shrinkage and ma?trix loose.There were foreign body reactions in all 3 groups，such as vascular proliferation，fibrosis and lympho?cyte infiltration.Sirius red staining demonstrated that，in the 6-week-group typeⅢcollagen accounted for less than one third in 75%of the specimens；it accounted for between one-third and two-thirds in 50%of the speci?mens in the 12-week-group；in the 24-week-group，it occupied two thirds.Twenty-five percent of the collagen in the 6-week-group had a small amount of collagen fiber loose；in the 12-week-group，all had a small amount of collagen fiber loose mainly in the central part；in the 24-week-group 50%had a large amount of collagen fi?ber loose，covering the whole region.There were significant differences among the three groups（P＜0.05）.ConclusionSix weeks after transplantation of the fresh allograft meniscus，although with obvious foreign body reac?tion，the healing ability was good.50%of the menisci showed visible shrinkage and matrix loose at 12 weeks and 24 weeks.The internal collagen fiber transformed gradually from typeⅠcollagen to typeⅢcollagen.The change starts from the central region，expanding gradually.Subsequently it weakens connective tissue structure of the graft and may ultimately lead to transplantation failure.

allograft，meniscus，transplantation，collagen，histology

2016.10.14

敖英芳，Email：yingfang.ao@vip.sina.com