刁巧虹，卞國志，王 娟，羅藹劍，張 瑩，高瀟祎，袁建豐，孫凌霜

（1.廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司，廣州 511400；2.廣東海大集團(tuán)股份有限公司，廣州 511400；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642）

·綜述·

奶牛乳房炎病原檢測技術(shù)研究進(jìn)展

刁巧虹1,3，卞國志2,3，王 娟1,2，羅藹劍3，張 瑩3，高瀟祎3，袁建豐1,2，孫凌霜3

（1.廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司，廣州 511400；2.廣東海大集團(tuán)股份有限公司，廣州 511400；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642）

奶牛乳房炎是危害奶牛業(yè)最重要的疾病之一，不僅給奶牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且其某些病原體可引起人類感染。引起奶牛乳房炎的病原多達(dá)150種，及時(shí)、準(zhǔn)確的診斷乳房炎并檢測出致病菌，對(duì)奶牛乳房炎的綜合防治有著重要意義。目前，檢測乳房炎病原的方法主要有細(xì)菌分離鑒定法、免疫學(xué)檢測法、基因芯片和PCR檢測技術(shù)等。本文就奶牛乳房炎病原檢測技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)闡述，旨在為奶牛乳房炎的綜合防治提供參考。

乳房炎；病原；檢測技術(shù)；奶牛

奶牛乳房炎是危害奶牛業(yè)最重要的疾病之一，不僅能引起產(chǎn)奶量及其品質(zhì)下降，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而且患病奶牛所產(chǎn)牛奶中的某些病原體可引起人類感染。中國大部分地區(qū)奶牛乳房炎的檢出率在50%以上，而引起奶牛乳房炎的病原有細(xì)菌、病毒、真菌、支原體和綠藻等150多種。調(diào)查顯示最常見的致病菌有金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和酵母菌等[1-3]。根據(jù)臨床表現(xiàn)可將奶牛乳房炎分為隱性型乳房炎和臨床型乳房炎。常用的診斷方法有體細(xì)胞直接計(jì)數(shù)法、CMT檢測法、黏度測試法、DNA含量測定法、ATP生物發(fā)光法技術(shù)、乳汁電導(dǎo)率的測定、乳汁pH值測定、乳成分直接檢測和MTT檢測法等，但是這些診斷方法都不能直接檢測出病原體的類型，難以對(duì)乳房炎的治療和預(yù)防提供及時(shí)確切的參考。目前能檢測乳房炎病原的方法主要有細(xì)菌分離鑒定法、免疫學(xué)檢測法、基因芯片和PCR檢測技術(shù)等。

1 乳汁中致病菌分離鑒定法

乳汁中致病菌的分離鑒定是傳統(tǒng)的奶牛乳房炎的診斷方法，主要包括無菌采集待檢乳樣，使用分離培養(yǎng)基和生化培養(yǎng)基進(jìn)行分離鑒定，涂片染色、鏡檢和藥敏試驗(yàn)等。細(xì)菌分離鑒定能夠詳細(xì)分析感染乳房炎的病原菌種類，確診不同類型的乳房炎，但該法耗時(shí)長，成本較高。

2 免疫學(xué)檢測法

根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的反應(yīng)特性，免疫學(xué)檢測法可用于特異性檢測乳汁中的病原，如檢測鏈球菌的乳膠凝集法[4]、免疫層析法[5]。免疫學(xué)檢測法具有較好的特異性和靈敏度，操作簡便，反應(yīng)快，但易受環(huán)境及溶質(zhì)的影響。

3 基因芯片技術(shù)

基因芯片由大量的DNA探針構(gòu)成，可對(duì)多種病原微生物進(jìn)行同時(shí)檢測，縮短了乳房炎診斷的時(shí)間。李秀萍等[6]建立的以16S rRNA為基礎(chǔ)的基因芯片技術(shù)，6～7 h即可檢測出金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌、綠膿桿菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌6種牛乳房炎致病菌。邢會(huì)杰等[7]同樣以16S rRNA為靶基因構(gòu)建了檢測無乳鏈球菌、肺炎克雷伯氏菌、奇異變形桿菌和金黃色葡萄球菌的基因芯片方法，可以快速、特異、準(zhǔn)確地對(duì)這4種菌株進(jìn)行檢測和鑒定。Lee等[8]開發(fā)了可以檢測棒狀桿菌、牛支原體、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、牛鏈球菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌7種病原體的基因芯片。基因芯片技術(shù)具有方便、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，但是因其成本昂貴，且耗時(shí)相對(duì)較長，現(xiàn)階段難以投入臨床中使用。

4 多聚酶鏈?zhǔn)剑≒olymerase chain reaction，PCR）診斷法

4.1 普通PCR診斷法 自1985年P(guān)CR技術(shù)發(fā)明以來，憑借其快速、特異性強(qiáng)、敏感性高的特點(diǎn)，PCR檢測法已被廣泛運(yùn)用于奶牛乳房炎病原微生物檢測。國內(nèi)外現(xiàn)已構(gòu)建了針對(duì)乳房炎主要致病菌的多種PCR檢測體系。Meiri-Bendek等[9]根據(jù)16S rRNA基因設(shè)計(jì)引物建立了無乳鏈球菌PCR檢測體系。陳玉霞等[10]根據(jù)16-23S rRNA之間的序列設(shè)計(jì)引物，建立了快速、特異的金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和停乳鏈球菌PCR檢測體系。李棟梁等[11]據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌、乳酸乳球菌、變形桿菌、綠膿桿菌和腸球菌的16S rRNA分別設(shè)計(jì)了5對(duì)引物，進(jìn)行PCR檢測，具有靈敏、高效的特點(diǎn)。普通PCR技術(shù)價(jià)格低廉，有著優(yōu)良的特異性和靈敏度，但是檢測病原單一。

4.2 多重PCR診斷法 引起奶牛乳房炎的病原菌種類多，且多呈混合感染，目前已有針對(duì)乳房炎主要致病菌構(gòu)建的多重PCR診斷體系。高玉梅等[12]根據(jù)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌和停乳鏈球菌16S-23S rRNA區(qū)域以及白色念珠菌18S rRNA序列設(shè)計(jì)了5對(duì)特異性引物，建立了有較好特異性的五重PCR技術(shù)。許信剛等[13]根據(jù)鏈球菌ef-tu基因、金黃色葡萄球菌nuc基因、沙門氏菌hut基因和大腸桿菌23S rRNA基因序列，設(shè)計(jì)4對(duì)引物，構(gòu)建了四重PCR體系。陳亞明等[14]根據(jù)無乳鏈球菌sip基因、金黃色葡萄球菌nuc基因、大腸桿菌rrnB基因和蠟樣芽孢桿菌hblA基因構(gòu)建四重PCR體系。Shome[15]對(duì)10種牛乳房炎的致病菌建立了多重PCR檢測體系。多重PCR體系可一次檢測多種病原，相對(duì)于普通PCR，雖其靈敏度有所下降，但其方便、省時(shí)、廉價(jià)的特點(diǎn)使其應(yīng)用前景廣闊。

4.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR診斷法 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR）是利用熒光信號(hào)監(jiān)測整個(gè)PCR擴(kuò)增過程，通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線來對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。劉繼超等[16]根據(jù)金黃色葡萄球菌腸毒素A基因序列，設(shè)計(jì)引物和Taqman探針，建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系，其靈敏度達(dá)到1.3×102CFU/mL。Koskinen等[17]對(duì)鏈球菌、大腸桿菌和葡萄球菌等11個(gè)常見的病原進(jìn)行熒光定量檢測，均具有很好的特異性和靈敏度。Singh等[18]構(gòu)建了檢測李斯特菌和沙門氏菌的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系。實(shí)時(shí)熒光定量PCR與普通PCR相比，靈敏度得到了一定的提升，且能定量檢測出乳房炎樣品中病原體數(shù)，可在一定程度上對(duì)乳房炎病程發(fā)展進(jìn)行判斷。

4.4 可視化介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)是根據(jù)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條引物，使用鏈置換DNA聚合酶，在恒溫的條件下擴(kuò)增出LAMP特征性梯狀條帶[19]。LAMP在乳房炎的檢測上發(fā)展迅速，賀婷等[20]根據(jù)鏈球菌屬的特異性基因（tuf）設(shè)計(jì)一套LAMP引物，在水浴鍋中1 h內(nèi)完成反應(yīng)，其敏感性最高達(dá)到52 fg/μL。白智迪[21]根據(jù)牛支原體uvrC基因設(shè)計(jì)引物，在58℃下作用1 h，敏感度為3.4×101CFU/μL，特異性強(qiáng)。LAMP檢測法能快速得到肉眼可見的檢測結(jié)果，敏感性好，特異性強(qiáng)，操作簡便，為乳房炎檢測提供一個(gè)新的發(fā)展平臺(tái)。

5 結(jié)語

奶牛乳房炎是危害奶牛業(yè)最常見的疾病之一，影響牛奶的產(chǎn)量和質(zhì)量。目前乳房炎病原菌的檢測方法中，細(xì)菌的分離鑒定是傳統(tǒng)的確診病原菌類型的方法，存在耗時(shí)長的缺點(diǎn)。基因芯片技術(shù)能同時(shí)檢測出大量病原，但耗時(shí)仍比較長，且成本昂貴，難以普及。PCR方法能夠準(zhǔn)確鑒定致病菌，并且縮短了鑒定的時(shí)間，成本較低。多重PCR敏感性與普通PCR相比有所下降，但是可一次檢測多種病原，縮減了檢測時(shí)間和成本。實(shí)時(shí)熒光定量PCR能進(jìn)行定性定量檢測，學(xué)者們將其與傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定方法做比較，證明了該法有良好的靈敏度和特異性[22]。LAMP法能夠在1 h內(nèi)得出肉眼可見的結(jié)果，極大的縮短了檢測的時(shí)間，今后將會(huì)更廣泛的運(yùn)用于乳房炎的檢測。隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，相信未來可以研制出快速、靈敏性高、特異性強(qiáng)、操作便捷且廉價(jià)的早期奶牛乳房炎檢測方法。

[1] 欒廷波, 李蓓蓓. 石河子地區(qū)規(guī)?；瞿膛ｋ[性乳房炎的檢測與流行特點(diǎn)分析[J]. 中國奶牛, 2015(9): 55-59.

[2] 吳亞文, 李志紅, 楊佳冰, 等. 寧夏地區(qū)奶牛隱性乳房炎主要病原菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]. 中國動(dòng)物檢疫,2015(3): 4-7.

[3] 陳亞明. 奶牛乳房炎致病菌分離鑒定及快速診斷試劑盒的研發(fā)與應(yīng)用[D]. 南寧: 廣西大學(xué), 2014.

[4] 黃越芳, 王清文, 阮明, 等. 乳膠凝集試驗(yàn)快速診斷新生兒B群鏈球菌敗血癥[J]. 新醫(yī)學(xué), 2002, 33(1): 16-18.

[5] Matsui H, Kimura J, Higashide M, et al. Immunochromatographic detection of the group B streptococcus antigen from enrichment cultures[J]. Clin Vaccine Immunol,2013, 20(9): 1381-1387.

[6] 李秀萍, 尹遜河, 高晨, 等. 通用基因芯片對(duì)奶牛乳房炎主要致病菌的檢測[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2008, 29(6): 19-23.

[7] 邢會(huì)杰, 曹榮峰, 師志海, 等. 奶牛乳房炎主要致病菌16S rDNA基因芯片檢測方法的建立[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2008, 30(12): 939-943.

[8] Lee K H, Lee J W, Wang S W, et al. Development of a novel biochip for rapid multiplex detection of seven mastitis-causing pathogens in bovine milk samples[J]. J Vet Diagn Invest, 2008, 20(4): 463-471.

[9] Meiri-Bendek I, Lipkin E, Friedmann A, et al. A PCR-based method for the detection of Streptococcus agalactiae in milk[J]. J Dairy Sci, 2002, 85(7): 1717-1723.

[10] 陳玉霞, 林峰. 3種奶牛乳房炎主要病原菌PCR檢測方法的建立[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2012, 28(17): 105-108.

[11] 李棟梁, 寇亞楠, 宋月, 等. 利用16S rDNA檢測奶牛乳房炎5種病原菌PCR方法的建立及應(yīng)用[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2014, 43(6): 132-136.

[12] 高玉梅, 何寶祥. 多重PCR快速檢測奶牛乳房炎5種病原菌方法的建立與應(yīng)用[C]. 青島: 中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜內(nèi)科學(xué)分會(huì)學(xué)術(shù)研討會(huì), 2009.

[13] 許信剛, 楊麗花, 童德文. 鏈球菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌和大腸桿菌多重PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2012, 32(4): 534-538.

[14] 陳亞明, 杜玉蘭, 聶培, 等. 奶牛乳房炎3種主要致病菌三重PCR檢測方法的建立[J].中國動(dòng)物檢疫, 2014, 31(7):82-85.

[15] Shome B R, Das Mitra S, Bhuvana M, et al. Multiplex PCR assay for species identification of bovine mastitis pathogens[J]. J Appl Microbiol, 2011, 111(6): 1349-1356.

[16] 劉繼超, 姜鐵民, 姜阿赤, 等. 基于TaqMan探針熒光定量PCR技術(shù)快速檢測乳中金黃色葡萄球菌腸毒素A[J]. 中國食品學(xué)報(bào), 2015, 15(6): 162-166.

[17] Koskinen M T, Holopainen J, Pyorala S, et al. Analytical specificity and sensitivity of a real-time polymerase chain reaction assay for identification of bovine mastitis pathogens[J]. J Dairy Sci, 2009, 92(3): 952-959.

[18] Singh J, Batish V K, Grover S. Simultaneous detection of Listeria monocytogenes and Salmonella spp. in dairy products using real time PCR-melt curve analysis[J]. J Food Sci Technol, 2012, 49(2): 234-239.

[19] Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, et al. Loopmediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic Acids Res, 2000, 28(12): E63.

[20] 賀婷. 奶牛鏈球菌性乳房炎可視化LAMP檢測方法的建立及應(yīng)用[D]. 南寧: 廣西大學(xué), 2014.

[21] 白智迪. 牛支原體LAMP檢測方法的建立及體外傳代致弱菌株的特性鑒定[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011.

[22] Hiitio H, Riva R, Autio T, et al. Performance of a realtime PCR assay in routine bovine mastitis diagnostics compared with in-depth conventional culture[J]. J Dairy Res, 2015, 82(2): 200-208.

RESEARCH PROGRESS ON DETECTION OF DAIRY COW MASTITIS PATHOGENS

DIAO Qiao-hong1,3, BIAN Guo-zhi2,3, WANG Juan1,2, LUO Ai-jian3, ZHANG Ying3, GAO Xiao-yi3,YUAN Jian-feng1,2, SUN Ling-shuang3

(1.Guangdong Haid Institute of Animal Husbandry & Veterinary, Guangzhou 511400, China; 2. Guangdong Haid Group Co., Limited,Guangzhou 511400, China; 3.College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

Mastitis is one of the most important diseases that cause signi fi cant economic loss in dairy industry. Some mastitis pathogens have importance of public health. There are more than 150 species pathogens that can cause mastitis. Attempts to diagnose and detect these pathogens timely and accurately have been of signi fi cance in comprehensive prevention of dairy mastitis. Currently, major methods for detection of mastitis include isolation and identification of pathogens, immunological assays, gene chip and PCR. This summary provides the systemic illustration on detection methods and measures for integrated control of mastitis in dairy cows.

Mastitis; pathogen; detection method; dairy cow

S852.4

A

1674-6422（2017）04-0076-04

2016-07-14

廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（201510010250）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014A020208052）；廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司自主項(xiàng)目

刁巧虹，女，碩士研究生，臨床獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

袁建豐，E-mail：yuanjf@haid.com.cn；孫凌霜，E-mail：lsun42013@scau.edu.cn