王國(guó)明

(昌樂(lè)縣畜牧獸醫(yī)局，山東昌樂(lè) 262400)

毛皮動(dòng)物肺炎克雷伯氏菌分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育及微膠囊疫苗的研制分析

王國(guó)明

(昌樂(lè)縣畜牧獸醫(yī)局，山東昌樂(lè) 262400)

肺炎克雷伯氏菌在以前并沒(méi)有對(duì)畜禽造成嚴(yán)重的危害，對(duì)于該菌種的研究工作只停留在認(rèn)識(shí)階段。然而近幾年由于抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，造成該菌種的耐藥性大幅提升，出現(xiàn)多重耐藥菌株，對(duì)于毛皮動(dòng)物的危害也日益突顯出來(lái)。在毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖環(huán)境不斷變化的情況下，養(yǎng)殖業(yè)的科研人員需要對(duì)肺炎克雷伯氏菌的作用機(jī)理地進(jìn)行深入的分析，為抗病疫苗的研發(fā)工作奠定良好的基礎(chǔ)。

微膠囊疫苗 系統(tǒng)發(fā)育 肺炎克雷伯氏菌

克雷伯氏菌屬于腸桿菌科，包括五個(gè)種，即變形克雷伯氏菌、變形克雷伯氏菌、土生克雷伯氏菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌、肺炎克雷伯氏菌。其中產(chǎn)酸克雷伯氏菌與肺炎克雷伯氏菌兩個(gè)菌種與動(dòng)物和人類的致病性有關(guān)。當(dāng)前我國(guó)毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)普遍存在的流行疾病基本上有著比較一致的癥狀表現(xiàn)特征，然而相關(guān)的致病機(jī)理卻十分復(fù)雜，需要對(duì)其進(jìn)行深入的研究與分析。其中肺炎克雷伯氏菌廣泛分布于自然界中，是定植于動(dòng)物與人類腸道、呼吸道內(nèi)的典型致病菌，可能引發(fā)創(chuàng)傷感染、支氣管炎、肝膿腫、腸炎以及腦膜炎等疾病。對(duì)于毛皮動(dòng)物來(lái)說(shuō)，該菌會(huì)影響到毛皮質(zhì)量，影響毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益，本文對(duì)肺炎克雷伯氏菌的防控措施以及生物學(xué)生特性進(jìn)行了詳細(xì)的闡述與分析。

1 資料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料來(lái)源

本次研究選取病死毛皮動(dòng)物樣本173例，其中包含66頭份水貂、56頭份狐貍以及51頭份貉子。

1.1.2 菌株

從死亡毛皮動(dòng)物中獲取奇異變形桿菌與沙門氏菌并保存于實(shí)驗(yàn)室中；肺炎克雷伯氏菌樣本來(lái)源為雞源2株、豬源2株、貉源2株、狐源2株、貂源4株。

1.1.3 主要儀器

本次實(shí)驗(yàn)所選取的儀器為：UV-1100型可見(jiàn)分光光度計(jì)、PE-6800VET型全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀、高速膠體勻漿機(jī)、流式細(xì)胞儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)樣本

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物

270只清潔級(jí)昆明小鼠以及18只BALB/C小白鼠。

1.2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)

173份病死樣本，即水貂、狐貍以及豹子的氣管、肝臟與肺臟均接種新鮮兔血營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，每份臟器各接種平板2份，其中厭氧培養(yǎng)與氧培養(yǎng)各一份，將恒溫箱內(nèi)保存并對(duì)培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行觀察。

1.2.3 藥敏試驗(yàn)

選取疑似肺炎克雷伯氏菌8株，于LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，再用藥敏紙片于培養(yǎng)基表面進(jìn)行覆蓋，經(jīng)過(guò)24h的培養(yǎng)后，對(duì)抑菌環(huán)直徑進(jìn)行測(cè)量。

1.2.4 人工感染試驗(yàn)

將所選取的全部分離菌置于肉湯中進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)20小時(shí)的培養(yǎng)后再對(duì)含菌量進(jìn)行計(jì)算，待含菌量在1.4×109CFU/ml以上時(shí)，將BALB/C小白鼠樣本平均分為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組兩組，取2ml生理鹽水平均注射于對(duì)照組9例小白鼠樣本中，另取0.2ml菌液平均注射于實(shí)驗(yàn)組9例小白鼠樣本中。經(jīng)過(guò)一周后，對(duì)所有研究樣本的死亡情況與發(fā)病情況進(jìn)行觀察，對(duì)死亡樣本進(jìn)行解剖分析，并對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離處理。

2 肺炎克雷伯氏菌微膠囊口服疫苗的制備

2.1 測(cè)定試驗(yàn)菌株

根據(jù)改良寇氏法來(lái)試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，取SPF級(jí)昆明小鼠60只，將其分為6組，前5組各注射0.2ml細(xì)菌，最后一組注射等量的生理鹽水。對(duì)小白鼠死亡情況進(jìn)行觀察，再根據(jù)寇氏法計(jì)算對(duì)LD50指標(biāo)進(jìn)行計(jì)算。

2.2 制備全菌免疫原

在LB液體培養(yǎng)基中接種K1株，經(jīng)過(guò)36h的培養(yǎng)，對(duì)細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，調(diào)整菌液深度至150億/mL，在完成滅活處理后再對(duì)其進(jìn)行乳化操作，形成滅活苗。

2.3 提取OMP

利用Wooldridge法對(duì)肺炎克雷伯氏菌內(nèi)部所包含的OMP進(jìn)行提取，提取步驟主要包含：（1）K1菌株培養(yǎng)與震蕩過(guò)夜；（2）離心處理并收集菌體，將菌體樣本置于MgCl2溶液中，重懸一次；（3）通過(guò)超聲波設(shè)備對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎處理，在通過(guò)離心處理清除破碎細(xì)胞與細(xì)胞核；（4）上清高速離心，將離心后的樣本溶于Tris-MgCl2溶液中，再進(jìn)行降解內(nèi)膜蛋白處理；（5）溶液高速離心，沉淀操作完成后，利用緩沖液再懸浮；（6）懸液經(jīng)透析后，將樣本置于保溫箱中備用。

2.4 制備微膠囊疫苗制

通過(guò)界面、噴霧配位法對(duì)疫苗進(jìn)行制備，事先將海藻酸鈉溶液倒入燒杯中，對(duì)其進(jìn)行機(jī)械攪拌處理，在攪拌的過(guò)程中加入全菌體疫苗，利用高壓槍向微膠囊固化器中噴入攪拌好的液體，在離心沉淀操作完成后，再進(jìn)行4min的機(jī)械攪拌，用殼聚糖交聯(lián)，最后將所配置的樣品妥善保存起來(lái)。

2.5 肺炎克雷伯氏菌微膠囊疫苗特性

肺炎克雷伯氏菌能夠造成家兔的肺炎以及腸炎，大熊貓的肝炎與腹瀉等疾病，牛、竹鼠以及水貂等大量死亡。經(jīng)過(guò)方面的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，毛皮動(dòng)物的流行疾病普遍有著極強(qiáng)的抗藥性，需要用專門的新型疫苗對(duì)部分疾病進(jìn)行防治。

通過(guò)光學(xué)顯微鏡對(duì)疫苗開(kāi)關(guān)進(jìn)行觀察，對(duì)視野區(qū)域進(jìn)行固定，經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，本次實(shí)驗(yàn)所選取的視野范圍內(nèi)一共存在微膠囊298個(gè)，通過(guò)SPSS17.0軟件對(duì)粒徑正態(tài)分布曲線、分布范圍與平均粒徑進(jìn)行分析。在對(duì)其進(jìn)行電膠固定噴金處理后，通過(guò)掃描電鏡對(duì)疫苗物理性狀進(jìn)行觀察。

3 結(jié)語(yǔ)

本次實(shí)驗(yàn)所采用的界面-噴霧配位法所配置的肺炎克雷伯氏菌微膠囊疫苗具有充分的安全性，直徑在6.908μm左右，免疫后能夠?qū)Ⅲw液免疫能力充分激活，恢復(fù)局部黏膜免疫與細(xì)胞免疫，保護(hù)作用良好，相比于常規(guī)的滅活動(dòng)疫苗，免疫保護(hù)能力更優(yōu)。

[1] 鐘世勛.毛皮動(dòng)物肺炎克雷伯氏菌分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析及其微膠囊疫苗的研制[D].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[2] 遲珊珊.泰山松花粉多糖對(duì)水貂肺炎克雷伯氏菌莢膜多糖亞單位疫苗的免疫增強(qiáng)效果[D].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[3] 王靜.槐花多糖對(duì)水貂肺炎克雷伯氏菌滅活疫苗的免疫增強(qiáng)效果的研究[D].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.