曹 玨，李貽奎，陳孟倩，姚魁武*

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院,北京 100053； 2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091； 3.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

研究進(jìn)展

大鼠急性心肌梗死模型制備方法研究進(jìn)展

曹 玨1,3，李貽奎2，陳孟倩1，姚魁武1*

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院,北京 100053； 2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091； 3.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

急性心肌梗死是危害人類生命的重大疾病之一。心肌梗死動(dòng)物模型對(duì)研究人類心肌梗死的病理生理變化、診斷和治療有著重要意義。目前心肌梗死動(dòng)物模型的制備主要存在動(dòng)物存活率低、繁瑣復(fù)雜等問(wèn)題。近年來(lái)，針對(duì)心肌梗死動(dòng)物模型制備方法研究取得一些進(jìn)展，在模型動(dòng)物存活率、模型動(dòng)物合格率、制備模型速度等方面具有一定的提高。該文就急性心肌梗死模型的制備方法及相關(guān)研究現(xiàn)狀進(jìn)行分析，結(jié)合實(shí)際因素以期簡(jiǎn)化模型制備過(guò)程，提高科研人員的造模水平，從而為醫(yī)學(xué)研究提供穩(wěn)定可靠的急性心肌梗死模型來(lái)源。

大鼠；急性心肌梗死模型；自主呼吸；冠脈結(jié)扎；麻醉；檢測(cè)指標(biāo)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI) 是全世界病死率較高的疾病之一。誘導(dǎo)受損的心肌細(xì)胞再生成為治療急性心肌梗死的重要臨床目標(biāo)，而標(biāo)準(zhǔn)化的動(dòng)物模型是心肌細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)研究的基礎(chǔ)[1，2]。因?yàn)榇笫蠹毙孕募」Ｋ滥Ｐ团c臨床AMI病理生理過(guò)程有一定的相似性，模型的存活時(shí)間較長(zhǎng)、變異性低、可重復(fù)性高、相對(duì)穩(wěn)定性好以及價(jià)格適宜、易于飼養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)突出，是模型制備及研究的良好動(dòng)物模型來(lái)源[3]。雖然大鼠造模有上述諸多優(yōu)點(diǎn)，加之眾多科研工作者對(duì)造模方法做了大量的研究與探討，但在實(shí)際制作過(guò)程中依然存在如下問(wèn)題：大鼠本身的個(gè)體差異明顯，存在手術(shù)過(guò)程中不耐受的現(xiàn)象；手術(shù)者的水平參差不齊，對(duì)大鼠的處理流程存在差異，相應(yīng)地導(dǎo)致制備時(shí)間增加，造成手術(shù)者精力及體能的消耗隨之增加，難以保證造模操作的連貫完整。以上因素都會(huì)導(dǎo)致大鼠的存活率及造模成功率下降。所以將其用于心血管事件及心肌細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)的機(jī)制的研究依舊有很大的挑戰(zhàn)和難度。該文通過(guò)近年來(lái)對(duì)大鼠AMI模型建立的總結(jié)和制備過(guò)程重點(diǎn)環(huán)節(jié)的研究探討，為標(biāo)準(zhǔn)化AMI大鼠模型的制備方法提供切實(shí)可信的改進(jìn)方案，提高模型的生存率和造模成功率，降低制備過(guò)程的難度提供參考。

1 關(guān)于是否建立人工氣道的選擇

過(guò)去認(rèn)為呼吸支持可以提高實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷纳媛?，?jīng)典的Jones[4]法造模是在大鼠自主呼吸條件下為其佩戴呼吸面罩，連通動(dòng)物呼吸機(jī)持續(xù)正壓通氣為大鼠提供呼吸支持。之后國(guó)內(nèi)外眾多的科研學(xué)者也在對(duì)Jones法進(jìn)行改良，很多造模方法中也經(jīng)常把動(dòng)物呼吸機(jī)作為實(shí)驗(yàn)必備的儀器之一；王學(xué)文等[2]、楊文慧等[5]選用經(jīng)口直視插管接通動(dòng)物呼吸機(jī)為AMI大鼠模型支持呼吸，在確定大鼠呼吸頻率與呼吸機(jī)一致后，對(duì)呼吸機(jī)進(jìn)行設(shè)定：容量控制模式，呼吸頻率為每分鐘50～75次，吸呼比為1∶1，潮氣量為10～15 mL/250 g體重；劉宇等[6]，趙傳艷等[7]采用在氣管第2、3或4、5軟骨環(huán)處切開(kāi)，進(jìn)行深度1.0 cm插管并接通動(dòng)物呼吸機(jī)的方式支持呼吸；Ilayaraja等[8]采用兩種插管方案：第一種為在大鼠頸部提供光源，在光源下經(jīng)口插管；第二種為在頸部正中做出5 mm的切口，并在立體顯微鏡注視下將管針插入氣管內(nèi)，兩種方案均需接通呼吸機(jī)，設(shè)定潮氣量為小鼠體重(g)的3倍+155 μL，設(shè)定頻率每分鐘120次。但在實(shí)際制備過(guò)程中對(duì)呼吸機(jī)的參數(shù)設(shè)定需要消耗時(shí)間，如選用無(wú)創(chuàng)的呼吸面罩通氣，死腔樣通氣效應(yīng)[7]明顯，可能導(dǎo)致大鼠體內(nèi)CO2蓄積，而且操作過(guò)程中無(wú)法監(jiān)測(cè)氣道內(nèi)壓力，為調(diào)節(jié)氣道內(nèi)壓力以防止氣道壓過(guò)高造成的肺損傷帶來(lái)困難；而在改良的方法中如對(duì)大鼠進(jìn)行有創(chuàng)氣管插管，不論是經(jīng)口直視插管還是氣管切開(kāi)插管，即便是熟練的操作者，成功建立有創(chuàng)通氣所需時(shí)間仍在10 min以上，難度很大。同時(shí)在大鼠頸部周圍進(jìn)行有創(chuàng)操作的創(chuàng)傷很大，1次插管失敗后反復(fù)插管易造成喉頭水腫，難度的提升增加了實(shí)驗(yàn)過(guò)程所需時(shí)間，同樣延長(zhǎng)了麻醉時(shí)間，這很大程度上是增加了大鼠模型的死亡率。而且購(gòu)置呼吸機(jī)和相關(guān)器械也增加了科研成本。從而有部分學(xué)者將目光轉(zhuǎn)向非人工通氣條件下[9，10]制備大鼠AMI模型。在摒棄動(dòng)物呼吸機(jī)、大鼠完全自主呼吸的條件下，模型的生存率依然沒(méi)有下降。李貽奎等[10]，閆奎坡等[11]按照是否在動(dòng)物呼吸機(jī)條件下制備的AMI模型進(jìn)行分組比較，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生存率及造模成功率未見(jiàn)明顯差異。而在非人工通氣條件下最突出的優(yōu)勢(shì)在于簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)過(guò)程，縮短手術(shù)過(guò)程所需時(shí)間，加快模型制作速度，顯著提高造模效率；同時(shí)相比于氣管插管這一有創(chuàng)操作，降低了大鼠呼吸道的損傷程度，保護(hù)其機(jī)體生理結(jié)構(gòu)以利于其術(shù)后呼吸功能恢復(fù)和生存；且降低了大鼠的應(yīng)激反應(yīng)，也免去在拔管后清除呼吸道分泌物及進(jìn)行縫合氣道的操作。

2 冠狀動(dòng)脈結(jié)扎手術(shù)方式的選擇

結(jié)扎冠狀動(dòng)脈是制備AMI動(dòng)物模型最主要的方法，Jones法中對(duì)大鼠心臟左冠狀動(dòng)脈(left coronray artary，LCA)有詳細(xì)的描述。結(jié)扎LCA使其閉塞，造成心肌缺血，與臨床上心肌缺血及心梗時(shí)實(shí)際發(fā)病過(guò)程有相似之處。此方法能保證結(jié)扎位置和深度固定，控制心肌缺血的程度以增加造模成功率，以便日后進(jìn)行心電圖檢測(cè)和組織染色檢查等指標(biāo)的測(cè)定。目前制備大鼠AMI模型存在死亡率高，操作難度大，模型質(zhì)量難以保證，制備方法掌握起來(lái)比較困難等實(shí)際問(wèn)題。手術(shù)操作失敗的原因主要是手術(shù)過(guò)程長(zhǎng)，結(jié)扎位置過(guò)高導(dǎo)致惡性心律失常[12]發(fā)生。參照國(guó)內(nèi)學(xué)者的方法[2,10]，在非人工通氣條件下于胸骨左緣第4、5肋間隙皮膚處剪開(kāi)切口，用止血鉗沿胸骨左緣第4肋間穿入胸腔，鈍性分離胸大肌和前鋸肌，剝離心包，充分暴露術(shù)野，并輕壓胸廓擠出心臟；于左心耳下緣2 mm處用0號(hào)手術(shù)線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支(left anterior descending coronary artery, LAD)，結(jié)扎成功標(biāo)志為左心室前壁及心尖周圍心肌組織顏色蒼白、晦暗或青紫和運(yùn)動(dòng)減弱[13]，結(jié)扎后立即將心臟放回，迅速排出胸腔內(nèi)氣體，對(duì)合、捏緊并縫合皮膚。該方法使得心臟擠出時(shí)心尖上翹，肺自然被推到一邊，減少因手術(shù)操作對(duì)肺造成的損傷[14]。手術(shù)過(guò)程的創(chuàng)口較小，對(duì)大鼠胸部的解剖結(jié)構(gòu)影響較小，可使其結(jié)構(gòu)功能迅速恢復(fù)，便于開(kāi)胸取材。Gao等[15]對(duì)大鼠在非人工通氣條件下的冠脈結(jié)扎及傳統(tǒng)呼吸機(jī)模式下開(kāi)胸結(jié)扎進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)操作時(shí)間上前者平均(1.22±0.05)min，后者則平均(23.2±0.6)min，操作過(guò)程的時(shí)間因?yàn)槲唇⑷斯獾蓝s短，使大鼠的組織器官暴露于外界的時(shí)間縮短；術(shù)中大鼠死亡率前者為3%，后者為15.9%；心律失常的發(fā)生率在前者中明顯低于后者；前者在炎癥指標(biāo)的檢測(cè)中依然占有優(yōu)勢(shì)，在術(shù)后24 h及7 d的兩次檢測(cè)下，腫瘤壞死因子(TNF-α)及髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)在前者血液中含量顯著低于后者；在造模后28 d前者的生存率也較后者高近20%；同時(shí)LAD結(jié)扎的位置可以滿足AMI模型標(biāo)準(zhǔn)。手術(shù)過(guò)程的簡(jiǎn)化及較小的切口可以減輕手術(shù)對(duì)大鼠機(jī)體的損傷，提高其生存率及造模成功率。手術(shù)者掌握此方法的關(guān)鍵的是熟悉大鼠心臟的解剖和冠脈的走行，快速準(zhǔn)確定位并結(jié)扎LAD，相信經(jīng)過(guò)不斷對(duì)解剖基礎(chǔ)的夯實(shí)和實(shí)際操作的重復(fù)，熟練掌握操作技術(shù)并不困難。

3 麻醉方式的選擇

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉是很重要的環(huán)節(jié)，科研人員對(duì)麻醉是否了解對(duì)于制備動(dòng)物模型具有非常大的影響。模型制作過(guò)程當(dāng)中經(jīng)?？梢杂龅铰樽磉^(guò)淺而使手術(shù)過(guò)程中斷，或者整個(gè)手術(shù)過(guò)程較長(zhǎng)，麻醉過(guò)深造成模型的死亡的情況。理想的麻醉既要保證動(dòng)物在可耐受的條件下完成手術(shù)操作，又要使其在手術(shù)后盡快蘇醒以降低死亡率。目前國(guó)內(nèi)的麻醉劑研究中，汪新亮等[16]把水合氯醛、氯胺酮、丙泊酚進(jìn)行對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)麻醉起效時(shí)間由快到慢依次為氯胺酮、丙泊酚、水合氯醛，麻醉維持時(shí)間由短到長(zhǎng)依次為水合氯醛、丙泊酚、氯胺酮；麻醉致死量由高到低依次為氯胺酮、丙泊酚、水合氯醛；麻醉劑量安全線比較中水合氯醛較丙泊酚和氯胺酮高將近10倍。李少春等[17]對(duì)不同濃度水合氯醛對(duì)老年及青年大鼠的麻醉效果進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同年齡的大鼠對(duì)水合氯醛敏感程度不同：老年大鼠較正常劑量低的劑量才能既能保證理想的麻醉效果，又可降低死亡率；在不同濃度的水合氯醛對(duì)大鼠麻醉效果比較中，達(dá)到深度麻醉所需時(shí)間低濃度組短于高濃度組，大鼠蘇醒或出現(xiàn)反應(yīng)低濃度組快于高濃度組。在大鼠AMI造模過(guò)程中，對(duì)麻醉劑選用要求盡量安全、有效、廉價(jià)，通常把水合氯醛作為造模的麻醉劑，但依然要注意的是大鼠的年齡、體重在麻醉劑用量上的區(qū)分，并且要與科研人員的自身情況結(jié)合考慮。國(guó)外研究證實(shí)[18，19]，水合氯醛即便是以極低的濃度(36 mg/mL)用于大鼠麻醉也會(huì)導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)多發(fā)性肝壞死、腹膜炎及全身毒性，從而引起模型質(zhì)量下降。在手術(shù)操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的情況下，達(dá)到良好的麻醉效果增加麻醉劑用量，勢(shì)必會(huì)增加動(dòng)物死亡的風(fēng)險(xiǎn)。所以對(duì)科研人員和手術(shù)者來(lái)說(shuō)，優(yōu)化手術(shù)設(shè)計(jì)、簡(jiǎn)化手術(shù)操作也很重要。前文提到的手術(shù)方法的優(yōu)化可以保證手術(shù)過(guò)程時(shí)間縮短，從而減少麻醉劑用量，降低對(duì)動(dòng)物的影響和死亡率。而關(guān)于哪種麻醉藥物和哪種劑量最適合的問(wèn)題還存有爭(zhēng)議，需結(jié)合具體的實(shí)驗(yàn)因素來(lái)決定，關(guān)于這方面的問(wèn)題還有待進(jìn)一步研究考證。

4 檢測(cè)指標(biāo)的探討

關(guān)于大鼠AMI模型制作完成后選取何種檢測(cè)方法及選用何種檢測(cè)指標(biāo)來(lái)判定模型制備成功與否是一個(gè)值得探討的問(wèn)題。在實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常被用于檢測(cè)的方法包括心電圖、血清生物標(biāo)志物及超聲心動(dòng)圖，每一種方法都有其重要的診斷意義，但又有其不足的方面。心電圖作為一種判定AMI形成的方法，因其操作簡(jiǎn)便易行，記錄方便而被被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)中。將大鼠LAD結(jié)扎后主要造成左心室前壁缺血，何濤等[20]通過(guò)觀察記錄結(jié)扎后大鼠肢、胸導(dǎo)聯(lián)心電圖發(fā)現(xiàn)J點(diǎn)偏移在I、aVL、V2、V5導(dǎo)聯(lián)抬高，T波振幅的幅值在I、aVL導(dǎo)聯(lián)增大，基本可以明確AMI大鼠的梗死部位是左心室，且梗死程度并未因觀察時(shí)間的不同而有所變化。心電圖是判斷AMI的重要方法，但是問(wèn)題局限在普通心電圖很難對(duì)AMI的位置及范圍進(jìn)行精確的定位與評(píng)價(jià)，如心肌梗死區(qū)域較小導(dǎo)聯(lián)的連接部位出現(xiàn)偏移時(shí)易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，Bonilha等[21]在研究中指出，壞死性Q波形成大于1 mm在大面積AMI大鼠和小面積AMI大鼠中存在率相當(dāng)(92%，96%)，Q波的深度與小面積AMI相關(guān)性無(wú)從體現(xiàn)，同時(shí)心電圖波形的記錄易受外界因素干擾導(dǎo)致信息不準(zhǔn)確。血清生物標(biāo)志物在診斷AMI時(shí)有愈發(fā)重要的參考價(jià)值，靈敏度高、特異性強(qiáng)的標(biāo)志物是研究者最希望發(fā)現(xiàn)并使用的。目前常用來(lái)檢測(cè)的AMI相關(guān)性的標(biāo)志物包括心型脂肪酸結(jié)合蛋白(heart-type fatty acid binding protein, H-FABP)、血清同型半胱氨酸(homocysteine, HCY)與心肌肌鈣蛋白T(cardiac tropoin T, cTn-T)，標(biāo)志物的檢測(cè)同樣存在時(shí)間窗的問(wèn)題，國(guó)內(nèi)學(xué)者[22-24]的研究表明，對(duì)大鼠結(jié)扎LAD后，H-FABP在血清中的含量1 h已經(jīng)升高，3 h達(dá)到高峰，9 h依然可以維持；而血清HCY的含量1 h有升高趨勢(shì)，3 h達(dá)到高峰，且一直維持到術(shù)后12 h；cTn-T在血清中的含量3 h開(kāi)始升高，6 h達(dá)到高峰，且一直到術(shù)后7 d持續(xù)存在。以上三種標(biāo)志物均能對(duì)AMI進(jìn)行早期判斷，其中對(duì)H-FABP的研究中還發(fā)現(xiàn)，其在血清中的含量與AMI程度呈正相關(guān)性；cTn-T為心肌細(xì)胞所特有，心肌特異性強(qiáng)，為臨床最新診斷AMI陽(yáng)性的最重要指標(biāo)之一；還有研究[25]認(rèn)為HCY可以用于評(píng)估AMI的預(yù)后。但問(wèn)題在于這些高敏感性和高特異性的研究指標(biāo)對(duì)AMI的梗死程度進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析十分有限，對(duì)時(shí)間窗的把握也有一定的要求，通常將多種標(biāo)志物進(jìn)行結(jié)合分析更有價(jià)值。隨著影像學(xué)技術(shù)的發(fā)展，超聲心動(dòng)圖(ultrasound cardiogram, UCG)在動(dòng)態(tài)觀察心臟結(jié)構(gòu)、心臟順應(yīng)性及心功能等方面發(fā)揮了許多不可替代的作用，同時(shí)在監(jiān)測(cè)模型的時(shí)效性方面有著不可比擬的優(yōu)勢(shì)，也利于縱向觀察心梗后心室重塑的動(dòng)態(tài)變化，為當(dāng)前臨床分析和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究提供了可靠的參考價(jià)值。Benavides-Vallve等[26]在研究中得到左室收縮和舒張狀態(tài)下的面積變化分?jǐn)?shù)(fractional area change，F(xiàn)AC)可用于AMI的評(píng)價(jià)，變化分?jǐn)?shù)下降即可證明AMI，并且在7 d后FAC基本保持穩(wěn)定。黃穎等[27]，胡珍等[28]，林蔚等[29]研究表明AMI主要影響的心功能指標(biāo)為收縮末期左室內(nèi)徑(left ventricular end systolic diameter,LVESD)、收縮末期左室容積(left ventricular end systolic volume, LVESV)、射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction, EF)、短軸縮短率(fractional shortening, FS)及每搏輸出量(stroke volume, SV)明顯下降，因而判定AMI急性期對(duì)心臟的收縮功能影響較大，對(duì)舒張功能無(wú)顯著影響；同時(shí)通過(guò)能良好反映心肌做功的Tei指數(shù)的變化幅度也可進(jìn)行對(duì)左室功能的判斷與評(píng)價(jià)。目前在基礎(chǔ)研究中UCG評(píng)價(jià)心功能的最佳指標(biāo)存疑，關(guān)于其標(biāo)準(zhǔn)的制定所進(jìn)行的相關(guān)研究不多；此外技術(shù)本身也存在著一定的限制性，仍存在進(jìn)一步探討和研究的空間。因此對(duì)大鼠AMI模型從諸如電生理、酶學(xué)、形態(tài)及功能等多角度、多方面的考察仍然十分必要，通過(guò)技術(shù)的更新及科學(xué)工作者相關(guān)認(rèn)知水平的提升，更多有價(jià)值的信息會(huì)被發(fā)現(xiàn)和研究。

5 總結(jié)與展望

標(biāo)準(zhǔn)化的AMI動(dòng)物模型是研究心血管事件和心肌細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)機(jī)制的基礎(chǔ)，當(dāng)前的研究進(jìn)展中可以看到，模型的制備過(guò)程有簡(jiǎn)單化的趨勢(shì)。非人工通氣條件下手術(shù)者擺脫了呼吸機(jī)的限制，節(jié)省了制備模型的時(shí)間，節(jié)約物力和財(cái)力成本，同樣降低了手術(shù)者制作水平的門(mén)檻?？s短手術(shù)操作時(shí)間對(duì)于保證手術(shù)者狀態(tài)和動(dòng)物狀態(tài)的穩(wěn)定較為有利。麻醉劑用量也因整體手術(shù)過(guò)程時(shí)間縮短而減少，對(duì)動(dòng)物的影響和死亡率降低有顯著的作用。在檢測(cè)方面，B超檢測(cè)方法的使用，極大的推進(jìn)了對(duì)心梗模型的評(píng)價(jià)方式，尤其在無(wú)創(chuàng)、定量、動(dòng)態(tài)等方面有顯著的優(yōu)勢(shì)。該模型的制備在近年來(lái)取得明顯進(jìn)展，有諸多方面的提高，但是現(xiàn)有的制備方法、麻醉藥物的選擇、檢測(cè)指標(biāo)等方面仍有待進(jìn)一步探索，這也是一代代科研工作者所不斷追求的動(dòng)力源泉。

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Researchprogressonpreparationofratmodelsofacutemyocardialinfarction

CAO Jue1,3， LI Yi-kui2， CHEN Meng-qian1， YAO Kui-wu1*

(1.Guang’anmen Hospital,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100053,China； 2.Xiyuan Hospital,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100091； 3.Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029))

Acute myocardial infarction is one of the major causes of death in the world. Research on animal models of myocardial infarction has a great significance in improving the pathophysiology, diagnosis and treatment of human myocardial infarction. At present, problems such as low survival rate and complicated preparation still exist. In recent years, some progress has been made in the preparation of animal myocardial infarction models, which can improve the survival rate, qualified rate and speed. This paper analyzes the preparation of rat models of acute myocardial infarction and related research, combined with actual factors to simplify the process of preparation and improve the skills of scientific researchers, so as to provide a source of stable and reliable acute myocardial infarction models for medical research.

Rat; Acute myocardial infarction model; Spontaneous breathing; Coronary artery ligation; Anaesthesia; Detection indicator

R-33

A

1671-7856(2017) 10-0096-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.10.019

2017-02-27

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81173449)。

曹玨(1992-)，男，研究生，專業(yè)：中醫(yī)心血管病。

姚魁武，E-mail: yaokuiwu@126.com