張 聰 王 臣 陳溥言

(河南科技大學(xué)獸醫(yī)腫瘤免疫學(xué)重點實驗室，洛陽 471003)

法氏囊新分離活性肽種類及生物學(xué)功能研究進展①

張 聰 王 臣 陳溥言②

(河南科技大學(xué)獸醫(yī)腫瘤免疫學(xué)重點實驗室，洛陽 471003)

法氏囊(Bursa of fabricius,BF)是禽類特有的體液免疫的中樞淋巴器，是B淋巴細(xì)胞增殖分化的場所。其中，三肽囊素(BS)Lys-His-Gly-NH2是法氏囊組織中提取的第一個活性肽，是法氏囊的重要活性組成成分，能提高機體免疫系統(tǒng)功能，而且對哺乳動物也具有重要的免疫學(xué)活性及生理作用[1-4]。以往的研究主要集中在囊素的研究，近年來，隨著質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)分離鑒定方面的廣泛應(yīng)用，法氏囊組織中陸續(xù)分離鑒定出多條生物活性肽，在免疫學(xué)活性功能及作用機制方面均有重大突破。本文旨在對新分離法氏囊活性肽的種類及免疫學(xué)功能做一個綜述，并對應(yīng)用前景進行展望。

1 新分離法氏囊活性肽種類

近年來，從法氏囊中分離出的多條活性肽，組成一個龐大的BP(S)P家族。BPP家族成員主要有BPP-Ⅰ、BPP-Ⅱ、BPP-Ⅲ、BPP-Ⅳ、BPP-Ⅴ、BHP、BTP；BSP家族成員有BSP-Ⅰ、BSP-Ⅱ；BP家族成員有BP-Ⅰ、BP-Ⅱ、BP-Ⅲ、BP-Ⅳ。

1.1BPP家族成員BPP-(I-V)，BHP，BTP Feng等[5]將雞法氏囊中分離出的提取物超濾后，通過MADIL-TOF MS型RP-HPLC鑒定，分離出法氏囊活性肽BPP-Ⅰ、BPP-Ⅱ、BPP-Ⅲ、BPP-Ⅳ、BPP-Ⅴ、BHP、BTP。BPP-Ⅰ，分子組成為LGPGP，能增強抗腫瘤因子p53蛋白表達，誘發(fā)免疫小鼠多種免疫應(yīng)答反應(yīng)。是抗腫瘤和潛在的免疫調(diào)節(jié)劑。BPP-Ⅱ(MTLTG)，通過誘導(dǎo)免疫相關(guān)基因的表達來調(diào)節(jié)免疫功能，激活p53信號通路抑制腫瘤的發(fā)生，在體液免疫和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答包括腫瘤抑制之間發(fā)揮重要的連接作用[6]。隨后，分離出來5個新型小分子多肽，分別命名為BPP-Ⅲ(YEYAY)、BPP-Ⅳ(RMYEE)、BPP-Ⅴ(GPPAT)、BHP(AGCCNG)、BTP(RRL)。Feng等[7]分析這些肽可能來自雞法氏囊組織的多種蛋白質(zhì)，也可能是一些蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)物。而且在免疫接種小鼠體內(nèi)產(chǎn)生抗體時，這些肽表現(xiàn)出不同的免疫調(diào)節(jié)作用，多種分子通過不同的途徑發(fā)揮免疫應(yīng)答作用。正因如此，維持了機體免疫系統(tǒng)的平衡和穩(wěn)定。

1.2BSP家族成員BSP-Ⅰ和BSP-Ⅱ Feng等[8]在研究中分離了一種新的法氏囊免疫調(diào)節(jié)性多肽BSP-Ⅰ，EPASGMM，呈現(xiàn)出各種生物學(xué)功能。如降低了腫瘤細(xì)胞的增殖，引發(fā)腫瘤抑制基因p53的表達，并刺激抗體的生產(chǎn)和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。隨后，確定了氨基酸序列為TPSGLVY的BSP-Ⅱ[9]。BSP-Ⅱ能夠增加禽類pre-B 淋巴細(xì)胞DT40的活性，采用基因分析發(fā)現(xiàn)了不同的表達基因參與DT40細(xì)胞的表達途徑中。六種主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括ErbB信號通路、MAPK信號通路、Toll-like受體信號通路、Notch信號通路、m-TOR信號通路、Wnt信號通路[10]。

1.3BP家族成員BP-(I-IV) Liu等[11]通過RP-HPLC和MADIL-TOF方法分離并鑒別(BP)-Ⅰ(ALPVVVⅡ)、BP-Ⅱ(DRATHGGE)、BP-Ⅲ(GANEVEEER)、BP-Ⅳ(KNEVEEEAKTP)這幾種肽能促進CFU前體B細(xì)胞的分化，降低PU.1的表達水平。其中， BP-Ⅳ還通過介導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫增強接種滅活禽流感病毒(AIV;H9N2亞型)的雞和小鼠體內(nèi)抗原特異性免疫應(yīng)答，其中包括增強特定AIV抗體和細(xì)胞因子產(chǎn)生[12]。

1.4法氏囊活性肽BP5、BP8和BP11 Li等[13]通過反向高效液相色譜法RP-HPLC分離純化出五肽BP5(Cys-Lys-Arg-Val-Tyr)，626.27 D。發(fā)現(xiàn)BP5顯著增強滅活A(yù)IV疫苗免疫小鼠體內(nèi)免疫應(yīng)答反應(yīng)， BP5在免疫小鼠體內(nèi)通過直接活化B細(xì)胞和間接活化T細(xì)胞促進小鼠脾淋巴細(xì)胞的分化，增強特異性抗體免疫應(yīng)答水平。Liu等[14]通過RP-HPLC和MALDI-TOF-MS法分離，鑒定出八肽BP8，分子序列為AGHTKKAP。發(fā)現(xiàn)BP8能夠促進前體B細(xì)胞的形成，基因芯片技術(shù)證實BP8作為B細(xì)胞發(fā)育和新陳代謝作用間的連接物對免疫系統(tǒng)的發(fā)育具有重要作用[15]。隨后，Liu等[16]采用同樣的方法分離鑒定出BP11，氨基酸序列為DVAGKLPDNRT。證實BP11與禽類免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，能夠促進CFU前體B細(xì)胞的形成和分化，刺激抗體的產(chǎn)生，提高Th1和Th2因子分泌水平。

2 新分離法氏囊活性肽免疫生物學(xué)功能

2.1法氏囊活性肽促進B細(xì)胞發(fā)育 禽類B淋巴細(xì)胞在法氏囊中發(fā)育成熟。B淋巴系祖細(xì)胞分化為前B細(xì)胞，進一步發(fā)育活化為成熟B細(xì)胞，接受抗原刺激產(chǎn)生抗體。BP家族BP-Ⅰ、BP-Ⅱ、BP-Ⅲ、BP-Ⅳ、BP5、BP8、BP11這幾種肽能促進CFU前體B細(xì)胞的分化[11,13,14,16]。Feng等[6,10]發(fā)現(xiàn)BSP-Ⅱ、BPP-Ⅱ能夠促進B細(xì)胞發(fā)育，BSP-Ⅱ增加禽類pre-B 淋巴細(xì)胞DT40的活性。Feng等[17]用BPP-Ⅱ免疫禽類B淋巴細(xì)胞DT40，采用基因微陣列從基因水平證實BPP-Ⅱ同源重組是B細(xì)胞發(fā)育過程中參與抗體基因轉(zhuǎn)變和分化的主要作用機制。法氏囊活性肽促進B細(xì)胞發(fā)育的作用機制有待進一步研究。

2.2法氏囊活性肽的免疫佐劑潛能 法氏囊活性肽大多具有免疫調(diào)節(jié)功能，聯(lián)合疫苗能提高特異性抗體和細(xì)胞因子分泌水平，促進淋巴細(xì)胞增殖，同時增強機體體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。Li等[13]，F(xiàn)eng等[8]分別用BP5、BSP-Ⅰ聯(lián)合滅活A(yù)IV疫苗免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)兩種多肽能顯著增強小鼠體內(nèi)特異性IgG抗體水平、Th2型(IFN-γ)和 Th1(IL-4)型細(xì)胞因子的分泌水平，促進外周血淋巴細(xì)胞增殖，增加CD3+T細(xì)胞種群和其亞群的CD4+(CD3+CD4+)T細(xì)胞和CD8+(CD3+CD8+)T細(xì)胞數(shù)量。同時，Li等[18]用BP5聯(lián)合滅活禽流感病毒AIV免疫雞，發(fā)現(xiàn)BP5通過抑制雞肺臟病毒的復(fù)制對抗同源禽流感病毒攻擊。現(xiàn)已證實，法氏囊活性肽具有良好的免疫佐劑潛能，應(yīng)用于疫苗的研發(fā)具有廣闊前景。

2.3法氏囊活性肽的抗氧化功能 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，一些硫醇化合物，如谷胱甘肽(GSH)和N-乙酰半胱氨酸(NAC)保護活細(xì)胞免受氧化應(yīng)激。BP5作為一種含有硫醇的新分離活性肽，是否可以保護活細(xì)胞免受氧化應(yīng)激？為了驗證這一猜想以及這一過程背后可能機制，Li等[19]用BP5處理由脂多糖(LPS)活化的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)BP5可以保護LPS激活小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對抗氧化應(yīng)激。提示BP5除了作為一種新型免疫活性調(diào)節(jié)肽顯著增強機體特異性免疫應(yīng)答，同時，BP5也表現(xiàn)出抗氧化應(yīng)激方面的特性。Liu等[20]在他的研究中報道了BP5對B細(xì)胞發(fā)育的作用，證實BP5通過增加CFU-preB顯著促進B細(xì)胞發(fā)育。同時，BP5誘導(dǎo)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)活性，一個基本的抗氧化劑輔助因子，減少G6PD缺陷細(xì)胞調(diào)節(jié)氧化還原平衡。這些數(shù)據(jù)表明，BP5通過促進G6PD的表達影響氧化還原平衡朝向，這反過來又調(diào)節(jié)谷胱甘肽氧化還原循環(huán)和其他進程。

2.4法氏囊活性肽對樹突狀細(xì)胞的作用 眾所周知，樹突狀細(xì)胞(DCs)在炎性疾病的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁，DCs已經(jīng)被認(rèn)為是免疫調(diào)節(jié)劑發(fā)展的主要目標(biāo)。然而，氧化應(yīng)激可能干擾DCs中的炎癥調(diào)節(jié)。BP5對DCs免疫功能影響尚未證實。Yang等[21]的研究中發(fā)現(xiàn)BP5顯著抑制樹突狀細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的促炎因子(TFN-α、IL-1β、IL-6和IL-12p70)和抗炎因子(IL-10)的產(chǎn)生。進一步研究發(fā)現(xiàn)，BP5對DCs中LPS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)顯示出潛在的保護作用。在LPS刺激腸上皮細(xì)胞(ECS)/DCS共培養(yǎng)體系中，BP5還抑制黏膜下DCs的成熟。BP5顯著上調(diào)LPS誘導(dǎo)的DCs中血紅素加氧酶-1(HO-1)水平，在氧化應(yīng)激的抑制中起到了重要作用[22]。這些結(jié)果表明，BP5可能抑制DCs的免疫功能來治療慢性炎癥和自身免疫病。

2.5法氏囊活性肽的腫瘤抑制功能 法氏囊活性肽具有多種生物學(xué)功能，為了研究其是否具有腫瘤免疫方面的功能，F(xiàn)eng等[23]采用基因芯片分析BP5處理的雜交瘤細(xì)胞基因組表達圖譜，發(fā)現(xiàn)BP5通過26條生物途徑參與免疫功能調(diào)節(jié)，其中p53信號通路在抗腫瘤方面發(fā)揮了重要作用，并由p53熒光素酶報告分析和p53的表達進一步證實。眾所周知，p53是機體重要的抑癌基因，調(diào)控細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。主要在轉(zhuǎn)錄水平通過調(diào)控一些編碼細(xì)胞生長和凋亡過程中的關(guān)鍵因子抑制腫瘤的發(fā)生，p53可啟動p21的合成，而p21是細(xì)胞周期依賴性激酶的抑制蛋白，能抑制細(xì)胞周期依賴性酶的活性，進而引起細(xì)胞周期阻滯[24-26]。王臣等[27]篩選出三條BP5特異性結(jié)合肽分別為P2-12、P6-12、P7-12，顯示3種BP5特異性結(jié)合肽在試驗濃度下均能下調(diào)BP5促p53基因轉(zhuǎn)錄的活性。郭香玲等[28]篩選出3條BPP-Ⅱ特異性結(jié)合肽:P3-12、P5-12、P6-12，發(fā)現(xiàn)BPP-Ⅱ 能特異性抑制小鼠B淋巴腫瘤細(xì)胞WEHI-231，人鼻咽癌細(xì)胞CNE，大鼠肝瘤細(xì)胞RH-35等腫瘤細(xì)胞的增殖，機制可能與激活p53信號通路有關(guān)。為進一步研究BP5抗腫瘤作用的分子作用機制，王臣等[29]篩選到BP5雞DT40細(xì)胞相互作用蛋白VEGFA、CCNE1、TRAPPC2?；蛐酒夹g(shù)分析BP5刺激后雞DT40細(xì)胞基因表達譜，證實BP5通過p53信號通路發(fā)揮抗腫瘤生物學(xué)功能。Zhou等[30]證實BSP-Ⅱ通過p53信號通路途徑抑制瘤細(xì)胞的分化。Feng等[8]發(fā)現(xiàn)BSP-Ⅰ能降低腫瘤細(xì)胞的增殖，引發(fā)腫瘤抑制基因p53的表達。法氏囊活性肽BP5、BSP-Ⅰ、BSP-Ⅱ、BPP-Ⅰ和BPP-Ⅱ均表現(xiàn)出潛在的腫瘤抑制功能，而具體的作用機制有待進一步研究。

3 小結(jié)

法氏囊作為禽類特有的中樞免疫器官，誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞增殖分化，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。從法氏囊中新分離的數(shù)十種生物活性肽，表現(xiàn)出不同的生物學(xué)功能，奠定了法氏囊在免疫系統(tǒng)中的地位。以往，對法氏囊的認(rèn)識主要表現(xiàn)在體液免疫調(diào)節(jié)方面，目前，法氏囊活性肽表現(xiàn)出來抗氧化，腫瘤抑制等功能，打破了以往認(rèn)為法氏囊僅在免疫調(diào)節(jié)方面起作用的局限，同時拓寬了法氏囊這一免疫器官的功能。對法氏囊活性肽的研究也為免疫學(xué)研究提供新思路，為免疫學(xué)甚至生命科學(xué)的發(fā)展起到推動作用。同時，我們應(yīng)該清楚地認(rèn)識到目前存在的一些問題，首先，隨著科學(xué)技術(shù)的進步和研究的進一步深入，法氏囊中其他種類的活性肽有待發(fā)現(xiàn)。第二，法氏囊活性肽潛在的生物學(xué)功能有待進一步挖掘。第三，目前國內(nèi)外對法氏囊活性肽類生物學(xué)功能的機理報道較少，因此具體詳盡的作用機理有待進一步探明。

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10.3969/j.issn.1000-484X.2017.12.029

S852.4

A

1000-484X(2017)12-1888-04

①本文為國家自然科學(xué)青年基金項目(No.31101792)和河南省高校青年骨干教師項目(No.2012GGJS-07)。

②南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動物細(xì)菌學(xué)重點實驗室，南京 210095。

張 聰(1994年-)，女，在讀碩士，主要從事動物分子病原學(xué)與免疫學(xué)研究。

及指導(dǎo)教師：王 臣(1979年-)，男，博士，教授，主要從事動物分子病原學(xué)與免疫學(xué)研究，E-mail:wangchen2001@126.com。

[收稿2017-02-19 修回2017-05-17]

(編輯 張曉舟)