周言君,鐘 江
(1. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 微生物與微生物工程系,上海 200438;2. 復(fù)旦大學(xué) 中華古籍保護(hù)研究院,上海 200433)
古籍紙張表面微生物群落組成的初步研究
周言君1,2,鐘 江1,2
(1. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 微生物與微生物工程系,上海 200438;2. 復(fù)旦大學(xué) 中華古籍保護(hù)研究院,上海 200433)
紙張表面的微生物直接或間接地影響古籍的保存和使用年限,全面認(rèn)識(shí)紙表微生物的組成有助于古籍保護(hù).本研究對(duì)手抄本《周本紀(jì)摘要》中的紙張表面菌斑處(stain組)和潔凈處(clean組)共9處,以及環(huán)境空氣進(jìn)行了樣品采集,并對(duì)樣品進(jìn)行了高通量測(cè)序,對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了生物信息學(xué)分析.10個(gè)樣品共得到高質(zhì)量的細(xì)菌16S序列和真菌ITS序列共485989條.序列數(shù)據(jù)分析表明,紙表真菌可以劃分為650個(gè)OTU,分屬6個(gè)門(mén),細(xì)菌可以劃分3465個(gè)OTU,分屬15個(gè)門(mén),其中豐度最高的分別是細(xì)菌的糖多孢菌屬(Saccharopolyspora)和真菌的曲霉屬(Aspergillus).相比于clean組,stain組有顯著多的糖多孢菌屬和假諾卡氏菌屬(Pseudonocardiaceae)細(xì)菌,以及顯著多的牛肝菌目(Boletales)和爪甲團(tuán)囊菌目(Onygenales)真菌.在聚類分析上,無(wú)論是細(xì)菌還是真菌部分,stain組和clean組的樣品都能很好的分開(kāi),但在Alpha多樣性指數(shù)上,組間差異趨勢(shì)不顯著.這些結(jié)果說(shuō)明無(wú)論是否有菌斑,紙表微生物群落多樣性程度是穩(wěn)定的,但群落組成和結(jié)構(gòu)有很大差異.
微生物群落; 高通量測(cè)序; 古籍保護(hù)
古籍是傳統(tǒng)文化的重要載體,從紙張制作和印刷,到古籍流轉(zhuǎn)、儲(chǔ)藏、使用的全部過(guò)程,都有大量微生物的存在.它們消耗利用紙張的各種無(wú)機(jī)有機(jī)成分,生長(zhǎng)和繁殖、協(xié)同與拮抗,直接或間接地影響著古籍外觀和紙張壽命.古籍微生物種類繁多,功能不明,利弊難辨,更難于清除.微生物防治一直是古籍文物保護(hù)的難點(diǎn)之一.全面了解古籍紙張表面微生物種類、種群結(jié)構(gòu)、代謝特征,就有可能明確對(duì)古籍有潛在威脅的微生物類群,指導(dǎo)采取有針對(duì)性的預(yù)防措施,長(zhǎng)久地保存這些珍貴書(shū)籍,流傳后世[1].
近幾十年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)古籍紙張表面微生物進(jìn)行了大量的研究,從不同材質(zhì)、年代、保存狀態(tài)、流轉(zhuǎn)歷史的古籍書(shū)頁(yè)中檢測(cè)到種類繁多的微生物.如有研究者發(fā)現(xiàn)土曲霉菌(Aspergillusterreus)能在紙張上生長(zhǎng)并產(chǎn)生草酸,并與紙張中的鈣離子反應(yīng)形成草酸鈣晶體,隨著菌絲體的生長(zhǎng)和草酸鈣晶體的累積會(huì)最終導(dǎo)致紙張纖維的斷裂[2],而生長(zhǎng)在書(shū)畫(huà)表面鎘紅顏料上的寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas)會(huì)長(zhǎng)出紅色或黃色的菌落,從而使書(shū)畫(huà)變色[3].但受限于技術(shù)手段,這些研究往往無(wú)法涵蓋所有的類群,也無(wú)法全面比較不同類型紙張表面微生物的群落差異.
微生物宏基因組和高通量測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展,使我們能從一個(gè)樣品中獲得數(shù)萬(wàn)條基因序列,一次性獲得樣品中幾乎全部微生物群落組成和相對(duì)豐度的信息[4-5],從而有機(jī)會(huì)從系統(tǒng)的角度看待古籍上的微生物,用全新的視角研究古籍保護(hù)中亟待解決的重要問(wèn)題,促進(jìn)古籍保護(hù)工作的發(fā)展.
本研究針對(duì)一本清末民初的手工皮紙抄本《周本紀(jì)摘要》中的內(nèi)頁(yè)菌斑、封底菌斑和內(nèi)頁(yè)潔凈紙張這三類樣品分別進(jìn)行3個(gè)平行樣品的采集,提取DNA,進(jìn)行高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析,探究不同樣品間微生物群落組成的異同,以期為不同類型古籍紙張表面微生物的全面深入研究奠定基礎(chǔ).
1.1 紙張樣品
本研究選取清末民初(十九世紀(jì)末到二十世紀(jì)初)的皮紙手抄本《周本紀(jì)摘要》一冊(cè)進(jìn)行紙表微生物的采樣.書(shū)冊(cè)整體保存較完好,紙質(zhì)潔白無(wú)明顯酸化,內(nèi)頁(yè)和封底處有幾處菌斑,書(shū)冊(cè)及其紙張?jiān)诓蓸忧拔醋魅魏翁幚恚?/p>
1.2 采樣方法
樣品采集于2016年4月,采樣位置為內(nèi)頁(yè)菌斑處、封底菌斑處和內(nèi)頁(yè)潔凈處,每組采3個(gè)樣品.具體的采樣方法見(jiàn)文獻(xiàn)[6],其中擦拭方法根據(jù)研究對(duì)象做了改動(dòng),將潤(rùn)濕的聚酯纖維拭子用潤(rùn)濕液(0.15mol/L NaCl和體積分?jǐn)?shù)為0.1%的Tween)濕潤(rùn)后,在目標(biāo)區(qū)域中2cm×2cm的范圍內(nèi)單向輕柔擦拭20次,以不對(duì)紙張表面造成損傷為準(zhǔn).作為對(duì)照的空氣沉降樣品的采集方法為: 在采樣開(kāi)始時(shí),將聚酯纖維拭子蘸取潤(rùn)濕液后,立于采樣工作臺(tái)面上,采樣結(jié)束后用其他樣品的處理方式收集此拭子.
1.3 DNA提取與PCR擴(kuò)增
對(duì)文獻(xiàn)[6]的方法進(jìn)行部分改動(dòng),使用PowerSoil DNA Isolation Kit(MoBio)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA提?。蕴崛〉玫降腄NA作為模板,對(duì)細(xì)菌16S核糖體RNA基因(16S rDNA)和真菌核糖體RNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer, ITS)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以確定得到的DNA樣品有足夠的量,可用于后續(xù)高通量測(cè)序.16S rDNA擴(kuò)增引物為27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和338R(5′-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3′),ITS擴(kuò)增選用引物為ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAA GTAA-3′)和ITS2(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′).?dāng)U增條件為94℃ 5min;94℃ 45s,50℃ 30s,72℃ 90s,32個(gè)循環(huán);72℃ 10min.對(duì)于擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠電泳中條帶不夠清晰的樣品,可將擴(kuò)增循環(huán)數(shù)增加到35個(gè)循環(huán).
1.4 高通量測(cè)序與序列分析
委托上海華津生物科技有限公司采用Illumina公司Miseq平臺(tái)針對(duì)16S rDNA V3-V4區(qū)和ITS1區(qū)進(jìn)行測(cè)序.對(duì)測(cè)序得到的reads先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接,同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和篩選后,得到優(yōu)化序列.使用Mothur軟件以序列相似性97%為標(biāo)準(zhǔn)劃分操作分類單元(Operational Taxonomic Units,OTU).原始的OTU豐度矩陣中包含大量“稀有”O(jiān)TU,它們豐度極低,且僅在少量樣品中偶爾出現(xiàn),這些OTU的存在會(huì)大大增加數(shù)據(jù)分析的復(fù)雜度,而通常情況下,去除這些稀有OTU對(duì)于解析整體菌群的影響微乎其微,因此我們?cè)贠TU劃分的原始數(shù)據(jù)中,將豐度值低于全體樣本測(cè)序總量0.001%的OTU去除[7],以降低數(shù)據(jù)分析的“背景噪音”.以去除了“稀有”O(jiān)TU的豐度矩陣為基礎(chǔ)進(jìn)行Alpha多樣性和Beta多樣性指數(shù)分析和聚類分析.將每個(gè)OTU的代表序列與SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)中的16S rDNA和ITS模板序列進(jìn)行比對(duì),確定其分類學(xué)信息,并在各分類水平上進(jìn)行群落組成的差異分析.
2.1 取樣和擴(kuò)增
共采集10個(gè)樣品,3個(gè)內(nèi)頁(yè)菌斑樣品命名為MA1、MA2、MA3,分別采自3個(gè)不同頁(yè)面;3個(gè)內(nèi)頁(yè)潔凈樣品命名為MA4、MA5、MA6,均采自書(shū)本內(nèi)頁(yè)無(wú)明顯菌斑或水跡的潔凈處;3個(gè)封底菌斑樣品命名為MA7、MA8、MA9,均采自本書(shū)封底,但采樣區(qū)域不交疊;1個(gè)空氣沉降樣品,命名為ZAB1,來(lái)自采樣工作臺(tái)面上的空氣自然沉降.對(duì)這十個(gè)樣品進(jìn)行DNA抽提和16S rDNA、ITS的PCR擴(kuò)增,樣品DNA濃度均較低,但PCR擴(kuò)增32個(gè)循環(huán)時(shí)條帶清晰,可供后續(xù)高通量測(cè)序所用.
2.2 高通量測(cè)序結(jié)果
測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)剔除和篩選后,10個(gè)樣品共得到16S rDNA高質(zhì)量序列142270條,ITS高質(zhì)量序列343719條.無(wú)論是初始的有效序列總數(shù),還是高質(zhì)量序列占有效序列的比例,ITS序列都高于16S rDNA序列.按照序列相似度97%的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)高質(zhì)量序列進(jìn)行OTU的劃分,并去除“稀有”O(jiān)TU后,ITS序列共得到650個(gè)OTU,16S rDNA序列得到3465個(gè)OTU.
2.3 菌群多樣性和聚類分析
為了較為全面地反映各樣品微生物群落的特征,我們用多種指數(shù)來(lái)反映不同樣品微生物群落的Alpha多樣性(表1).不同的指數(shù)對(duì)于衡量群落多樣性的側(cè)重點(diǎn)不同,chao1指數(shù)和ACE指數(shù)側(cè)重于體現(xiàn)群落的豐富度,即群落中OTU的數(shù)量[8-9];Shannon多樣性指數(shù)和Simpson多樣性指數(shù)則綜合考慮群落的豐富度和均勻度,即群落中各OTU之間豐度差異的大小[10].從真菌部分來(lái)看,菌斑位置(MA1、MA2、MA3、MA7、MA8、MA9)的真菌豐富度(chao值和ACE值)均高于潔凈頁(yè)面(MA4、MA5、MA6)和環(huán)境空氣(ZBC1),且空氣沉降樣品中的真菌豐富度最低.細(xì)菌的群落多樣性并沒(méi)有體現(xiàn)出這一點(diǎn),而是內(nèi)頁(yè)中(MA1、MA2、MA3、MA4、MA5、MA6),無(wú)論是否有菌斑,細(xì)菌群落的豐富度普遍低于封底紙表(MA7、MA8、MA9)和空氣(ZBC1).將群落內(nèi)的OTU均勻度考慮在內(nèi)之后(即Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)),10個(gè)樣品間的多樣性指數(shù)值則失去了明顯的差異.
表1 不同采樣位置的16S rDNA和ITS的Alpha多樣性指數(shù)表
基于UniFrac距離的ITS序列UPGMA(Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic means)樣本聚類分析結(jié)果顯示,潔凈的紙張頁(yè)面和環(huán)境空氣中的真菌群落聚類十分接近,而內(nèi)頁(yè)菌斑處和封底菌斑處的真菌群落則并未按類型聚在一起,尤其是3個(gè)內(nèi)頁(yè)菌斑樣品MA1、MA2和MA3的群落相似度較低(圖1).這可能是由于采樣時(shí)內(nèi)頁(yè)菌斑處的3個(gè)樣品分別來(lái)自于不同頁(yè)面,雖然斑點(diǎn)形態(tài)相似,但導(dǎo)致菌斑形成的菌群其實(shí)差異很大.而封底菌斑組的3個(gè)樣品來(lái)源于同一紙張頁(yè)面,采樣范圍雖未重疊,但距離較近,因此3個(gè)樣品,尤其是MA7和MA9,聚類比較接近.
我們將紙張表面的9個(gè)樣品按照采樣類型分為兩組: 菌斑組(stain組,MA1、MA2、MA3、MA7、MA8、MA9)和潔凈組(clean組,MA4、MA5、MA6),以此模式進(jìn)行偏最小二乘法判別分析(Partial Least Squares Discriminant Analysis, PLS-DA),結(jié)果見(jiàn)圖2(見(jiàn)第710頁(yè)).無(wú)論是細(xì)菌還是真菌部分,都能很好地將stain組和clean組的樣品分開(kāi),且組內(nèi)差異小于組間差異.其中,stain組內(nèi)細(xì)菌群落能夠很好地?cái)M合,而真菌群落組內(nèi)差異較大.與之相對(duì)地,clean組內(nèi)細(xì)菌群落差異較大,而真菌群落能夠很好地?cái)M合.這一結(jié)果說(shuō)明,在紙張表面菌斑處的真菌群落可能有很多種組成形式,而潔凈紙表的真菌群落則較為相似和穩(wěn)定.
2.4 微生物群落組成分析
序列分析結(jié)果表明,細(xì)菌主要來(lái)自15個(gè)門(mén)(Phylum),其中豐度最高的是變形菌門(mén)(Proteobacteria,44.4%)、放線菌門(mén)(Actinobacteria,32.3%)和厚壁菌門(mén)(Firmicutes,16.5%)(表2,見(jiàn)第710頁(yè)).總比例較高的屬為變形菌門(mén)的蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)和放線菌門(mén)的糖多孢菌屬(Saccharopolyspora)、紅球菌屬(Rhodococcus)等.真菌分別來(lái)自6個(gè)門(mén),其中豐度(A)最高的是子囊菌門(mén)(Ascomycota),在所有樣品中總比例為74.5%,其次是擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota),總比例為18.4%.占最主要地位的屬是子囊菌門(mén)的曲霉屬(Aspergillus)和擬青霉屬(Simplicillium),其中曲霉屬在全樣品中所占的總比例為29.2%,在封底菌斑處樣品MA7、MA8和MA9中的比例分別為52.0%、82.9%和53.9%(表2).主要類群與文獻(xiàn)報(bào)道[11-14]中紙質(zhì)文獻(xiàn)表面所發(fā)現(xiàn)的微生物類群是基本一致的.
樣本A/%MA1MA2MA3MA4MA5MA6MA7MA8MA9ZBC1細(xì)菌Acidobacteria0.10.10.00.10.20.00.10.10.00.0Actinobacteria46.217.861.017.27.121.637.634.348.130.0Armatimonadetes0.00.00.00.10.00.00.10.00.10.0Bacteroidetes3.36.74.46.96.45.96.93.64.68.8Chlamydiae0.00.10.00.00.00.00.00.00.00.0Chloroflexi0.20.00.00.02.00.10.10.10.10.1Cyanobacteria0.20.50.10.20.20.30.23.80.10.7Elusimicrobia0.00.10.00.10.00.00.00.00.00.1Firmicutes3.634.61.93.956.534.18.92.91.72.2Fusobacteria0.00.10.00.00.10.00.10.00.00.1Gemmatimonadetes0.00.10.20.00.00.00.00.00.00.0Planctomycetes0.10.00.00.10.00.10.00.00.10.1Proteobacteria46.039.832.171.326.837.545.755.045.057.6Spirochaetes0.00.00.00.00.00.00.00.00.00.0Tenericutes0.00.10.00.00.10.10.00.10.00.0Unidentified0.10.10.00.10.40.20.30.20.10.2真菌Ascomycota55.736.384.367.572.170.093.992.389.682.9Basidiomycota41.837.613.712.721.822.55.65.78.113.9Chytridiomycota0.00.30.00.01.30.00.00.00.00.0Glomeromycota0.00.00.00.00.00.00.00.00.00.0Rozellomycota0.06.80.00.00.00.30.00.00.90.0Zygomycota0.018.50.20.00.40.00.00.00.10.0Unidentified2.40.51.819.84.47.20.41.91.33.2
按照2.3節(jié)中提到的分組方式,運(yùn)用LEfSe(Linear discriminant analysis Effect Size)方法進(jìn)行組間的比較,從而找到組間在豐度上有顯著性差異的分類單元,最后用線性判別分析(LDA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維,并評(píng)估差異顯著的物種的影響力,即LDA值(取log10后),結(jié)果見(jiàn)圖3.
其中,stain組內(nèi)的細(xì)菌群落有更多的放線菌類群(尤其是糖多孢菌屬)和芽孢桿菌屬(Bacillus);真菌群落中有相當(dāng)大比例的曲霉屬和青霉屬(Penicillium),但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上與clean組相比有顯著性差異的類群則是牛肝菌目(Boletales)、爪甲團(tuán)囊菌目(Onygenales)和外擔(dān)子菌綱(Exobasidiomycetes).
clean組內(nèi)的細(xì)菌群落中有顯著多的動(dòng)膠菌屬(Zoogloea)、腸桿菌屬(Enterobacter)和紅環(huán)菌目(Rhodocyclales);真菌群落中有顯著多的鏈格孢屬(Alternaria)和肉座菌目(Hypocreales).
中華古籍的紙張成分多樣,根據(jù)制作工藝和原料的不同,含有纖維素、半纖維素、木質(zhì)素,同時(shí)還有少量樹(shù)脂、淀粉、果膠、灰分等,這些成分都可以作為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源供給多種微生物的生長(zhǎng)和繁殖.在實(shí)際的古籍善本流通和保藏過(guò)程中,微生物的影響十分顯著,對(duì)其進(jìn)行的各種研究一直在世界范圍內(nèi)進(jìn)行.這些研究工作早期是應(yīng)用傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)分離培養(yǎng)損害紙質(zhì)文物的微生物,依據(jù)形態(tài)及生理生化特征對(duì)其進(jìn)行鑒別分類[15-16].但由于培養(yǎng)條件限制、營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)缺失、失去生態(tài)位等因素,大多數(shù)微生物在常規(guī)條件下是不可培養(yǎng)或難培養(yǎng)的,這些方法只能得到極少數(shù)菌株,且它們?cè)诠偶垙埳衔幢貫橛泻騼?yōu)勢(shì)菌.隨著技術(shù)手段的發(fā)展,基于PCR的分子鑒定[17-18]、DGGE[19]、基因芯片、掃描電鏡(SEM)[20-21]、傅里葉變換紅外光譜(FTIR)[2,22]等技術(shù)都逐漸被應(yīng)用于古籍相關(guān)微生物的研究.這些方法能得到部分優(yōu)勢(shì)菌群,而對(duì)于整體的微生物群落,尤其是群落內(nèi)豐度較低但可能對(duì)紙張的破壞起關(guān)鍵作用的菌群無(wú)法進(jìn)行有效地分析.高通量測(cè)序技術(shù)有可能使研究者能夠獲得樣品中幾乎全部的微生物信息,為認(rèn)識(shí)微生物對(duì)古籍紙張的影響提供了強(qiáng)大的工具.
本研究對(duì)一本手工皮紙古籍的菌斑處和潔凈處分別采樣,運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)分析其微生物群落多樣性和群落結(jié)構(gòu).從9個(gè)紙張樣品和1個(gè)空氣沉降樣品中共得到細(xì)菌16S rDNA和真菌ITS序列共485989條,稀釋曲線均接近飽和,表明測(cè)序深度能夠反映樣品的微生物群落結(jié)構(gòu).Alpha多樣性提示,在只考慮OTU數(shù)量的情況下,真菌的多樣性高低與保存狀況(是否有菌斑)有關(guān),而細(xì)菌的多樣性高低可能與是否暴露在空氣中有關(guān)(差異不顯著).但樣品內(nèi)OTU豐度差異較大,因此當(dāng)算法考慮OTU樣品均勻度時(shí),樣品間多樣性指數(shù)不再有明顯差異.
聚類分析發(fā)現(xiàn)無(wú)論是細(xì)菌還是真菌,在設(shè)定的分組下,聚類都很清晰.雖然多樣性指數(shù)并不如預(yù)計(jì)——菌斑處細(xì)菌和真菌的多樣性指數(shù)并不顯著高于潔凈紙張和空氣——但兩組樣品的群落組成卻有顯著性差異,且組內(nèi)聚類良好.這也說(shuō)明紙張表面各種微生物群居雜生,紙表是否形成菌斑或污損,與其菌群的多樣性程度并不一定相關(guān),而更多地與菌群組成結(jié)構(gòu)相關(guān).
Zyska[11]統(tǒng)計(jì)了1919年至1977年發(fā)表的文獻(xiàn),其中從圖書(shū)館藏書(shū)上分離的真菌共84個(gè)屬,234種,主要類群為曲霉屬、青霉屬、木霉屬(Trichoderma)、鏈格孢屬和毛殼菌屬(Chaetomium)真菌,其后至今近40年的研究報(bào)道中,與紙表?yè)p傷相關(guān)的真菌類群也多為這五類[23].在本研究的所有樣品中,真菌幾乎都屬于子囊菌門(mén)(74.5%)和擔(dān)子菌門(mén)(18.4%),其中豐度最高的類群是子囊菌門(mén)的曲霉屬,特別是在封底菌斑處的3個(gè)樣本中,曲霉屬占總真菌數(shù)的50%以上.青霉屬、木霉屬和毛殼菌屬的比例均較低且組內(nèi)差異較大,組間沒(méi)有顯著規(guī)律.比較特殊的是鏈格孢屬,在總菌中比例為4.3%,在空氣沉降樣品中也有1.5%的豐度,但在stain組中比例均在1%以下,顯著低于clean組中(圖3).一個(gè)可能的原因是,鏈格孢屬確實(shí)是紙表微生物和圖書(shū)館環(huán)境空氣中的常見(jiàn)真菌類群,但與本研究中涉及到的菌斑形成無(wú)關(guān).
相對(duì)于真菌而言,細(xì)菌在古籍保護(hù)領(lǐng)域長(zhǎng)久以來(lái)并未受到重視.近年來(lái),越來(lái)越多的研究者開(kāi)始關(guān)注紙表細(xì)菌類群及其對(duì)紙質(zhì)文物的危害.芽孢桿菌屬、梭菌屬(Clostridium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和微球菌屬(Micrococcus)是其中最常見(jiàn)的種類[12].此外放線菌屬(Actinomyces)和噬纖維菌屬(Cellulophaga)也常見(jiàn)于有關(guān)紙表細(xì)菌的報(bào)道.本研究中stain組內(nèi)有顯著多的芽孢桿菌和顯著多的放線菌類群,如假諾卡氏菌屬(Pseudonocardiaceae)、糖多孢菌屬等.放線菌是公認(rèn)的降解能力較強(qiáng)的細(xì)菌類群,能穿透不溶基質(zhì),增加它的水溶性,其中屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)的絲狀細(xì)菌在初級(jí)代謝階段有降解木質(zhì)素能力,主要是通過(guò)脫甲基、芳環(huán)斷裂和側(cè)鏈氧化3種途徑降解木質(zhì)素[24],降解率最高可達(dá)20%.另外,Pages研究發(fā)現(xiàn),嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)可以把亞硒酸鹽轉(zhuǎn)化成元素硒,從而使菌落顏色變?yōu)榧t色[25].生長(zhǎng)在書(shū)畫(huà)表面鎘紅顏料上的寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas)會(huì)長(zhǎng)出紅色或黃色的菌落,從而使書(shū)畫(huà)變色[3].許多紙質(zhì)文物在久藏之后會(huì)出現(xiàn)各種顏色的不規(guī)則斑點(diǎn),這種情況大多是由微生物導(dǎo)致的,多種細(xì)菌和真菌在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生色素,使菌落呈現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的形狀和顏色,反映在紙張上就是難以去除的色斑,根據(jù)是否可見(jiàn)菌絲體、是否有熒光現(xiàn)象等進(jìn)行區(qū)分,稱為“霉斑”或“狐斑”等.有研究者[23]從不同紙張的褐色斑點(diǎn)(狐斑)處分離到25株真菌,基本都是曲霉屬和散囊菌屬(Eurotium).梭菌屬、假單胞菌屬這兩種常見(jiàn)于紙質(zhì)文物研究的菌群在本研究所有樣品中比例均在1%以下,且組間沒(méi)有顯著性差異,微球菌屬和噬纖維菌屬在本研究中沒(méi)有發(fā)現(xiàn),或因豐度低于0.001%被作為“稀有”O(jiān)TU而剔除.
意大利的研究者在2014年的研究中發(fā)現(xiàn)了一套被菌斑嚴(yán)重侵蝕的攝影材料(正片、底片、紙質(zhì)框和玻璃紙信封)中細(xì)菌和真菌在同一個(gè)生態(tài)位的共同生長(zhǎng),在細(xì)菌文庫(kù)中變形菌門(mén)在所有的材料中都占大部分,尤其是正片中,所有細(xì)菌都是變形菌門(mén),其他的材料中細(xì)菌的組成各有差異,其中紙質(zhì)框中有58%的變形菌門(mén),25%的放線菌門(mén)和5%的厚壁菌門(mén)細(xì)菌[13].本研究中變形菌門(mén)占44.4%,放線菌門(mén)占32.3%,厚壁菌門(mén)占16.5%,與其紙質(zhì)框中的結(jié)果比較接近.不同的細(xì)菌類群對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)有其偏好,因此,這種群落結(jié)構(gòu)的結(jié)果可能對(duì)以后針對(duì)不同紙張類型的菌群研究有一定的提示作用.
在紙表微生物的已有研究中,大多數(shù)研究針對(duì)的目標(biāo)是真菌,尤其是絲狀真菌對(duì)紙張的損害,而細(xì)菌在紙張老化中所起的作用可能被大大低估了.事實(shí)上細(xì)菌在纖維素降解、紙張酸化、色斑的產(chǎn)生等方面都有不可小覷的潛力[26-27].本研究中,細(xì)菌和真菌在紙表這個(gè)微環(huán)境中不僅共同存在,且都能在分組中穩(wěn)定聚類,并有一些類群在組間有顯著的豐度差異,這些結(jié)果說(shuō)明肉眼可見(jiàn)的菌斑,其形成不一定是單獨(dú)的真菌或細(xì)菌作用,而可能是兩者的協(xié)同和共生的結(jié)果,而這些關(guān)系的發(fā)展,可能對(duì)古籍紙張的壽命起著決定性的作用.
本研究通過(guò)基本無(wú)損的采樣方法和高通量測(cè)序技術(shù)初步發(fā)現(xiàn)古籍紙張的菌斑位置和潔凈位置,細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)有明顯的差別,并對(duì)這些差別進(jìn)行了生物信息學(xué)的分析.受限于樣本種類和樣品數(shù)量不夠的問(wèn)題,尚無(wú)法明確導(dǎo)致菌斑形成的關(guān)鍵微生物.希望在后續(xù)研究中,高通量測(cè)序結(jié)合生物信息學(xué)分析的方法能夠在古籍相關(guān)微生物研究中得以更廣泛和深入的應(yīng)用,將古籍的微生物防治和保護(hù)修復(fù)工作向現(xiàn)代化推進(jìn).
[1] CAPPITELLI F, PASQUARIELLO G, TARSITANI G,etal. Scripta manent? Assessing microbial risk to paper heritage[J].TrendsinMicrobiology, 2010,18(12): 538-542.
[2] PINZARI F, ZOTTI M, MICO A D,etal. Biodegradation of inorganic components in paper documents: Formation of calcium oxalate crystals as a consequence ofAspergillusterreusThom growth[J].InternationalBiodeterioration&Biodegradation, 2010,64(6): 499-505.
[4] SHENDURE J, JI H. Next-generation DNA sequencing[J].NatureBiotechnology, 2008, 26(10): 1135-45.
[6] 遲 亮,譚 淵,全哲學(xué).上海健康人群夏冬兩季皮膚真菌群落組成: 基于高通量測(cè)序技術(shù)的研究[J].復(fù)旦學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2014,53(6): 697-703.
[7] BOKULICH N A, SUBRAMANIAN S, FAITH J J,etal. Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing[J].NatureMethods, 2013,10(1): 57-59.
[8] CHAO A. Non-parametric estimation of the classes in a population[J].ScandinavianJournalofStatistics, 1984,11(4): 265-270.
[9] CHAO A, YANG M C K. Stopping rules and estimation for recapture debugging with unequal failure rates[J].Biometrika, 1993,80(1): 193-201.
[10] SHANNON C E. A mathematical theory of communication[J].BellSystemTechnicalJournal, 1948,27(4): 623-656.
[11] ZYSKA B. Fungi isolated from library materials: A review of the literature[J].InternationalBiodeterioration&Biodegradation, 1997,40(1): 43-51.
[12] DUNCA S I, TANASE C, PADURARIU C,etal. Study of the contaminating microbiota of old paper supports[J].EuropeanScientificJournal, 2014: 237-251.
[15] MESQUITA N, PORTUGAL A, VIDEIRA S,etal. Fungal diversity in ancient documents: A case study on the archive of the University of Coimbra[J].InternationalBiodeterioration&Biodegradation, 2009,63(5): 626-629.
[16] GORBUSHINA A A, HEYTMAN J, DORNIEDEN T,etal. Bacterial and fungal diversity and biodeterioration problems in mural painting environments of St. Martins church (Greene-Kreiensen, Germany)[J].InternationalBiodeterioration&Biodegradation, 2004,53(1): 13-24.
[17] WANG W, MA Y, MA X,etal. Seasonal variations of airborne bacteria in the Mogao Grottoes, Dunhuang, China[J].InternationalBiodeterioration&Biodegradation, 2010,64(4): 309-315.
[18] RAKOTONIRAINY M S, HEUDE E, LAVéDRINE B. Isolation and attempts of biomolecular characterization of fungal strains associated to foxing on a 19th century book[J].JournalofCulturalHeritage, 2007,8(2): 126-133.
[19] MICHAELSEN A, PINZARI F, BARBABIETOLA N,etal. Monitoring the effects of different conservation treatments on paper-infecting fungi[J].InternationalBiodeterioration&Biodegradation, 2013,84(100): 333-341.
[20] MANENTE S, MICHELUZ A, GANZERLA R,etal. Chemical and biological characterization of paper: A case study using a proposed methodological approach[J].InternationalBiodeterioration&Biodegradation, 2012,74(4): 99-108.
[21] JURADO V, PORCA E, PASTRANA M P,etal. Microbiological study of bulls of indulgence of the 15th-16th centuries[J].ScienceoftheTotalEnvironment, 2010,408(17): 3711-3715.
[22] ZOTTI M, FERRONI A, CALVINI P. Microfungal biodeterioration of historic paper: Preliminary FTIR and microbiological analyses[J].InternationalBiodeterioration&Biodegradation, 2008,62(2): 186-194.
[23] ARAI H. Foxing caused by fungi: Twenty-five years of study[J].InternationalBiodeterioration&Biodegradation, 2000,46(46): 181-188.
[24] CRAWFORD D L, POMETTO A L, CRAWFORD,etal. Lignin degradation byStreptomycesviridosporus: Isolation and characterization of a new polymeric lignin degradation intermediate[J].Applied&EnvironmentalMicrobiology, 1983,45(3): 898-904.
[25] PAGES D, ROSE J, CONROD S,etal. Heavy metal tolerance inStenotrophomonasmaltophilia[J].PLoSOne, 2008,3(2): e1539.
[27] EM G D P, SAADEDDIN A. The cellulolytic system ofThermobifidafusca[J].CriticalReviewsinMicrobiology, 2014,40(3): 236-247.
A Preliminary Study of the Microbial Community Composition on Old Paper Material
ZHOU Yanjun1,2, ZHONG Jiang1,2
(1.DepartmentofMicrobiologyandMicrobialEngineering,SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200438,China; 2.ChineseAncientBooksPreservationandConservationInstitute,FudanUniversity,Shanghai200433,China)
The microorganism community on paper surface plays an important role in historical paper heritage in direct or indirect ways, the understanding of which may greatly enhance their conservation. In this study, we collected 9 microbial samples, including 3 from clean site and 6 from stain site, from an old manuscript namedZhoubenjizhaiyao, and one air deposition sample as blank control. These samples were subjected to high-throughput DNA sequencing and bioinformatics analysis. A total of 485989 high quality sequences of bacterial 16S rDNA or fungal ITS(internal transcribed spacer) were obtained. They could be categorized into 650 fungal operational taxonomic units (OTUs) and 3465 bacterial OTUs. Fugal OTUs were classified into 11 phyla, with the predominant genus beingAspergillus. Bacterial OTUs were classified into 15 phyla, andSaccharopolysporawas the most abundant group among all genera. Compared to clean group, the abundance ofSaccharopolysporaandPseudonocardiaceaewere significantly higher within stain group, as well asBoletalesandOnygenales. Althoght stain and clean groups were not significantly different in alpha diversity analysis, they did separate from each other quite well in clustering analysis. In conclusion, the diversity indices of microbial community on paper material was stable, with or without the spot, meanwhile the community composition and structure varies significantly.
microflora; high-throughput sequencing; old paper conservation
0427-7104(2016)06-0707-08
2016-10-15
周言君(1990—),女,博士研究生;鐘 江,男,教授,通訊聯(lián)系人, E-mail: jzhong@fudan.edu.cn.
Q 493
A