吳修紅，趙闖，孫曉蘭，胡妮娜，張金琦，王旭，孫澤，孫暉

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040)

綜 述

基于代謝組學(xué)方法的中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究進(jìn)展

吳修紅，趙闖，孫曉蘭，胡妮娜，張金琦，王旭，孫澤，孫暉*

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040)

近年來，代謝組學(xué)已經(jīng)成為科學(xué)研究中的一大熱點(diǎn)，隨著學(xué)者們對(duì)代謝組學(xué)的深入研究，代謝組學(xué)也滲透到各個(gè)領(lǐng)域，如藥物的物質(zhì)基礎(chǔ)研究、針灸學(xué)、毒理學(xué)、疾病診斷學(xué)等。通過對(duì)近幾年相關(guān)文獻(xiàn)的查閱，發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)在中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)研究方面，也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，因此，將相關(guān)研究進(jìn)行整合歸納，以期為代謝組學(xué)的進(jìn)一步研究作參考。

代謝組學(xué)；代謝物；生物標(biāo)志物；物質(zhì)基礎(chǔ)；核磁共振氫譜

中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)是關(guān)系到中藥的有效性及安全性等質(zhì)量問題的關(guān)鍵因素，其研究和確認(rèn)的技術(shù)與方法事關(guān)中藥發(fā)展的關(guān)鍵[1]。最近，代謝組學(xué)在揭示中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)也起到了重要作用。它是在基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后，一門新興“組學(xué)”學(xué)科，是系統(tǒng)生物學(xué)重要組成之一，廣泛應(yīng)用到科學(xué)研究領(lǐng)域。代謝組學(xué)能夠從整體水平反映疾病治療過程中的小分子代謝物的變化，采用核磁共振氫譜，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的尿液、血清、血漿等樣本檢測(cè)，通過主成分分析或偏最小二乘法等多元數(shù)據(jù)處理方法，從而發(fā)現(xiàn)藥物中潛在的生物活性物質(zhì)，更準(zhǔn)確地反映生物體系的狀態(tài)[2]。為解釋中藥藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)以及系統(tǒng)分析中藥的化學(xué)組成做出了貢獻(xiàn)。因此，代謝組學(xué)在中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究中也是不可或缺的一部分。

1 代謝組學(xué)在中藥單味藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)中的應(yīng)用

1.1 姜炭

姜炭(Ginger charcoal)是常用中藥，在《神農(nóng)本草經(jīng)中》有所記載，主要用于溫經(jīng)止血、溫脾止瀉。莫毛燕等[3]利用核磁共振氫譜(1H-NMR)技術(shù)建立大鼠尿液的代謝譜，采用主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)研究各個(gè)分組相互間的代謝物譜差異，通過變量重要性投影(VIP)發(fā)現(xiàn)尿液中的潛在生物標(biāo)志物，通過矯正率篩選姜炭溫經(jīng)止血的藥效生物標(biāo)志物。結(jié)果篩選出與虛寒性出血癥相關(guān)的7種生物標(biāo)志物，其中乙酰乙酸、丙酮酸、氮氧三甲胺、?；撬?、色氨酸為姜炭溫經(jīng)止血的藥效生物標(biāo)志物。因此，姜炭溫經(jīng)止血的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)有乙酰乙酸、丙酮酸、氮氧三甲胺、?；撬?、色氨酸。

1.2 川烏

川烏(CW)，一種著名的中藥(TCM)，烏頭Aconitum carmichaelii Debx的母根。Dong[4]等通過UPLC-Q-TOF-HDMS對(duì)川烏的毒性進(jìn)行尿代謝組學(xué)研究，結(jié)果，鑒定了與CW毒性相關(guān)的17種生物標(biāo)志物，分別為5-羥基-6-甲氧基吲哚葡糖苷酸，4,6-二羥基喹啉，5-L-谷氨酰 -牛磺酸，脫氫孕烯醇酮，甘氨酸，3-吲哚羧酸葡糖苷酸，3-甲基二氧基吲哚，L-苯丙氨酰-L-羥基黃嘌呤，腺苷琥珀酸，GDP-L-巖藻糖，環(huán)AMP，4-(2-氨基-3-羥基苯基)，4-二氧代丁酸，N-乙酰基-9-O-乳酰神經(jīng)氨酸，棕櫚酰葡萄糖醛酸，3-氧代十六烷酸，2-苯乙醇葡糖苷酸和D-葡萄糖醛酸1-磷酸，參與戊糖和葡糖醛酸相互轉(zhuǎn)化，丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝，淀粉和蔗糖代謝，氨基糖和核苷酸糖，嘌呤代謝，色氨酸代謝，牛磺酸和亞?；撬岽x，果糖和甘露糖代謝，脂肪酸代謝。CG組(川烏：甘草=1：2)，CB組(川烏：白芍=1：2)和CJ組(川烏：干姜=1：2)通過相容性可將大多數(shù)毒性生物標(biāo)志物的表達(dá)水平有效地調(diào)節(jié)到正常范圍藥物。研究表明，三種相容性藥物可以有效地對(duì)抗CW的毒性。

1.3 黃連

黃連(Coptis chinensis)，別名味連、川連等，屬毛茛科、黃連屬多年生草本植物。根據(jù)現(xiàn)代藥理作用研究，黃連具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤以及改善糖尿病等藥理作用[5]。王靜等[6]采用對(duì)雄性Wistar大鼠灌胃脂肪乳并腹腔注射鏈脲佐菌素的方法制造Ⅱ型糖尿病模型，大鼠分為正常組、模型組、黃連給藥治療組、二甲雙胍給藥組。大鼠給藥30 d后，采集血樣用于生化指標(biāo)的檢測(cè)，尿樣用于代謝組學(xué)的分析。與模型組相比，模型大鼠連續(xù)30 d腹腔注射黃連后，空腹血糖值(FBG)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平顯著降低。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS) 對(duì)大鼠尿樣中的內(nèi)源性物質(zhì)進(jìn)行了相對(duì)含量測(cè)定，主成分分析結(jié)果表明，正常組與模型組顯著分離，黃連組處于正常組與模型組之間，更接近于正常組。發(fā)現(xiàn) 12 個(gè)代謝物與糖尿病有關(guān)，包括 4-甲基苯酚、苯甲酸、氨基丙二酸等。黃連干預(yù)后，其中的 7 個(gè)代謝物顯著回調(diào)，與氧化應(yīng)激狀態(tài)相關(guān)的氨基丙二酸和 L-抗壞血酸出現(xiàn)向正常組顯著性調(diào)節(jié)的趨勢(shì)。以上結(jié)果證實(shí)，黃連不僅具有降糖和降血脂的作用，而且具有抗氧化作用，在一定程度上可能會(huì)抑制糖尿病合并癥的發(fā)生和發(fā)展。

1.4 人參皂苷

人參皂苷(Ginsenoside)屬于三萜皂苷，是固醇類化合物，主要存在于人參屬藥材中，具有抗腫瘤、抗衰老、抗氧化、抗病毒[7]、治療心血管疾病[8]等藥理作用，能夠影響多重代謝通路。謝燮等[9]該研究以Wistar 雄性大鼠為對(duì)象，利用代謝組學(xué)技術(shù)分析其尿液代謝物組成的動(dòng)態(tài)變化，分析長(zhǎng)期服用人參主要有效成分——人參總皂苷對(duì)大鼠機(jī)體尿液代謝譜的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，服用人參皂苷在1～3 周內(nèi)對(duì)機(jī)體尿液的代謝譜影響最大，包括能量代謝、兒茶酚胺類物質(zhì)以及氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)代謝，6～10周作用的逐漸減小，27周幾乎無作用，同時(shí)證明短期和長(zhǎng)期服用人參皂苷對(duì)機(jī)體無明顯的毒副作用。

1.5 兩色金雞菊

兩色金雞菊(Coreopsis tinctoria Nutt.)又稱“昆侖雪菊”，屬菊科金雞菊屬一年生草本植物。有研究發(fā)現(xiàn)，昆侖雪菊水提液具有降血脂作用，還能夠降低自發(fā)性高血壓(SHR)大鼠收縮壓而發(fā)揮降血壓的功效[10]。盧偉[11]等本研究工作嘗試建立一種兩色金雞菊醇提物對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠代謝干預(yù)的代謝組學(xué)評(píng)價(jià)方法，采用1H-NMR分析方法測(cè)定給藥組和對(duì)照組大鼠的尿樣，得到尿樣中小分子代謝物的指紋圖譜，結(jié)合主成分分析方法，研究小分子內(nèi)源性代謝物在金雞菊醇提物灌胃后的變化以及高血壓大鼠尿液代謝物的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多種代謝產(chǎn)物與高血壓癥密切相關(guān)。另外，發(fā)現(xiàn)了與糖代謝相關(guān)的代謝物：β-葡萄糖、蘋果酸、丙酮，并且在模型組中均明顯升高，說明高血壓大鼠葡萄糖代謝異常；此外，如膽堿、肌酸酐等小分子物質(zhì)也被檢測(cè)出可能作為高血壓的生物標(biāo)志物。這些內(nèi)源性成分的改變提示模型組大鼠尿液存在相關(guān)代謝功能的異常，而經(jīng)藥物干預(yù)后，以上指標(biāo)得到一定改善。

2 代謝組學(xué)在中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)中的應(yīng)用

2.1 芍藥甘草湯

芍藥甘草湯(SGD)，出自漢代張仲景所著《傷寒論》，書中記載了少藥甘草湯的組成，即芍藥與甘草，主要用于治療腹痛和痛經(jīng)。Wang等[12]以Wistar大鼠為研究對(duì)象，通過對(duì)痛經(jīng)組的模型大鼠和對(duì)照組正常大鼠口服芍藥甘草湯后，在肝門靜脈處收集血液，制備血清樣本，建立了高分辨率的UPLC/MS串聯(lián)Waters UPLC HSS T3(2.1×100 mm,1.8 μm)分析技術(shù)，由Waters UPLC HSS T3(2.1×100 mm,1.8 μm)執(zhí)行梯度洗脫程序，MS/MS裂解行為幫助化合物結(jié)構(gòu)的鑒定，最終表征出芍藥甘草湯的的化學(xué)組分和代謝物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)12種潛在的生物標(biāo)記物，包括9種原型成分：沒食子酸、白芍苷、甘草苷、刺果甘草素、甘草素、異甘草素、芒柄花黃素、異甘草黃酮醇、甘草利酮、C9H10O3和2種代謝物如甘草素-4’-氧-葡萄糖醛酸苷、芒柄花黃素葡萄糖醛酸，其中3種成分來自芍藥，9種來自甘草，以上在血漿中發(fā)現(xiàn)的成分均是SGD用于治療痛經(jīng)的有效物質(zhì)，并可能是通過葡萄糖和氨基酸等代謝途徑發(fā)揮作用，為SGD進(jìn)一步的藥理學(xué)和臨床研究提供重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。這表明沒食子酸、白芍苷、甘草苷、刺果甘草素、甘草素、異甘草素、芒柄花黃素、異甘草黃酮醇、甘草利酮、C9H10O3和2種代謝物如甘草素-4′-氧-葡萄糖醛酸苷、芒柄花黃素葡萄糖醛酸為芍藥甘草湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.2 當(dāng)歸四逆湯

當(dāng)歸四逆湯，出自漢代張仲景的《傷寒論》，現(xiàn)代研究表明，當(dāng)歸四逆湯有抗凝血、抗炎止痛等作用[13]。采用1H-NMR代謝組學(xué)技術(shù)，在當(dāng)歸四逆湯灌胃給藥1周后，觀察當(dāng)歸四逆湯對(duì)小鼠凝血酶時(shí)間的影響，并采用1H-NMR 技術(shù)分析小鼠血漿代謝物的指紋圖譜，采用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)，研究給藥組與正常組之間的代謝物組差異，篩選與抗凝血作用相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物。代謝組學(xué)結(jié)果顯示連續(xù)當(dāng)歸四逆湯灌胃給藥1周后，能顯著延長(zhǎng)小鼠凝血酶時(shí)間(P<0.05)，且與空白組比較，復(fù)方組內(nèi)源性代謝產(chǎn)物異丁酸、苯丙氨酸和肉堿顯著上調(diào)(P<0.01)，組氨酸、賴氨酸和膽固醇顯著下調(diào)(P<0.05)。肉堿、苯丙氨酸、組氨酸和膽固醇為當(dāng)歸四逆湯抗凝過程中潛在代謝標(biāo)志物，當(dāng)歸四逆湯可能通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、能量代謝和氨基酸代謝影響血小板聚集功能和組織因子、纖維蛋白酶的表達(dá)來發(fā)揮抗凝作用。

2.3 溫心方

溫心方(WXF)由人參、桂枝、薤白、瓜蔞、清半夏、赤芍、麥冬和黃連八種單味藥組成，廣泛用于治療心肌缺血綜合。Cao[14]等采用代謝組學(xué)的分析方法，在雄性Wistar大鼠口服溫心方提取物后，從肝門靜脈收集血液，制備血清樣本，通過UPLC-ESI-Q-TOF-MS技術(shù)，分析溫心方的化學(xué)成分和血漿中的代謝產(chǎn)物，在血漿中檢測(cè)到32種化學(xué)成分，包括溫心方的26種原型化合物和6種代謝產(chǎn)物，可能通過葡萄糖代謝和脂肪酸代謝等途徑而發(fā)揮藥效，為進(jìn)一步的藥理學(xué)研究提供有用的化學(xué)信息，提高了生物活性的靶向成分分析速度。

3 討論

藥物代謝組學(xué)是藥物代謝與代謝組學(xué)結(jié)合,也是藥代學(xué)與藥效學(xué)的結(jié)合(PK-PD)[15]。代謝組平臺(tái)提供了中草藥、中醫(yī)證候、礦物醫(yī)學(xué)和針灸方法來擴(kuò)展對(duì)中醫(yī)藥配方的分析與對(duì)其作用機(jī)制的理解。由于中藥成分復(fù)雜，即使是單味中藥，其中含有多種化學(xué)成分，各化學(xué)成分都有多種藥理作用。因此，中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制的揭示是一個(gè)復(fù)雜的過程。目前，多數(shù)中藥的作用機(jī)制尚不明確，傳統(tǒng)的藥理實(shí)驗(yàn)方法只能在一定程度上揭示中藥的藥理作用機(jī)制，而代謝組學(xué)不僅能夠研究藥物自身的代謝情況，還能進(jìn)一步研究藥物干預(yù)后內(nèi)源性代謝物的變化，從而反映出體內(nèi)生物化學(xué)過程和狀態(tài)的變化[16]。如今，代謝組學(xué)已成為生物系統(tǒng)中小分子代謝物的綜合表征的熱門話題，它可以通過評(píng)估近似生物流體和生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)中的全球代謝分布來區(qū)分患病和非患病狀態(tài)信息[17]。近年來，國(guó)內(nèi)外專家對(duì)多種中藥藥效作用機(jī)制進(jìn)行的代謝組學(xué)研究，取得了有意義的研究結(jié)果，研究方向進(jìn)一步拓展到外源性刺激等更多方面，這樣有利于代謝組學(xué)的發(fā)展和延伸[18-21]，為中藥藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

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2016-10-15

2016-11-17

國(guó)家自然科學(xué)基金(81373931，81573877);黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新人才計(jì)劃(2012RCD07、2012jc01)

吳修紅(1978-)，女，博士，博士后，教授，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究。

*通訊作者：孫暉(1963-)，女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥質(zhì)量分析研究。

R284

A

1002-2392(2017)01-0087-03