項(xiàng)國(guó)仕， 程 曦， 黃孝天

·綜述·

念珠菌菌株分型實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展

項(xiàng)國(guó)仕， 程 曦， 黃孝天

念珠菌； 菌株分型； 基因分型； 分型方法

菌株分型是通過(guò)分類(lèi)，比較不同分離株之間的遺傳相關(guān)性和差異性，并結(jié)合其流行病學(xué)特點(diǎn)，探討菌株之間進(jìn)化關(guān)系的一種研究手段。臨床念珠菌分型在研究其物種相關(guān)性、評(píng)估流行病學(xué)、追溯流行源頭、控制和預(yù)防臨床感染以及抗真菌藥物研發(fā)和抗真菌治療等方面具有重要的指導(dǎo)意義。本文將從原理和優(yōu)缺點(diǎn)等方面，介紹當(dāng)前念珠菌屬主要分型方法及新型分型方法，包括基于蛋白/酶的分型方法、基于精準(zhǔn)DNA序列的分型方法、無(wú)需精準(zhǔn)DNA序列的分型方法等。

1 基于蛋白/酶的分型方法

1.1 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）

研究證實(shí)質(zhì)譜儀可以用于細(xì)菌分型，病原菌鑒定通常基于不同種屬微生物的保守蛋白峰，而對(duì)同一物種的高分辨力分型則依賴于不同分離株特異的蛋白峰[1]，其鑒定的結(jié)果穩(wěn)定、可靠[2]。2009年，MALDI-TOF MS被首次用于酵母的鑒定，2011年，開(kāi)始將其應(yīng)用于酵母和類(lèi)酵母等的分型。隨著念珠菌MALDI-TOF MS蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善，MALDI-TOF MS用于臨床念珠菌分型成為可能。

MALDI-TOF MS最突出的優(yōu)勢(shì)是簡(jiǎn)易快速、重復(fù)性較好，并且具有高通量、所需材料少等特點(diǎn)，尤其適合于臨床病原微生物暴發(fā)的相關(guān)研究[3]。MALDI-TOF MS可以通過(guò)建立蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)以用于不同臨床分離株的對(duì)比和不同實(shí)驗(yàn)室的交流，但是目前單一念珠菌物種的蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)并不完善，一些罕見(jiàn)念珠菌的蛋白圖譜尚未被現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)收錄。2014年，De Carolis等[4]利用MALDITOF MS和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）分別對(duì)近平滑念珠菌復(fù)合體進(jìn)行了鑒定和分型，結(jié)果證明，兩種方法對(duì)于近平滑念珠菌復(fù)合體的鑒定與核糖體DNA測(cè)序結(jié)果一致；MALDI-TOF MS分型結(jié)果與AFLP相似，但作為真菌分型工具，其利用價(jià)值需要進(jìn)一步評(píng)估。目前，MALDI-TOF MS在微生物分型方面尚未普及，且沒(méi)有規(guī)范化的操作或標(biāo)準(zhǔn)，因此具有很大的研發(fā)空間和潛能。

1.2 多位點(diǎn)酶電泳（MLEE）

MLEE的理論依據(jù)是“一基因一酶”學(xué)說(shuō)，它是基于菌株同工酶（isoenzymes）或異型酶（allozymes）（主要為代謝酶，代謝酶基因在環(huán)境選擇壓力下比較穩(wěn)定）多態(tài)性的一種分型方法。2012年，Santos等[5]利用MLEE對(duì)分離于陰道念珠菌病患者的28株白念珠菌進(jìn)行了分型，其中16株白念珠菌為高度相關(guān)，證明MLEE具有強(qiáng)大的菌株區(qū)分能力和很好的重復(fù)性。然而，至少需要檢測(cè)10種以上的酶才能使菌株之間具備足夠的可變性，這無(wú)疑增加了實(shí)驗(yàn)成本。另外，由于所檢測(cè)的代謝酶基因變異緩慢以及密碼子的兼并性等因素，導(dǎo)致MLEE并沒(méi)有足夠的靈敏度以檢測(cè)出念珠菌亞種的快速而細(xì)微的變化[6]。最后，MLEE分型不便于不同實(shí)驗(yàn)室之間的數(shù)據(jù)交流和對(duì)比研究。盡管如此，在評(píng)價(jià)菌株遺傳相關(guān)性時(shí)，這種分型方法優(yōu)于其他一些流行的DNA印記的方法。

2 基于精準(zhǔn)DNA序列的分型方法

2.1 重復(fù)序列依賴PCR（REP-PCR）

REP-PCR是目前較為常用的分型方法之一，該方法使用特異引物擴(kuò)增貫穿于真菌基因組的非編碼短重復(fù)序列，擴(kuò)增片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后染色，即可顯示出不同的帶型。目前，REPPCR因其快速、經(jīng)濟(jì)而被廣泛用于多種臨床病原微生物的流行病學(xué)研究中，如白念珠菌及其他念珠菌等[7-8]。

REP-PCR分型技術(shù)不僅可以很好地區(qū)分種間差異，同時(shí)能夠揭示種內(nèi)差異。它具有與隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）類(lèi)似的優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單快捷、經(jīng)濟(jì)方便。相對(duì)于RAPD分型，REP-PCR使用特異引物，圖譜條帶更加清晰，而且重復(fù)性更好。2014年，Tamai等[7]對(duì)分離于HIV陽(yáng)性患者口腔的100株白念珠菌進(jìn)行了25S rDNA分型，結(jié)果分為3個(gè)基因型（A型、B型和C型）；隨后利用靶向PRS基因ALT重復(fù)序列的特異引物分別對(duì)3種基因型的菌株進(jìn)行REP-PCR分型，將每種基因型的菌株進(jìn)一步分為4個(gè)亞型，證明REA-PCR是一種快速簡(jiǎn)單的基因分型技術(shù)，不僅可以從近緣種中區(qū)分出白念珠菌，并且對(duì)于念珠菌感染皮膚病學(xué)分子水平上的管理和控制非常有用。然而，與RAPD一樣，REP-PCR分型技術(shù)同樣也受實(shí)驗(yàn)條件的影響，PCR所用的Mg2+濃度、Taq酶來(lái)源、模板完整性以及PCR儀自身的不穩(wěn)定因素等都可能影響最終的帶型。目前市場(chǎng)上已有商品化REPPCR分析系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)REP-PCR的半自動(dòng)化和規(guī)?；?，并且具有更簡(jiǎn)便、標(biāo)準(zhǔn)化、高重復(fù)性的特點(diǎn)。

2.2 微衛(wèi)星長(zhǎng)度多態(tài)性（MLP）

MLP基于基因組中由2～6 bp短重復(fù)序列組成的微衛(wèi)星序列拷貝數(shù)的高度變異性。MLP根據(jù)特定微衛(wèi)星序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增該微衛(wèi)星位點(diǎn)的核心序列和部分側(cè)翼序列，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離形成不同大小的條帶。Li等[9]對(duì)白念珠菌的微衛(wèi)星分析分型系統(tǒng)作了改進(jìn)并廣泛用于白念珠菌及其他念珠菌[10]的基因分型。

MLP是一種新型有效的分型方法，其突出的優(yōu)勢(shì)在于高分辨率、高通量、自動(dòng)化，甚至可以建立數(shù)據(jù)庫(kù)用于不同實(shí)驗(yàn)室交流或數(shù)據(jù)的比較研究。然而，MLP分辨力依賴于所用的微衛(wèi)星標(biāo)記，不同實(shí)驗(yàn)室難以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化程序。此外MLP重復(fù)性不高，容易受實(shí)驗(yàn)條件影響。Li等[11]建立了一項(xiàng)基于單鏈構(gòu)造多態(tài)性（single-strand conformation polymorphism，SSCP）技術(shù)的PCR-SSCP方法，使用CAI引物進(jìn)行微衛(wèi)星多態(tài)性分析，不僅可以獲得較高的分辨力，而且該方法同時(shí)檢測(cè)3個(gè)不同水平的微衛(wèi)星多態(tài)性，已成為臨床實(shí)驗(yàn)室白念珠菌快速分型和微進(jìn)化檢測(cè)有力的、經(jīng)濟(jì)的分型方法。

2.3 多位點(diǎn)序列分型（MLST）

MLST是由MLEE衍化而來(lái)的一項(xiàng)基于測(cè)序技術(shù)的基因分型技術(shù)。MLST基于6～11個(gè)管家基因（500 bp左右）的內(nèi)部片段核苷酸序列中的多態(tài)性位點(diǎn)（SNP），每一個(gè)管家基因片段所有SNP的排列組合形式按照發(fā)現(xiàn)的先后順序分配一個(gè)等位基因號(hào)（allele number），所有等位基因號(hào)組成菌株的等位基因圖譜，每一個(gè)不同的基因圖譜分配一個(gè)序列號(hào)，即為該菌株的序列型（sequence type， ST）。遺傳相關(guān)的菌株等位基因號(hào)的排列組合相似，反之，不相關(guān)菌株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。2003－2004年，Bougnoux等[12]評(píng)估了MLST在白念珠菌分型中的價(jià)值，并確定了白念珠菌MLST分型的國(guó)際金標(biāo)準(zhǔn)。

MLST突出表現(xiàn)是擁有標(biāo)準(zhǔn)化策略、數(shù)字化數(shù)據(jù)、高分辨力、高重復(fù)性和高準(zhǔn)確性的特點(diǎn)。2015年，Wu等[13]利用MLST對(duì)62株白念珠菌進(jìn)行分型，共得到50個(gè)ST，其中新發(fā)現(xiàn)41個(gè)ST，證明MLST是研究白念珠菌流行病學(xué)和進(jìn)化的有用工具。MLST分型是目前唯一建立了數(shù)據(jù)庫(kù)的基因分型方法，目前已建立了MLST數(shù)據(jù)庫(kù)的念珠菌包括白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌和熱帶念珠菌等4種臨床常見(jiàn)念珠菌。MLST分型標(biāo)準(zhǔn)化的策略和數(shù)據(jù)庫(kù)的建立使其可以在全球范圍內(nèi)各國(guó)家或地區(qū)的不同實(shí)驗(yàn)室之間，通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)進(jìn)行交流、比較以及數(shù)據(jù)更新。因此，MLST分型是念珠菌群體遺傳、分子系統(tǒng)發(fā)生學(xué)和流行病學(xué)研究的最佳手段之一。

然而，MLST分型的成本較高，對(duì)于一些地區(qū)或?qū)嶒?yàn)室并非能首選。MLST分析的管家基因片段大小在300～500 bp，并且分布于特定的幾條染色體上，因此，相同序列號(hào)的菌株之間實(shí)際上在待測(cè)片段以外的其他區(qū)域序列可能并不相同；不同SNP排列組合可能因念珠菌的二倍體性質(zhì)而分配到同樣的序列號(hào)；此外，一些念珠菌如近平滑念珠菌的管家基因序列差異較小，這些物種并不適合使用MLST分型[14]。

3 無(wú)需精準(zhǔn)DNA序列的分型方法

3.1 脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）

PFGE技術(shù)利用規(guī)律變化的電場(chǎng)來(lái)促使染色體片段在凝膠中迂回遷移而達(dá)到分離染色體片段的目的。相對(duì)于染色體大小為1～4 Mb的念珠菌而言，PFGE是一種分離染色體DNA分子、分析染色體帶型以及檢測(cè)染色體組型變化的理想方法。目前基于PFGE技術(shù)的分型方法包括核型分析（electrophoretic karyotyping，EK）和染色體限制酶片段模型（chromosomal restriction fragment pattern）等。EK被廣泛地運(yùn)用于白念珠菌及其他念珠菌分型中。其優(yōu)點(diǎn)是重復(fù)性好，對(duì)帶型的解釋明確。然而，受念珠菌染色體數(shù)目以及單個(gè)染色體大分子量的限制，EK并沒(méi)有足夠的能力區(qū)分中度相關(guān)的分離株，也不能檢測(cè)出同一菌株微進(jìn)化。另一方面，EK操作復(fù)雜枯燥，所需設(shè)備成本高，并且耗時(shí)費(fèi)力。

3.2 RAPD

RAPD分型技術(shù)使用1條含8～10個(gè)堿基的隨機(jī)引物，以基因組DNA為模板，在較低嚴(yán)格條件下（如退火溫度為35 ～40 ℃，Mg2+濃度為2.5 mmol/L）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并產(chǎn)生許多未知大小的DNA片段；PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離組成RAPD帶型。RAPD帶型的區(qū)分依賴于電泳條帶的數(shù)量和大小，遺傳上不相關(guān)的菌株帶型差異較大。

RAPD的缺點(diǎn)是重復(fù)性不高，難以實(shí)現(xiàn)結(jié)果比較。然而RAPD分型技術(shù)不需要獲知待測(cè)物種準(zhǔn)確的基因組序列信息，具有較高的靈敏度和特異度[15]，并且該方法簡(jiǎn)單快速、成本較低，因此被廣泛應(yīng)用于念珠菌及其他真菌的基因分型中[16-17]。Wu等[16]利用25S rDNA和RAPD分別對(duì)分離于牙齒的40株白念珠菌進(jìn)行了分型，結(jié)果顯示，25S rDNA將40株分離株分為3個(gè)基因型，而RAPD分為5個(gè)基因型，證明RAPD是可靠全面的分型方法。此外，有研究者認(rèn)為分別使用不同隨機(jī)引物進(jìn)行RAPD分型，并組成復(fù)合圖譜，可以提高RAPD的分辨力。

3.3 PCR解鏈曲線圖形（PCR melting profle，PCR MP）

DNA測(cè)序表明：在GC含量上，基因組DNA片段表現(xiàn)出大量的異質(zhì)性。限制性內(nèi)切酶消化后的基因組DNA片段的解鏈溫度依賴于這些片段的長(zhǎng)度和GC含量。也就是說(shuō)，消化后的基因組DNA熱穩(wěn)定性是存在差異的。PCR MP最初用于大腸埃希菌的臨床菌種分型，2009年首次用于白念珠菌的基因分型。

PCR MP是一種新型基因分型方法，目前在念珠菌中應(yīng)用不多[18-19]。2014年，Golas等[18]利用PCR MP將115株光滑念珠菌分為52個(gè)不同帶型，確認(rèn)了PCR MP對(duì)于區(qū)分光滑念珠菌種內(nèi)遺傳關(guān)聯(lián)的有用性。PCR MP分型的優(yōu)點(diǎn)是DNA用量少，操作簡(jiǎn)易，重復(fù)性好，結(jié)果簡(jiǎn)單易于分析，并且對(duì)DNA完整性和實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求不高，是一種快速、經(jīng)濟(jì)的分型方法，尤其適合于臨床重要真菌短期流行病學(xué)研究。然而，PCR MP的分辨力與選用的限制酶和Taq酶有關(guān)，同時(shí)對(duì)PCR擴(kuò)增的變性溫度和退火溫度較為敏感，因而對(duì)反應(yīng)條件的優(yōu)化必不可少，選擇合適的限制酶和Taq酶尤為重要。

4 小結(jié)與展望

念珠菌分型是念珠菌流行病學(xué)和種群結(jié)構(gòu)研究的有用工具，種群結(jié)構(gòu)的研究有利于抗真菌藥和治療方案的選擇。MLP和MLST作為準(zhǔn)確DNA依賴的分型方法，產(chǎn)生的結(jié)果精確、分辨力高、重復(fù)性好，并且可建立數(shù)據(jù)庫(kù)。相對(duì)于其他分型方法，MLP和MLST更適合于全球范圍內(nèi)的流行病學(xué)研究。新興分型方法MALDI-TOF MS雖然需要質(zhì)譜儀，但其通量大，結(jié)果簡(jiǎn)單，耗時(shí)短；PCR MP分辨力中等，介于RAPD和MLST之間，是一種新興的、快速簡(jiǎn)易、結(jié)果簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)靈敏的中通量分型方法。這兩種分型方法更適合于臨床實(shí)驗(yàn)室已知菌株臨床流行病學(xué)的大規(guī)模調(diào)查研究。PFGE、RFLP和RAPD等分型方法不需要獲知待測(cè)菌株的具體遺傳信息，對(duì)于臨床上未知菌株的分類(lèi)鑒定和種群結(jié)構(gòu)研究較為適合。因此，合適的分型方法應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況（如研究目的、實(shí)驗(yàn)條件等）進(jìn)行選擇。

目前，相關(guān)研究者常常結(jié)合多種分型方法進(jìn)行對(duì)比研究，如將基因分型方法和表型分型方法（如耐藥性、毒性等）結(jié)合，研究不同表型菌株的種群結(jié)構(gòu)和微進(jìn)化關(guān)系等。在念珠菌分型研究中，未來(lái)的10年內(nèi)這種結(jié)合多種分型方法對(duì)比研究的趨勢(shì)可能將更加明顯；另外，先使用一種分辨力較低或中等的分型方法（如RAPD、ABC分型、PCR 25S rDNA和PCR MP等）進(jìn)行粗略分型，然后使用準(zhǔn)確性更高的分型方法（如MLP和MLST等）對(duì)前者難以區(qū)分的遺傳密切相關(guān)菌株進(jìn)行精確分型。這樣結(jié)合不同分型方法，不但可以減少工作量和實(shí)驗(yàn)費(fèi)用，而且同樣可以達(dá)到較為理想的菌株分型目的。此外，隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，未來(lái)測(cè)序費(fèi)用降低，屆時(shí)基于完整基因組比對(duì)的基因分型或?qū)⒊蔀榕R床念珠菌分型的常規(guī)方法。

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Research updates on the typing of Candida

XIANG Guoshi, CHENG Xi, HUANG Xiaotian. （Department of Medical Microbiology, Medical College, Nanchang University, Nanchang 330006, China）

R379.4

A

1009-7708 ( 2017 ) 02-0215-04

10.16718/j.1009-7708.2017.02.020

2016-02-23

2016-03-16

國(guó)家自然科學(xué)基金（81160196, 8460300），江西省青年科學(xué)家培養(yǎng)項(xiàng)目（20133BCB23005），江西省科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目（20142BAB215053）聯(lián)合資助。

南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)部微生物學(xué)教研室，南昌 330006。

項(xiàng)國(guó)仕（1990—），男，碩士研究生，主要從事病原微生物研究。

黃孝天，E-mail：xthuang@ncu.edu.cn。