周 磊丁玉平

（1中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193；2廣東溫氏食品集團股份有限公司，廣東新興 527400）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒類NADC30毒株的新近流行

周 磊1*丁玉平2

（1中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193；2廣東溫氏食品集團股份有限公司，廣東新興 527400）

豬繁殖與呼吸綜合征是嚴重危害養(yǎng)豬生產的病毒性傳染病。自20世紀90年代中期在我國發(fā)生和流行以來，已經20余載。據田間流行優(yōu)勢毒株的不同，可大致分為三個階段：經典毒株流行階段 （1995-2006年）、高致病性變異株流行階段 （2006-2013年）和新近的類NADC30毒株流行階段 （2013年至今）。2013-2014年間與美國分離株NADC30親緣性較高的一類PRRSV毒株開始在我國暴發(fā)流行，其具有與NADC30和MN184等譜系1（lineage 1）毒株相同的nsp2編碼區(qū)缺失模式。致病性分析及疫苗保護試驗結果表明，其致病性介于高致病性毒株與經典株之間，目前商用疫苗對其保護效果不佳。且類NADC30毒株易與其他PRRSV毒株發(fā)生重組，產生新的變異株。類NADC30毒株的廣泛流行，以及相關重組毒株的疊現，進一步增加了PRRS疫病防控的難度。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒 （PRRSV）；類NADC30（NADC30-like）；分子流行病學；致病性與免疫保護；重組

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是以引起母豬流產、早產、產木乃伊胎等繁殖障礙以及各日齡豬只呼吸道疾病為特征的病毒性傳染病[1]。自20世紀80年代末，該病首次在美國[2]和歐洲[3,4]相繼暴發(fā)以來，出現并流行已近30年，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經濟損失。

病原豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）屬于動脈炎病毒科動脈炎病毒屬成員，為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組不分節(jié)段[5]。根據該病毒抗原性和基因組差異，可分為以LV毒株為代表的歐洲型（基因1型）和以VR-2332毒株為代表的北美型（基因2型）[6]。Shi等[7]基于全球PRRSV ORF5序列的遺傳演化分析，可將基因2型毒株分為9個譜系(lineage)，該研究其后成為同一基因型內毒株分類的重要標準。PRRSV致病性以及免疫原性在兩種基因型間存在較大差異，同時，即使在同一基因型內，也存在廣泛的毒株多樣性。其基因組的持續(xù)變異以及異源毒株間交叉保護力較差的特性，是導致其廣泛流行、難以防控的重要原因。

1 我國不同流行階段的毒株特征

我國臺灣地區(qū)于1991年首次報道該病的暴發(fā)，隨后大陸地區(qū)于20世紀90年代中期發(fā)生和流行該病，并在短時間內便廣泛傳播至全國各地[8]。自PRRS首次流行至今，基因2型毒株一直是我國的主要流行毒株，基因1型毒株僅有零星報道，且分離株致病性不高，尚未顯示太大的臨床危害[9,10]。根據田間自然分離株的基因組及致病性特征，可人為地將我國PRRS的流行大致分為三個階段。

第一個階段為經典毒株流行階段。1996年郭寶清等[8]在北京某發(fā)病豬場的流產胎兒內分離出第一株基因2型的國內流行株CH-1a，該毒株與美國最早的分離株VR-2332在基因組序列上差異較大，目前還沒有確切的證據表明CH-1a是來源于北美還是我國本土演化而來的毒株。1997年楊漢春等[11]分離到一株與VR-2332毒株高度同源的毒株BJ-4，序列分析溯源表明該毒株來源于北美的生豬引種或豬產品貿易引入我國。2004年Gao等[12]報道了兩株特征性分離株HB-1(sh)/2002以及HB-2(sh)/2002。前者后來證明是CH-1a向高致病毒株演化過程中的中間毒株，而后者則是第一個報道的nsp2編碼區(qū)內含有12個氨基酸缺失的自然缺失株。該階段PRRS在臨床的發(fā)病多以母豬流產為主，兼有各日齡豬只的呼吸道癥狀，但對豬只特別是成年豬的致死性鮮有報道。

第二個階段為高致病性變異株的流行階段。2006年夏，以高熱、急性死亡、高發(fā)病率和高死亡率以及妊娠母豬的嚴重繁殖障礙為特征的嚴重型PRRS（Atypical PRRS）在我國暴發(fā)和流行，造成大批豬只死亡，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成了前所未有的沖擊[13,14]。研究表明，該病的病原是高致病性PRRSV（highly pathogenic PRRSV,HP-PRRSV），其nsp2編碼區(qū)內30個氨基酸（481aa，531—561aa）的缺失模式是其重要分子標志。隨后該毒株席卷全國，并傳至周邊東南亞國家，迅速成為田間的優(yōu)勢流行株。通過對之前不同年代的分離株進行遺傳演化分析發(fā)現，HP-PRRSV是由我國早前毒株經歷基因組的變異逐漸演化而來的[15]。隨著致弱活疫苗的廣泛和大量使用，一方面在豬群中形成較強的免疫壓力；另一方面，疫苗株來源的活病毒在田間仍可循環(huán)和傳播，二者共同導致了PRRSV毒株變異演化速率的加快和毒株多樣性的增加，表現為具有不同插入、缺失、突變和重組特性的新毒株的頻繁出現。雖然隨著豬群免疫水平的增加以及宿主的篩選，HP-PRRSV毒株在流行過程中致病性逐漸降低，由HP-PRRSV感染引發(fā)的急性死亡案例逐漸減少（但仍有零星發(fā)生），更多的是HP-PRRSV造成的妊娠母豬繁殖障礙，豬群免疫抑制，繼發(fā)感染難以控制，從而導致的生產損失。

第三個階段為類NADC30毒株的新近流行。2014年以來，國內多個實驗室相繼報道從臨床母豬流產或仔豬呼吸道病發(fā)病病例中分離到屬于譜系1（lineage 1）的新型毒株，該類毒株與美國的NADC30毒株高度同源，且有相同的nsp2編碼區(qū)的缺失模式，因此命名為類 NADC30（NADC30-like）毒株[16-25]。類 NADC30感染豬場以母豬中后期流產等繁殖障礙為特征，發(fā)病母豬群的流產率可達30%～40%左右。哺乳仔豬、保育豬和生長育肥豬以呼吸道疾病為主，豬細菌性繼發(fā)感染和死淘率增高。且該毒株可在豬場持續(xù)存在很長時間，造成種豬群和生長豬群生產成績極不穩(wěn)定。

以上三個階段僅以優(yōu)勢毒株和流行趨勢劃分，并無嚴格時間界限，各類毒株的流行情況均有重疊，并有單個豬場多種毒株共感染的情況存在，因此增加了毒株重組的概率以及PRRS防控的復雜性。

2 類NADC30毒株分子特征與毒株溯源

本實驗室通過對2014年8月期間分離的類NADC30代表性毒株CHsx1401進行全基因組序列測定和分析發(fā)現，在不統(tǒng)計Poly（A）的情況下，該毒株基因組全長15 020 nt，與NADC30一致，且含有其nsp2編碼區(qū)內標志性片段缺失，即與基因2型原型株VR-2332相比，其nsp2編碼區(qū)在第323—433位，第481位和第533—551位共計缺失131個氨基酸，該缺失方式與同屬 lineage 1的MN184A、MN184B和MN184C一致[26]。

全基因組核苷酸同源性分析表明，CHsx1401與NADC30的親緣性最高，核苷酸同源性為95.7%；與NADC30同一譜系的美國株 MN184A、MN184B、MN184C的同源性分別為87.1%、87.4%、87.3%；與VR-2332株的同源性為85.8%；與國內高致病性毒株親緣性最低，與JXwn06的同源性僅為83.8%。在基于全基因組核苷酸序列繪制的進化樹中，新分離的類NADC30毒株與北美的 lineage 1毒株 NADC30、MN184A、MN184B和MN184C同屬一個獨立分支。該結果證實了類NADC30毒株應該是由美國傳入我國的外來毒株。

回顧性分析發(fā)現，早于2011年5月本實驗室就從山西某豬場的PRRSV陽性病料中擴增出與MN184A同屬一個譜系的ORF5基因。2013年，河南農業(yè)大學王川慶老師團隊分離到兩株類NADC30毒株HENAN-XINX和HENAN-HEB，全基因組序列分析發(fā)現，與CHsx1401同源性分別為93.0%和93.2%，這兩個分離株雖與NADC30株的同源性最高，但跟NADC30的親緣性稍微遠于CHsx1401，說明其在河南省的出現應該早于2013年，從美國傳到中國后已經在國內豬群中低水平流行了一段時間，發(fā)生了變異。

3 類NADC30毒株的致病性及當前疫苗對其保護性

為了探明類NADC30毒株的致病性，本實驗室參照HP-PRRSV致病性的評價體系，用42日齡SPF仔豬系統(tǒng)測定了代表性毒株CHsx1401的致病性，結果表明，其感染豬在感染初期體溫很快升高至40℃以上，出現食欲不振、精神沉郁、咳嗽打噴嚏等癥狀，但在實驗室條件下攻毒感染，21天內豬只并沒有出現死亡，致病性低于HP-PRRSV毒株。血清中病毒滴度、N蛋白抗體水平與NADC30的較為相似[27]。CHsx1401感染豬只剖檢可見典型的間質性肺炎和淋巴結充血腫脹，與Li等[16]報道的另一株類NADC30毒株HNjz15致病性實驗結果一致。

為評估當前商用疫苗對類NADC30新近流行株的交叉保護效果，本實驗室分別選取了應用較廣的譜系5（lineage 5）經典毒株、譜系8（lineage 8）HP-PRRSV傳代致弱毒株以及本實驗室分離的譜系8（lineage 8）經典毒傳代致弱毒株進行免疫攻毒實驗。在平行使用病毒含量相同（2×105TCID50）的三種疫苗免疫28天后，對仔豬進行CHsx1401毒株（2×105TCID50）攻毒感染，結果表明，三個疫苗免疫組和疫苗空白對照組豬只，在體溫反應、臨床癥狀、肺臟眼觀病變、肺臟顯微病變，肺臟中抗原分布多個維度均呈現大致相同的結果，但三種疫苗免疫均對加速感染后病毒血癥的清除具有一定作用[26]。同時，Bai等[28]也系統(tǒng)評估了五種商用疫苗對類NADC30毒株HNjz15的保護效果，發(fā)現疫苗免疫對縮短攻毒豬的發(fā)熱時間、臨床表現和提升日增重有一定效果，但對病毒血癥、組織病理損傷和病毒載量并無影響。雖然兩個試驗所用免疫劑量、攻毒毒株和攻毒劑量并不相同，其結果也略有差異，但結論卻是一致的：由于遺傳演化關系較遠，當前商用疫苗對新近流行的類NADC30毒株缺乏有效的交叉保護性。

4 類NADC30毒株的變異與重組

類NADC30毒株自傳入我國以來，已開始在豬群中廣泛傳播，對該類毒株的分離鑒定以及序列測定的報道逐年增加，其數據表明，我國類NADC30毒株與美國分離株NADC30的親緣關系逐漸降低，但在基于ORF5或全基因組的進化樹中，類NADC30毒株仍然與NADC30、MN184A、MN184B以及MN184C等譜系1（lineage 1）的美國分離株處于同一分支。在類NADC30毒株變異過程中，除了核苷酸（氨基酸）的替換以及新近發(fā)現的ORF5編碼區(qū)單個氨基酸的缺失，最主要的是與其他毒株的重組。Zhao等[29]在2015年最早報道了類NADC30毒株與HP-PRRSV毒株的重組毒JL580，在人工感染試驗中該毒株對6周齡仔豬呈現100%的致死率，作者推測類NADC30的傳入以及與國內毒株的重組是導致2013—2014年間大量PRRS案例暴發(fā)的重要原因。其后本實驗室也在2015年分離到一株類NADC30與HP-PRRSV致弱活疫苗重組的嵌合毒TJnh1501，其致病性高于兩株親本毒。近期，我們對2015—2017年間登陸GenBank的292株中國毒株進行分析，發(fā)現30株重組毒株，其中24株為類NADC30毒株重組毒，且隨著年份的推進，重組毒的比例逐年增加。結果表明，類NADC30毒株極易與其他病毒重組，但其分子機制目前尚有待研究。

5 展望與思考

類NADC30毒株為何流行比例會迅速上升，甚至有成為田間主要流行株的可能，推測有以下幾個原因：⑴當前疫苗對其保護性不足，所免疫豬群仍能夠感染發(fā)病，并進一步排毒，利于毒株擴散。⑵推測類NADC30毒株有可能復制保真性更差，更容易變異，這樣的毒株在適應宿主的過程中有更大的優(yōu)勢。⑶類NADC30毒株容易重組，重組之后，經宿主篩選，可能出現增殖能力更強、更能免疫逃逸的毒株。

總之，臨床流行毒株的多樣性，以及自身的易變異

性和目前商用疫苗對其交叉保護效率的不足，是導致新近類NADC30毒株廣泛流行、難以控制的重要原因。

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S852.65

A

1673-4645(2017)11-0020-04

2017-11-20

國家自然科學基金（31772759）

*通訊作者：周磊（1981-），男，博士，副教授，主要從事豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）等病毒性傳染病的分子致病機理、遺傳變異規(guī)律以及感染與免疫機理研究，E-mail：leosj@cau.edu.cn

收稿日期：2017-10-31

基金項目：黑龍江省自然科學基金（JC2017010），中國農業(yè)科學院基本科研業(yè)務費（Y2017JC16），哈爾濱市科技創(chuàng)新人才研究專項資金（2016RAQXJ142）

安同慶（1978-），男，博士，研究員，主要從事動物病毒分子生物學研究，E-mail：antongqing@caas.cn