王罡 劉大凱 趙鋼 遲曉飛

現(xiàn)已證明周?chē)窠?jīng)的再生能力主要?dú)w因于雪旺細(xì)胞, 當(dāng)周?chē)窠?jīng)損傷時(shí) , 雪旺細(xì)胞可通過(guò)分泌神經(jīng)因子、產(chǎn)生促突起生長(zhǎng)因子、與再生軸突形成縫隙連接和緊密連接對(duì)神經(jīng)再生發(fā)揮重要作用［1］。雪旺細(xì)胞的生物學(xué)特性決定了其是周?chē)窠?jīng)再生過(guò)程中的重要種子細(xì)胞, 并正成為周?chē)窠?jīng)損傷修復(fù)領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)。七厘散由血竭、紅花、乳香、沒(méi)藥、兒茶、冰片、麝香等組成, 具有活血化瘀, 消腫止痛的功效,臨床多用于創(chuàng)傷后神經(jīng)組織出血、水腫、微循環(huán)障礙、減緩由缺血缺氧導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡［2］。為了解周?chē)窠?jīng)損傷后中藥七厘散是否可以促使雪旺細(xì)胞增殖分化, 從而促進(jìn)周?chē)窠?jīng)損傷后的修復(fù)問(wèn)題, 設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 2月齡SD大鼠4只, 雌雄不限, 體重(180±30)g,均由大連醫(yī)科大學(xué)SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物均為實(shí)驗(yàn)用合格應(yīng)用, 處理原則符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 雪旺細(xì)胞的培養(yǎng)及純化 無(wú)菌條件下分離SD大鼠臂叢神經(jīng), 用0.25%的胰蛋白酶消化, 用胎牛血清中止消化,離心以后加入DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)。3～5 d后對(duì)細(xì)胞應(yīng)用免疫磁珠陽(yáng)性分選方法進(jìn)行純化, 培養(yǎng)2 d后進(jìn)行傳代接種,培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)提純后的大鼠臂叢神經(jīng)雪旺細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、并繪制其生長(zhǎng)曲線, 采用細(xì)胞免疫熒光染色對(duì)細(xì)胞進(jìn)行S-100免疫熒光鑒定并且計(jì)算細(xì)胞純度。

1.2.2 七厘散含藥血清的制備 七厘散灌胃液按照0.15 g/1.5 ml配置, 每天每只大鼠灌胃2次, 間隔12 h, 連續(xù)灌胃, 取血當(dāng)日早晨在灌胃, 最后麻醉大鼠開(kāi)腹, 取血清混合液, 離心后過(guò)濾除菌, 以存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 不同干預(yù)分組 雪旺細(xì)胞經(jīng)過(guò)貼壁培養(yǎng)及鑒定后P3代細(xì)胞接種于器皿中, 加入七厘散進(jìn)行干預(yù), 含量5%［3］, 設(shè)為實(shí)驗(yàn)組；對(duì)照組加入等量生理鹽水。采用S-100免疫熒光法鑒定雪旺細(xì)胞及純度, 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞活力及增值情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示, 采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雪旺細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)及鑒定 雪旺細(xì)胞經(jīng)S-100免疫熒光標(biāo)記染色提示陽(yáng)性細(xì)胞率達(dá)90%以上, 純化后的大鼠臂叢雪旺細(xì)胞純度為(97.5±1.3)%。5%七厘散含藥血清可以促進(jìn)雪旺細(xì)胞增殖。

2.2 含藥血清干預(yù)后細(xì)胞活力 細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示, 實(shí)驗(yàn)組倍增時(shí)間為6 d, 明顯優(yōu)于對(duì)照組的8 d。且實(shí)驗(yàn)組A490值為(0.385±0.037), 高于對(duì)照組的(0.347±0.045), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。

3 討論

臂叢神經(jīng)損傷是一種致殘性的疾病, 主要表現(xiàn)以肩胛帶肌為主的疼痛、無(wú)力和肌萎縮, 且預(yù)后較差。是一種很?chē)?yán)重的神經(jīng)性疾病, 對(duì)患者的影響也特別嚴(yán)重。因此, 對(duì)于臂叢神經(jīng)損傷患者的有效治療成為了一個(gè)急需解決的問(wèn)題［4］。

雪旺細(xì)胞是一種神經(jīng)纖維層的外膜, 具有可以增加神經(jīng)元的存活率、促進(jìn)細(xì)胞軸突生長(zhǎng)和提高神經(jīng)元再生的能力,保護(hù)正常神經(jīng)傳導(dǎo)性的作用。因此, 雪旺細(xì)胞是周?chē)窠?jīng)再生和周?chē)窠?jīng)組織工程研究的重要細(xì)胞, 不僅為神經(jīng)修復(fù)提供支撐, 尚可誘導(dǎo)神經(jīng)纖維生長(zhǎng)的方向［5］。如果能夠找到一種新的藥物, 能夠提高雪旺細(xì)胞的生物學(xué)活性, 將會(huì)對(duì)周?chē)窠?jīng)的修復(fù)與再生, 人工神經(jīng)的創(chuàng)建, 臨床上臂叢神經(jīng)損傷的治療巨大的幫助。

七厘散是《良方集腋》中的方劑, 是治療跌打損傷的名藥,臨床用于治療疾病甚多。有研究顯示, 七厘散含藥血清顯著促進(jìn)外源性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨性分化, 表現(xiàn)在該組的堿性磷酸酶活性、骨鈣素、I型膠原、鈣鹽沉積量和鈣化結(jié)節(jié)數(shù)高［3］。也有研究顯示超微粉碎七厘散對(duì)急性血瘀大鼠的活血化瘀作用和垂體后葉素(Pit)誘發(fā)大鼠心肌缺血損傷的保護(hù)作用增強(qiáng), 可降低其給藥劑量［6］。本研究試想通過(guò)中藥七厘散對(duì)雪旺細(xì)胞增殖分化的影響, 進(jìn)一步探索其治療周?chē)窠?jīng)的損傷作用, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明七厘散在適當(dāng)濃度范圍內(nèi)可以促進(jìn)雪旺細(xì)胞的增殖,從而為促進(jìn)活體神經(jīng)損傷的修復(fù)提供了一些研究基礎(chǔ)。應(yīng)用中藥治療周?chē)窠?jīng)的損傷在臨床上確有積極的療效。

［1］ 甄雪克, 梁劍峰, 楊文強(qiáng), 等.丹紅注射液對(duì)雪旺細(xì)胞中BDNF表達(dá)的促進(jìn)作用研究.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志, 2014,13(6):571-575.

［2］ 劉愛(ài)軍, 陳杏曄.七厘散含藥血清對(duì)乳鼠毛囊成纖維細(xì)胞增殖的影響.陜西中醫(yī), 2014, 35(3):375-377.

［3］ 謝興文, 徐世紅, 李寧, 等.七厘散含藥血清對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、成骨分化的影響.中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志, 2012, 18(10):895-899.

［4］ 張柱基, 龐瑞明, 潘海文, 等.七厘散穴位貼敷對(duì)髖膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后深靜脈血栓形成的防治.陜西中醫(yī), 2016,37(12):1605-1607.

［5］ 李曉濤, 李長(zhǎng)德, 解云川, 等.神經(jīng)干細(xì)胞與雪旺細(xì)胞共移植對(duì)大鼠臂叢神經(jīng)根性撕脫傷的療效.中國(guó)老年學(xué)雜志, 2014,33(4):974-975.

［6］ 趙國(guó)巍, 梁新麗, 王春柳, 等.超微粉碎七厘散對(duì)大鼠急性血瘀血液流變學(xué)及心肌缺血損傷保護(hù)作用的影響.中華中醫(yī)藥雜志, 2015, 30(1):299-301.