張 梅,于英君(審校)

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,黑龍江 哈爾濱150040)

基因治療中重組腺相關(guān)病毒載體的安全性

張 梅,于英君*(審校)

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,黑龍江 哈爾濱150040)

基因治療對常用治療方法難以解決的單基因疾病、癌癥、心血管疾病等往往具有良好的療效。迄今為止，已有超過2000例的基因治療應(yīng)用于臨床試驗[1]，在基因治療臨床試驗中超過68%是應(yīng)用病毒載體。腺相關(guān)病毒(AAV)載體由于其基因傳遞效率高，缺乏致病性和具有良好的安全性而備受青睞[2]。三十多年來，許多應(yīng)用AAV的基因治療臨床試驗取得了成功，rAAV成為人類臨床試驗的最佳載體之一[3,4,5]，但是我們?nèi)匀徊荒芎鲆暬蛑委煹陌踩詥栴}。本綜述旨在比較全面地探討針對rAAV的免疫反應(yīng)、rAAV與載體整合等安全性問題。

1 rAAV載體的免疫反應(yīng)

截止到2017年2月，全世界已有173項以rAAV作為基因載體的臨床研究(http://www.abedia.com/wiley/)。在這些臨床前和臨床試驗中，免疫反應(yīng)常常影響rAAV的基因治療效果。rAAV的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物和衣殼蛋白等都是潛在的抗原[6]。人類復(fù)雜的免疫系統(tǒng)與這些因素相互作用，成為獲得高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和取得長期治療效果的主要障礙。

1.1 針對rAAV載體的固有免疫反應(yīng)

研究表明，胞嘧啶脫氨基酶家族的hA3A蛋白為AAV復(fù)制的有效抑制劑[7]。人類的hA3A能夠綁定病毒單鏈DNA而干擾其合成。這是目前AAV引起固有免疫的直接證據(jù)。補體在AAV引發(fā)的免疫反應(yīng)中扮演著重要的角色，結(jié)合補體進化也證實了存在AAV所引起的固有免疫反應(yīng)[8]。在小鼠體內(nèi)，巨噬細胞在啟動AAV介導(dǎo)的固有免疫反應(yīng)中起到非常重要的作用。然而，單核/巨噬細胞表達的hA3A限制了AAV在該類細胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)[7]。此外，AAV衣殼蛋白與補體C3結(jié)合可抑制巨噬細胞激活及巨噬細胞對AAV的吞噬[8]。上述原因?qū)е铝薃AV在體內(nèi)很少有固有免疫。盡管如此，固有免疫是引發(fā)獲得性免疫的條件，rAAV引發(fā)的細胞免疫和體液免疫的存在都說明了AAV引起的固有免疫廣泛存在于體內(nèi)。

1.2 針對rAAV載體的獲得性免疫反應(yīng)

許多研究顯示，早年曾有AAV感染而產(chǎn)生的抗體會影響后期AAV作為基因治療載體的效果[9,10]。不同血清型的AAV的血清中和抗體陽性率是各不相同的。AAV1和AAV2的陽性率是最高的，AAV2也是抗體滴度最高的血清型[11]。目前，AAV7、8、9和AAVrh10正成為臨床前研究中常見的血清型[12]。有研究表明，AAV2中和抗體的陽性率明顯高于AAV7、8、9 。AAV1抗體陽性率大部分情況下高于AAV7、8、9。大多數(shù)攜帶AAV7、8 、9抗體的受試者體內(nèi)有抗AAV2的抗體，卻很少有攜帶AAV2抗體的受試者也有AAV7、8、9抗體[13]。來自于各種野生AAV感染后產(chǎn)生的循環(huán)免疫球蛋白能夠中和各種血清型的rAAV而抑制基因的體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)。對于同種AAV而言，如果一種AAV給藥方式誘導(dǎo)了長期有效的體液免疫反應(yīng)，那么即使換成另一種給藥方式也會影響其應(yīng)用[14]。通過靜脈注射等血管途徑給藥會影響基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)[15]。

有研究顯示，在正常人群中存在針對衣殼蛋白的特異性記憶性CD8+T細胞[16]。將從健康志愿者體內(nèi)分離的帶有衣殼蛋白抗體的脾細胞擴增后，60%的脾細胞針對AAV2會出現(xiàn)T細胞反應(yīng)[17]。體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)時rAAV重新暴露衣殼蛋白，這些CD8+T細胞即被激活，清除攜帶衣殼蛋白表位的MHCⅠ復(fù)合物的轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞，這種清除呈現(xiàn)出載體的劑量依賴性。Martino等建立了小鼠模型來探索衣殼蛋白特異性CD8+T細胞對基因治療中基因表達的影響，有直接證據(jù)顯示CD8+T細胞反應(yīng)清除了小鼠體內(nèi)已經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的肝細胞，導(dǎo)致轉(zhuǎn)導(dǎo)基因表達減少[18]。CD8+T細胞反應(yīng)也在血友病試驗、DMD試驗等臨床試驗中被觀察到。

在基因治療中，轉(zhuǎn)移基因的蛋白產(chǎn)物是另一種潛在的抗原。但是，與其他病毒載體相比，rAAV的轉(zhuǎn)移基因免疫普遍比較弱。這主要是因為rAAV不能有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)象DC和巨噬細胞這樣的APC。然而，一旦轉(zhuǎn)導(dǎo)APC，轉(zhuǎn)基因編碼的蛋白質(zhì)即被蛋白酶體降解，產(chǎn)生的抗原表位負載于MHCⅠ分子上，MHCⅠ限制性抗原遞呈最終導(dǎo)致針對靶細胞的CD8+T細胞毒性反應(yīng)。與被rAAV直接轉(zhuǎn)導(dǎo)相反，APC能夠結(jié)合分泌蛋白或者吞噬轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞，把它們直接遞呈給MHCⅡ誘導(dǎo)B細胞免疫和形成抗體，或者交叉遞呈給MHCⅠ誘導(dǎo)CD8+T細胞免疫[19]。

2 rAAV載體與宿主染色體的整合

近些年，基因治療過程中，由載體誘導(dǎo)的致瘤、功能基因斷裂、染色體缺失、重排的風(fēng)險已經(jīng)受到了廣泛的重視。rAAV進入細胞后主要以附加體的形式存在，極少數(shù)整合于染色體。但在構(gòu)建的過程中因目的基因占據(jù)了rep基因的位置，進而缺乏了控制定點整合的能力，導(dǎo)致rAAV以低概率與宿主染色體進行同源性非定點整合。rAAV的整合與DNA的修復(fù)密切相關(guān)，例如，rAAV在S期細胞的整合效率比停滯期細胞高200倍，DNA損傷刺激也能提高rAAV整合效率[20]。rAAV全基因組發(fā)生部分降解和在整合前宿主染色體存在缺口是整合發(fā)生的條件。

rAAV的隨機整合如果發(fā)生在基因編碼區(qū)，就可能發(fā)生癌基因激活或者抑癌基因失活，增加癌癥發(fā)生的風(fēng)險。近些年有臨床前實驗報道顯示，應(yīng)用能整合Rian位點相關(guān)的ssAAV進行基因傳遞后，出現(xiàn)了肝細胞癌(HCC)發(fā)生率增加的情況[21]。這些研究和逆轉(zhuǎn)錄病毒因整合引起的臨床致癌案例，使rAAV是一種安全的基因治療載體的“信仰”受到了挑戰(zhàn)。Rosas等試驗了各種可能促進rAAV整合的情況。當在經(jīng)rAAV給藥的β-葡萄糖醛酸酶缺乏的新生小鼠體內(nèi)查出癌癥時，rAAV介導(dǎo)的基因治療能夠致癌已經(jīng)不僅僅是理論上的擔憂了[22,23]。多年建立的經(jīng)rAAV給藥的人類和動物的令人鼓舞的安全性數(shù)據(jù)表明，人類患癌癥的風(fēng)險不能通過嚙齒類動物的經(jīng)驗來進行預(yù)測。因為在實驗性研究中，一些變量潛在影響了癌癥發(fā)生率，這些變量大多數(shù)是嚙齒動物的性別、年齡；轉(zhuǎn)基因序列和啟動子選擇；載體血清型、劑量和給藥途徑；遺傳背景和生活環(huán)境?？傊?，病毒整合將帶來一些危險似乎合乎邏輯，但研究連續(xù)表明這種危險性相對較低，尋找“安全”整合位點，控制整合頻率是未來的研究方向之一。

3 展望

盡管針對rAAV的免疫反應(yīng)及其隨機整合導(dǎo)致的安全問題令其基因治療遭遇重重阻礙，但是近年來rAAV對癌癥、糖尿病等多種頑疾的療效有目共睹。因此，通過減少rAAV的免疫反應(yīng)、提高靶向性及發(fā)現(xiàn)定點整合安全位點等方式來提高rAAV的安全性是今后研究工作重點，克服上述瓶頸將使rAAV能夠更加廣泛地應(yīng)用于基因治療。

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黑龍江省中醫(yī)藥管理局項目(ZHY16-088)

1007-4287(2017)04-0751-03

張梅(1977-)，女，碩士，講師，主要從事中藥抗腫瘤及腫瘤基因治療；于英君(1953-)，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥抗腫瘤及腫瘤基因治療.

2016-12-06)

*通訊作者