薛錦儒,馮永剛,王圖慧,韓春山

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130033)

*通訊作者

從豬主動(dòng)脈中制備脫細(xì)胞基質(zhì)(ECM)的實(shí)驗(yàn)研究

薛錦儒,馮永剛,王圖慧,韓春山*

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130033)

脫細(xì)胞基質(zhì)亦名細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是廣泛存在于動(dòng)物組織器官中的纖維組織，主要由Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ型膠原，絲蛋白，纖維素和殼聚集糖等物質(zhì)構(gòu)成，包括取自小腸的SIS和取自膀胱的UBM[1,2]。由于ECM不存在細(xì)胞成分，因此沒有免疫原性，這是用ECM構(gòu)建組織器官的前提條件之一。同時(shí)ECM來源的組織不同，其所攜帶的生物信息也不同，在構(gòu)建組織器官時(shí)，相同胚層起源的組織所攜帶的生物信息相近，對(duì)于恢復(fù)新建組織器官的功能更為有利。國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用ECM修復(fù)、重建組織器官，尤其在組織工程領(lǐng)域，ECM是極佳的組織支架材料，為種子細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了良好的基礎(chǔ)[3,4]。與消化道、呼吸道重建不同，用ECM重建心血管器官具有一定的特殊性：①ECM要更堅(jiān)固，在重建的主動(dòng)脈或左心室上要承受較大的壓力；②光滑度要求更高，以防止附壁血栓的形成；③邊緣要有足夠的韌度，以免縫合時(shí)邊緣縫針處撕裂，造成漏血。我們從豬的主動(dòng)脈中成功制取了ECM，并用此種ECM修復(fù)左心室，同時(shí)以豬小腸中制取的SIS進(jìn)行對(duì)照研究。

1 材料與方法

1.1 豬主動(dòng)脈ECM的制取

地產(chǎn)白豬10頭，體重100-150 kg，本市屠宰場(chǎng)獲取，缺血時(shí)間在20 min以內(nèi)，取出后立即浸入4℃生理鹽水中，并以生理鹽水洗凈。將主動(dòng)脈平整鋪在操作臺(tái)上，側(cè)面剪開，以眼科剪刀仔細(xì)剪開主動(dòng)脈內(nèi)膜，盡可能多地剪開小口，將主動(dòng)脈內(nèi)膜分塊剔除。肋間動(dòng)脈開口處以11號(hào)手術(shù)刀片仔細(xì)刮除內(nèi)膜以防止細(xì)胞殘留。將主動(dòng)脈翻轉(zhuǎn)，以眼科剪刀剪除主動(dòng)脈外膜，中層平滑肌上剪開盡可能多的小口，以有機(jī)玻璃板仔細(xì)刮除平滑肌層，保留完整的豬主動(dòng)脈ECM。將豬主動(dòng)脈ECM三層折疊、雙面以玻璃加壓，使其緊密相貼，真空干燥。

1.2 豬小腸SIS的制取

在切取主動(dòng)脈的同時(shí)，取同體豬小腸50 cm，取出后立即浸入4℃生理鹽水中，洗凈腸內(nèi)容。將小腸按10 cm長(zhǎng)度剪成段，平整鋪在操作臺(tái)上，側(cè)面剪開，以眼科剪刀仔細(xì)剪開小腸黏膜，盡可能多地剪開小口，將腸黏膜刮除。將小腸翻轉(zhuǎn)，以眼科剪刀剪開漿肌層，仔細(xì)刮除漿肌層，保留白色、半透明、菲薄的SIS。將豬小腸SIS三層，以前述之方法折疊、加壓、干燥。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

地產(chǎn)白豬10頭，體重35±3.9 kg,分為兩組，ECM組5頭，SIS組5頭。肌注Ketamine(1 mg/kg)誘導(dǎo)麻醉，心電監(jiān)測(cè)，血氧飽和度監(jiān)測(cè)。胸部正中切口，劈開胸骨，剪開心包，顯露心臟。右心房注射肝素200 U/kg體重，主動(dòng)脈和右心房分別插管，接人工心肺機(jī)并行循環(huán)。左冠狀動(dòng)脈第二對(duì)角支以6號(hào)Proline線縫扎，造成左室前壁小區(qū)域心肌梗死。根據(jù)心梗范圍，修剪ECM/SIS補(bǔ)片使其大小與梗死范圍相符，將補(bǔ)片預(yù)縫4-0 Proline 線8針。以11號(hào)刀片切除左室前壁梗死區(qū)，將補(bǔ)片縫在左室缺損處，針從心腔內(nèi)縫出，加墊片在心外膜結(jié)扎。停止人工心肺機(jī)并行循環(huán)，拔除主動(dòng)脈和右心房插管，胸骨后放置引流，關(guān)胸。術(shù)后抗菌素(頭孢氨芐30 mg/kg)預(yù)防感染，次日拔除胸骨后引流管，術(shù)后觀察一個(gè)月處死存活動(dòng)物。

2 結(jié)果

ECM組3例動(dòng)物順利完成手術(shù)并存活一個(gè)月，1例術(shù)中死于心室纖顫，另一例術(shù)后一周死于心力衰竭。SIS組2例順利完成手術(shù)，2例于術(shù)中出現(xiàn)SIS補(bǔ)片縫合緣漏血，死于失血性休克。1例存活至術(shù)后5天，活動(dòng)中出現(xiàn)SIS補(bǔ)片破裂而猝死。

存活到一個(gè)月的5例動(dòng)物，以靜脈注射氯化鉀的方式處死。切取心臟左室補(bǔ)片部位，HE染色，光鏡下觀察：兩組左心室補(bǔ)片與左心室心肌結(jié)合部位連接致密，無(wú)漏血現(xiàn)象；心肌細(xì)胞已經(jīng)沿著補(bǔ)片邊緣向中心生長(zhǎng)，ECM組自邊緣向中心生長(zhǎng)3.53±0.21 mm；SIS組自邊緣向中心生長(zhǎng)2.1±0.31 mm (P<0.05)。

3 討論

脫細(xì)胞基質(zhì)(ECM)攜帶原有器官的生物信息已經(jīng)為國(guó)外的研究所證實(shí)[5]，這些生物信息儲(chǔ)存在膠原和纖維當(dāng)中，與胚胎起源有關(guān)，也與組織器官的生物進(jìn)化和功能訓(xùn)練有關(guān)，譬如取自小腸的SIS，用其修復(fù)需要蠕動(dòng)的器官更有優(yōu)勢(shì)。取自主動(dòng)脈的ECM,用其修復(fù)心臟或大血管更佳。

比較兩種補(bǔ)片的堅(jiān)固性，取自主動(dòng)脈的ECM較之取自小腸的SIS更為堅(jiān)固，前者未出現(xiàn)破裂現(xiàn)象，后者則出現(xiàn)一例。在補(bǔ)片邊緣縫針部位的堅(jiān)固程度來看，ECM補(bǔ)片更堅(jiān)韌，縫針處無(wú)裂傷，SIS補(bǔ)片邊緣縫針處出血明顯，2例因出血而死。說明同為三層的脫細(xì)胞基質(zhì)，制備工藝完全相同的情況下，在耐受壓力和堅(jiān)韌程度上，SIS補(bǔ)片均遜于ECM補(bǔ)片。而在兩種補(bǔ)片誘導(dǎo)心肌細(xì)胞爬行生長(zhǎng)方面，ECM補(bǔ)片明顯優(yōu)于SIS補(bǔ)片，細(xì)胞在其表面生長(zhǎng)的速度更快，說明在修補(bǔ)心血管時(shí)宜采用取自主動(dòng)脈的ECM。

[1]李春霖，薛錦儒，吳金鳳，等.豬天然管狀SIS人工食管的制備和不同滅菌方式的比較[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2013，17(1)：15.

[2]Piccoli M,Urbani L,Alvare-Fallaas ME.Improvement of diaphragmatic performance through orthotopic application of decelluarized extracellular patch[J].Biomaterials,2016，74:245.

[3]李春霖，薛錦儒，崔建華.豬小腸與犬食管脫細(xì)胞基質(zhì)(ECM)構(gòu)建組織工程化人工食管的比較研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2013,17(2)：207.

[4]吳金鳳，薛錦儒，崔建華.用豬小腸細(xì)胞外基質(zhì)膜(ECM)修復(fù)家兔缺損胸壁的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2011，15(10):1643.

[5]崔建華，郝 斌，孟曉萍.豬多層細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)人工食管的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2009,13(2)：173.

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2016-07-14)