馮艷霞,賈一凡,顧海華,王豐俊

(北京林業(yè)大學生物科學與技術學院,林業(yè)食品加工與安全北京市重點實驗室,北京 100083)

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響應面法優(yōu)化板栗多肽制備及其清除DPPH·能力的研究

馮艷霞,賈一凡,顧海華,王豐俊*

(北京林業(yè)大學生物科學與技術學院,林業(yè)食品加工與安全北京市重點實驗室,北京 100083)

采用堿性蛋白酶酶解板栗蛋白制備抗氧化肽并測定其清除DPPH·能力。以水解度及DPPH·清除率為指標通過單因素實驗初步得到板栗多肽提取工藝,再根據Box-Behnken中心組合實驗設計原理,采用四因素三水平響應面分析法,建立了以加酶量、酶解溫度、酶解pH、酶解時間與響應值DPPH·清除能力間的回歸方程預測模型,確定了板栗抗氧化肽的最佳制備工藝條件:加酶量2.5%,酶解溫度50 ℃,酶解pH9.5,酶解時間3.7 h。在此條件下DPPH·清除率為92.86%,與理論值基本相符。

板栗多肽,酶解,響應面,DPPH·

板栗(Castaneamollissima)屬殼斗科、栗屬、堅果類植物[1]。板栗仁含有豐富的淀粉、蛋白質、脂肪、鈣、磷、鐵以及多種維生素,具有養(yǎng)胃健脾、補腎強筋、活血止血之功效[2]。板栗中蛋白質含量約為5%～11%,高于稻米,其中賴氨酸、蘇氨酸、色氨酸、蛋氨酸等含量超過FAO/WHO的標準[3]。但目前對板栗的研究多集中在板栗淀粉上,對其蛋白的研究很少,蛋白質酶解后可以得到具有抗氧化、降血壓、抗菌等活性的多肽類物質[4],為了更加合理有效地利用板栗蛋白資源,對多肽的研究是十分必要的。

目前食品工業(yè)中使用的抗氧化劑多數為人工合成,毒副作用大[5],而一些天然抗氧化劑因原料、價格、顏色以及其他一些因素使其應用受到限制,各種原料生產的抗氧化肽以其分子量小、易吸收、活性強等特點受到重視,并能有效地清除體內過剩的活性氧自由基,保護細胞和線粒體的正常結構和功能,防止脂質過氧化的發(fā)生,因而篩選具有強抗氧化活性的天然資源已成為生物學、醫(yī)學和食品科學研究的新趨勢[6]。酶解法制多肽因其反應條件溫和、反應時間短、效率高,在一定條件下可以定位水解,且反應過程易控制,產品純度高,成本低廉,可較好地滿足肽的生產需要,是獲得食品級生物活性肽的常用方法[7]。呂佼等研究了板栗蛋白的提取工藝[8-9],李艷等從板栗中分離鑒定出了歐栗球蛋白并研究了其活性[10],張帥等研究了板栗蛋白的水解工藝[11-12],但目前對板栗多肽抗氧化活性的研究報道很少。本研究以DPPH·清除能力為指標,通過響應面法優(yōu)化了板栗抗氧化多肽的制備條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮板栗 河北遷西板栗研發(fā)工程中心提供;堿性蛋白酶(2000 U/g) 丹麥諾維信公司;DPPH Sigma公司;其它試劑 國產分析純。

JAV-Ⅳ型超聲波細胞粉碎儀 濟寧市奧波超聲波電器有限公司;Thermo Fisher LL1500凍干機 美國賽默飛世爾科技有限公司;H/T16MM型高速離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司;DHG-903385-Ⅲ型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司;SHA-BA水浴恒溫振蕩器 金壇市榮華儀器制造有限公司;T6新世紀紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 板栗蛋白的制備 采用超聲波輔助堿溶酸沉法[8],準確稱取板栗粉,按1∶10料液比加入蒸餾水,用1 mol/L NaOH調節(jié)pH到10,超聲波破碎14 min后,在40 ℃水浴溫度下提取83 min。浸提液4000 r/min離心15 min,取上清液,考馬斯亮蘭法測上清液中板栗蛋白含量[13]。

1.2.2 板栗多肽的制備 參照許慧嬌等人的方法并作適當的修改[14]。

板栗蛋白溶液→水浴(90 ℃,10 min)→調pH至酶解條件→加酶→恒溫水浴酶解→100 ℃,10 min滅酶→調pH至4.2→離心(4000 r/min,5 min)→上清液調pH至7.0→冷凍干燥→板栗多肽。

1.2.3 板栗蛋白水解度的測定 水解度的測定采用TCA法[15]。

1.2.4 板栗多肽DPPH·清除能力的測定 將冷凍干燥后的蛋白酶解產物用超純水配制成質量濃度為2.0 mg/mL的溶液,取2.0 mL于10 mL試管中,然后加入濃度為0.2 mol/L的磷酸緩沖溶液(pH為7.0)1.0 mL和濃度為0.2 mmol/L的DPPH·乙醇溶液2.0 mL,混合均勻,于室溫下暗處靜置30 min,然后在波長為517 nm處測定其吸光度[16-17]。清除率計算公式如下:

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中:A1-DPPH·溶液+樣品溶液的吸光度;A2-體積分數95%的乙醇溶液+樣品溶液的吸光度;A0-DPPH·溶液+超純水的吸光度。

1.2.5 單因素實驗 酶解步驟如1.2.2,在以下條件進行實驗:固定pH9.5、溫度50 ℃、水解時間4 h,研究加酶量(0.5%、2%、4%、6%、8%)對板栗蛋白水解度及多肽DPPH·清除率的影響;固定加酶量2%、pH9.5、水解時間4 h,研究酶解溫度(40、45、50、55、60 ℃)對板栗蛋白水解度及多肽DPPH·清除率的影響;固定加酶量2%、溫度50 ℃、水解時間4 h,研究酶解pH(8.5、9.0、9.5、10.0、10.5)對板栗蛋白水解度及多肽DPPH·清除率的影響;固定加酶量2%、pH9.5、溫度50 ℃,研究酶解時間(2、4、6、8、10 h)對板栗蛋白水解度及多肽DPPH·清除率的影響。

1.2.6 響應面實驗 根據Box-Behnken的中心組合實驗設計原理和單因素實驗的結果,選取加酶量、酶解溫度、酶解pH、酶解時間四個因素為自變量,以DPPH·清除率為響應值,采用四因素三水平的響應面分析方法進行實驗設計,其因素水平編碼表見表1。

表1 實驗因素和水平

1.3 數據處理

響應面實驗結果利用Design-Expert 8.0軟件進行分析,建立回歸方程并作等高線和三維曲面圖,對任意兩種因素的交互效應進行分析和評價,得到最優(yōu)加工工藝組合。其他實驗結果均用Excel軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 加酶量對板栗多肽水解度及DPPH·清除能力的影響 由圖1可以看出,板栗多肽水解度隨加酶量增加先升高,到達最高點后呈現緩慢下降趨勢,在加酶量為2%時水解度達到最大。其DPPH·清除率隨加酶量的增大先升高后降低,同樣在加酶量為2%時達到最大值。加酶量小于4%時,可以看出隨加酶量的增加,板栗多肽水解度及DPPH·清除率變化基本一致,因此用水解度代替DPPH·清除率為衡量指標研究其抗氧化活性。但當加酶量大于4%時,DPPH·清除率的下降速率要比水解度的大,原因可能是過多的加酶量會使蛋白過度水解從而使小分子量的活性多肽分解氨基酸,從而活性降低。因此,此條件下選擇加酶量1%、2%、3%為響應面優(yōu)化條件。

圖1 加酶量對水解度及DPPH·清除率的影響Fig.1 Effect of enzyme concentration on degree of hydrolysis and DPPH· scavenging ability

2.1.2 溫度對板栗多肽水解度及DPPH·清除能力的影響 由圖2可以看出,當酶解溫度低于50 ℃時,板栗蛋白水解度及多肽清除DPPH·的能力均隨加酶量的增加逐漸增加,在酶解溫度為50 ℃時,達到最大值,酶解溫度高于50 ℃時,隨著酶解溫度的升高,清除率及水解度均下降,原因可能是較高的溫度會降低酶的活力,從而使水解度及DPPH·清除率也下降。從圖2中可以看出,隨著溫度的增加,水解度及DPPH·清除率的變化趨勢基本相同,因此該條件下可以用水解度代替DPPH·清除率為指標評價抗氧化活性。堿性蛋白酶的酶解溫度選擇50 ℃ 較合適,因此選擇45、50、55 ℃為響應面優(yōu)化條件。

圖2 酶解溫度對水解度及DPPH·清除率的影響Fig.2 Effect of temperature on degree of hydrolysis and DPPH· scavenging ability

2.1.3 pH對板栗多肽水解度及DPPH·清除能力的影響 由圖3可以看出,隨pH的增加,水解度及DPPH·清除率均呈現先升高后降低的趨勢,當pH為9.5時,DPPH·清除率達到最大值,隨著pH的繼續(xù)增大,DPPH·清除率迅速下降,原因可能是較大的pH破壞了活性多肽的結構,從而使其活性降低。而水解度在pH為10時達到最大,隨后稍有下降,可以看出堿性蛋白酶的最適pH為10?？紤]到實驗的研究重點,因此選擇pH9.0、9.5、10為響應面優(yōu)化條件。

圖3 酶解pH對水解度及DPPH·清除率的影響Fig.3 Effect of pH on degree of hydrolysis and DPPH· scavenging ability

2.1.4 酶解時間對板栗多肽水解度及DPPH·清除能力的影響 由圖4可以看出,隨著酶解時間的增加,水解度不斷增大,在酶解時間為8 h時趨于穩(wěn)定,而DPPH·清除率卻先升高后降低,在酶解時間為4 h時達到最大值。兩者變化趨勢不一樣的可能原因是隨著酶解時間的增加,一些小分子的多肽水解為氨基酸,從而喪失了抗氧化活性。因此在此酶解條件下,選擇2、4、6 h為響應面優(yōu)化條件。

圖4 酶解時間對水解度及DPPH·清除率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on degree of hydrolysis and DPPH· scavenging ability

2.2 響應面優(yōu)化實驗

2.2.1 響應面模型的建立及結果 實驗設計及結果如表2所示。采用Design Expert 8.0統計軟件對實驗結果進行響應面回歸分析,回歸方程的方差顯著性檢驗分析結果如表3所示。

表2 響應面實驗設計及結果

表3 回歸分析結果

注:* 差異顯著p<0.05,** 差異極顯著,p<0.01。 實驗數據進行二次回歸分析,得到回歸方程:Y(%)=2.19A+7.54B+320.76C+5.4D+0.18AB+1.02AC+0.21AD-0.07BC-0.05BD+0.17CD-5.4A2-0.07B2-16.91C2-0.66D2-1622.54?；貧w方程中二次項A2、B2、C2、D2的系數均為負數,說明回歸方程存在穩(wěn)定點,即極大值點。

圖5～圖10直觀地反映了各因素對響應值的影響,隨著各個因素增加,對響應值的影響都呈現先升高再降低的趨勢。由以上分析可知,在各因素中心點附近,多肽有最大的DPPH·清除率,回歸方程具有最優(yōu)水平。

圖5 溫度與加酶量對DPPH·清除率影響的響應面圖Fig.5 Responsive surfaces of effect of temperature and enzyme concentration on DPPH· scavenging ability

圖6 pH與加酶量對DPPH·清除率影響的響應面圖Fig.6 Responsive surfaces of effect of pH and enzyme concentration on DPPH· scavenging ability

圖7 時間與加酶量對DPPH·清除率影響的響應面圖Fig.7 Responsive surfaces of effect of time and enzyme concentration on DPPH· scavenging ability

圖8 pH與溫度對DPPH·清除率影響的響應面圖Fig.8 Responsive surfaces of effect of pH and temperature on DPPH· scavenging ability

圖9 時間與溫度對DPPH·清除率影響的響應面圖Fig.9 Responsive surfaces of effect of time and temperature on DPPH· scavenging ability

圖10 時間與pH對DPPH·清除率影響的響應面圖Fig.10 Responsive surfaces of effect of time and pH on DPPH· scavenging ability

2.2.2 酶解工藝條件的確定 為進一步確定最佳點,利用Design Expert 8.0軟件程序對工藝條件進行優(yōu)化,可得板栗蛋白酶解的最優(yōu)水平為:加酶量2.53%,酶解溫度50.54 ℃,酶解pH9.48,酶解時間3.73 h,在此工藝條件下,軟件程序對板栗蛋白酶解物DPPH·清除率的預測值為93.19%。為了實際的操作方便,將板栗蛋白酶解的工藝參數修正為:加酶量2.5%,酶解溫度50 ℃,酶解pH9.5,酶解時間3.7 h。在此條件下實際測得的DPPH·清除率為92.86%,與理論預測值相比相對誤差在0.35%左右,其IC50值為3.336 mg/mL。采用修正后的提取工藝參數準確可靠,具有實用價值。

3 結論

采用堿溶酸沉法提取板栗蛋白,經堿性蛋白酶酶解制備板栗多肽,并測定板栗多肽的水解度及DPPH·清除能力。通過單因素實驗和Box-Behnken實驗設計以及響應面分析,建立響應值與各因素之間的數學模型,用響應面分析法對工藝參數進行優(yōu)化,得到制備板栗多肽的最佳工藝參數:加酶量2.5%,酶解溫度50 ℃,酶解pH9.5,酶解時間3.7 h。在此條件下實際測得的DPPH·清除率為92.86%,IC50值為3.336 mg/mL。

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Optimization of extraction conditions of Chinese chestnut peptides by response surface methodology and its DPPH· scavenging abilities

FENG Yan-xia,JIA Yi-fan,GU Hai-hua,WANG Feng-jun*

(Key Laboratory of Forestry Food Processing and Security in Beijing,College of Biological Science and Technology of Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)

Antioxidant peptide was prepared by alkaline protease enzymolysising Chinese chestnut protein and its antioxidant activity determined. The craft was obtained with the degree of hydrolysis and the DPPH· scavenging ratio as indicators by single factor tests primarily,then according to Box-Behnken central composition design principle,the method of response surface analysis with 4 factors and 3 levels combined with Design Expert 8.0-statistical data analysis software was adopted to establish the regression equation prediction model of enzyme dose,enzymolysis temperature,enzymolysis pH and enzymolysis time and the DPPH· scavenging ratio as the response value. The optimum preparation conditions were established as follows:enzymedose 2.5%,enzymolysis temperature 50 ℃,enzymolysis pH9.5 and enzymolysis time 3.7 h. Under these conditions,the DPPH· scavenging ratio reached 92.86%,consistent with the theoretical value.

Chinese chestnut peptides;enzymatic hydrolysis;response surface methodology;DPPH·

2016-06-15

馮艷霞(1990-),女,碩士研究生,研究方向:功能性蛋白研究,E-mail:13141234578@163.com。

*通訊作者:王豐俊(1975-),男,副教授,研究方向:油脂與植物蛋白研究,E-mail:wangfengjun@bjfu.edu.cn。

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項重大項目(201204401)。

TS255.1

B

1002-0306(2016)22-0315-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.053