郭曉關(guān)，李 俊

(貴州省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，貴州 貴陽 550004)

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高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定水中氯霉素效果分析

郭曉關(guān)，李 俊

(貴州省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，貴州 貴陽 550004)

為建立水氯霉素殘留檢測(cè)方法，分析了高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定水中氯霉素殘留效果。結(jié)果表明高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定水中氯霉素殘留實(shí)驗(yàn)添加平均回收率為86.1%～92.1 %，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=6)為3.41%～4.57%；相關(guān)系數(shù)為0.9982；方法檢出限為6×10-3μg·L-1，定量限為2×10-2μg·L-1，說明具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高等特點(diǎn)，適用于水中氯霉素殘留檢測(cè)檢測(cè)分析。

水;氯霉素;高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀

氯霉素(chloramphenicol，簡(jiǎn)稱CAP)，由大衛(wèi)·戈特利布(David Gottlieb)于1947年從南美洲委內(nèi)瑞拉的土壤內(nèi)的委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Streptomyces venezuelae)成功分離，再于1949年合成并引入臨床試驗(yàn)。它屬抑菌性廣譜抗生素，是世界上首種完全由合成方法大量制造的廣譜抗生素，對(duì)很多不同種類的微生物均起著作用[1]。但是氯霉素有嚴(yán)重的副作用，它能抑制人體骨髓造血功能而引起再生障礙性貧血和粒狀白細(xì)胞缺乏等疾病。因此，國(guó)內(nèi)外都有相關(guān)法規(guī),，來限定食品中氯霉素的最高殘留量[2]。由于價(jià)格低廉, 早期曾被廣泛用于人、畜多種傳染性疾病的治療, 我國(guó)上世紀(jì)80 年代開始在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中得到廣泛的應(yīng)用，氯霉素的使用會(huì)照成在水產(chǎn)品中和水體中的殘留，通過食物鏈最后對(duì)人類造成危害。

目前，針對(duì)水產(chǎn)品[3,4]、禽類[5,6]、蜂蜜[7,8]、牛奶[9,10]等對(duì)象的研究居多。水是生命之源，水之源有機(jī)污染物調(diào)查是環(huán)境保護(hù)的需要，因此急需建立一種經(jīng)濟(jì)、快速、靈敏、準(zhǔn)確的水中氯霉素分析方法，提高分析效率，盡可能獲取信息。氯霉素殘留常規(guī)分析方法主要有微生物方法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，微生物方法操作繁雜費(fèi)時(shí)，只能做定性檢測(cè)分析；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀是目前最常用的定量方法。為此，建立了高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定水中CAP殘留量的方法，并進(jìn)行了效果分析。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

試驗(yàn)使用樣品水取于貴陽市花溪水庫；水體如渾濁需取回需過濾后在試驗(yàn)使用。

高效液相色譜-質(zhì)譜儀(4000 Qtrap LC-/MS/MS，美國(guó)ABI公司)；氮吹儀(美國(guó) OI)。乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、正己烷(色譜純，美國(guó) 天地公司)，超純水(實(shí)驗(yàn)室自制)；C18固相萃取柱(1000 mg/6 mL,美國(guó)Waters公司)；氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó) sigma公司)；

1.2 樣品前處理

C18固相萃取小柱依次用5 mL二氯甲烷、甲醇、水活化平衡，將500 mL水樣以5 mL/min 的速度連續(xù)上樣到C18柱，氮?dú)獯蹈?，完成樣品在C18柱上的富集，不收集上述所有濾液，最后用3 mL乙酸乙酯洗脫柱子，收集濾液，在40 ℃水浴氮吹至盡干，甲醇定溶至5 mL，LC-/MS/MS聯(lián)用儀測(cè)定。

1.3 儀器條件

色譜條件 色譜柱：Kinebe C18色譜柱(100 mm×2.10 mm,2.6 μm)；流動(dòng)相：甲醇/水(6/4，V/V)；流速0.5 mL/min；進(jìn)樣量2.0 μL；柱溫(35 ℃)。

質(zhì)譜條件 電噴霧正離子化源(ESI+)；毛細(xì)管電壓(3.5 kv)；離子源溫度(100 ℃)；霧化溫度(300 ℃)；脫溶劑氣(500 L/h)；多反應(yīng)檢測(cè)模式(MRM)掃描；定性離子對(duì)(320.9>257.0)，去簇電壓(-55)碰撞能量(-16)；定量離子對(duì)(320.9>152.0)，去簇電壓(-55)，碰撞能量(-26)；MRM色譜圖見圖1。

圖1 氯霉素SRM色譜圖Fig.1 SRM Chromatogram of the chloramphenicol

2 結(jié)果與討論

2.1 水樣提取與凈化

采用C18反向固相萃取柱富集洗脫凈化樣品。洗脫液的極性強(qiáng)弱決定了樣品的凈化效果，目的是要使用最小量的洗脫液將氯霉素洗脫出來，而且還要防止雜質(zhì)的大量流出。實(shí)驗(yàn)分別采用正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈作為洗脫液凈化已添加氯霉素的樣品，考慮樣品添加回收率及凈化效果。在500 mL水樣中添加5 μg氯霉素，分別用10 mL正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷洗脫C18反向固相萃取柱，收集液每1 mL收集一次，用甲醇溶劑置換后定容為1 mL上機(jī)檢測(cè)，重復(fù)做3次，利用平均峰面積與流出體積作出洗脫液淋洗曲線圖2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明采用乙酸乙酯凈化效果最好，當(dāng)洗脫劑用量為3 mL時(shí)，樣品添加回收均在90 %以上，因此選用3 mL乙酸乙酯溶劑為方法的洗脫條件。

圖2 洗脫液淋洗曲線Fig.2 Eluent elution curves

2.2 質(zhì)譜離子對(duì)選擇

歐盟非強(qiáng)制執(zhí)行法案[11]規(guī)定質(zhì)譜檢測(cè)中，最少需要3個(gè)識(shí)別點(diǎn)才能確認(rèn)物質(zhì)的定量和定性，選擇1個(gè)母離子、2個(gè)子離子作為定性定量離子對(duì)，離子對(duì)參照GB/T 20756[12]標(biāo)準(zhǔn)。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，樣品和標(biāo)樣中氯霉素保留時(shí)間偏差在±2.5%之內(nèi)，且樣品和相當(dāng)濃度的標(biāo)樣中定性離子對(duì)的相對(duì)豐度比應(yīng)滿足歐盟非強(qiáng)制執(zhí)行法案要求，可定性樣品中有氯霉素檢測(cè)，研究采用標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法對(duì)樣品進(jìn)行定量分析。

2.3 干擾性實(shí)驗(yàn)

研究建立的方法主要應(yīng)用于多種水體中氯霉素的檢測(cè)，水體受污染的情況會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成一定的干擾和影響，特別是對(duì)液相 法、氣相法檢測(cè)影響較大。實(shí)驗(yàn)在水里添加少量柴油模仿工業(yè)廢水，在水里添加少量食用油、洗滌用品來模仿生活廢水。分別在這兩種水中加入1.0μg/L-1量的氯霉素，采用上述方法檢測(cè)水樣中氯霉素的含量分別為，模仿工業(yè)廢水中檢出0.82μg/L-1，模仿生活用水中檢出0.87μg/L-1，兩種模仿廢水中氯霉素檢出色譜圖見圖3和圖4，從結(jié)果可知，方法的抗干擾能力強(qiáng)，對(duì)受污染較嚴(yán)重的工業(yè)廢水、生活廢水中氯霉素檢測(cè)有很好的效果。

圖3 仿生工業(yè)廢水SRM色譜圖Fig.3 SRM Chromatogram of the bionic industrial wastewater

圖4 仿生生活廢水添加樣色譜圖Fig.4 SRM Chromatogram of the bionic life wastewater

2.4 方法線性與靈敏度

配置質(zhì)量濃度的為10、20、50、100、500 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液在實(shí)驗(yàn)條件下檢測(cè)，以質(zhì)量濃度與峰面積作線性回歸，結(jié)果表明，氯霉素在10-500 μg·L-1范圍內(nèi)顯線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9982。采用空白樣品添加目標(biāo)化合物的方法，依據(jù)特征離子質(zhì)量色譜峰性噪比RS/N=3計(jì)算檢出限，RS/N=10計(jì)算方法定量限，檢出限為6×10-3μg·L-1、定量限為2×10-2μg·L-1(見表1)。

2.5 方法回收率和精密度

量取500 mL水樣品，添加三個(gè)濃度水平(0.1 μg·L-1，0.5 μg·L-1，5.0 μg·L-1)的標(biāo)樣，每個(gè)濃度水平重復(fù)6次。利用上述方法進(jìn)行添加回收率試驗(yàn)，平均回收率(R)和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=6)結(jié)果見表1。結(jié)果表明，氯霉素平均回收率為86.1～92.1 %，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=6)為3.41～4.57%，方法能滿足樣品檢測(cè)需求，準(zhǔn)確可靠。

表1 方法檢出限、精密度和回收率

Table 1 Detection limits, precision tests and recoveries tests of the method

3 結(jié)論

研究建立的水中氯霉素殘留檢測(cè)方法，在實(shí)驗(yàn)條件下，樣品添加平均回收率為86.1～92.1 %，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=6)為3.41～4.57%；方法檢出限為6×10-3μg·L-1，定量限為2×10-2μg·L-1，說明方法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高等特點(diǎn)，適用于多種水體中氯霉素殘留檢測(cè)檢測(cè)分析。

[1] 魏林陽,徐金晶,吳紅軍.水產(chǎn)品中氯霉素殘留的氣質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定[J].光譜實(shí)驗(yàn)室,2007,24(2):201-205.

[2] Regulation ( EC)807P2001 Laying down a Community Procedure for the Establishment of Maximum Residue Limits ofVeterinary Medicinal Products in Foodstuffs of Animal Origin.

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[11] Commission Decision 2002/657/EC of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of result" (Official Journal L221, 17 August 2002, pp: 8-36).

[12] 龐國(guó)芳,林海丹,林峰等.GB/T 20756中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)書號(hào)[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2006.

Analysis of Chloramphenicol Determination in Water by High Performance Liquid Chromatography-quadrupole Mass Spectrometry

GUO Xiao-guan,LI Jun

(GuizhouProvincialDetectionCenterofQualityandSafetyofAgri-Product,Guiyang, 550004,China)

The purpose is to establish the determination methods of chloramphenicol residues in water. analysis of chloramphenicol determination in water by high performance liquid chromatography - mass spectrometry. The results showed that using this determination method, adding recovery rate was 86.1 - 92.1%, the relative standard deviation (RSD, n=6) ranged from 3.41% to 4.57%; the correlation coefficient was 0.9982; the detection limit was 6 × 10-3μ g ? L-1, and detection limit was 2 × 10-2μ g ? L-1. The method is rapid, accurate and highly sensitive, and is suitable for the determination of chloramphenicol residues in water.

water; chloramphenicol; high performance liquid chromatography - mass spectrometry

2016-09-15

郭曉關(guān)(1982-)，女，農(nóng)藝師，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品安全。

李俊，男，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)槭称钒踩皟x器分析。