吳建明，黃 杏，丘立杭，陳榮發(fā)，李楊瑞*，甘崇昆

（1.農(nóng)業(yè)部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530007；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所，廣西南寧530007；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心，廣西南寧530007；4.崇左市農(nóng)業(yè)局土肥站，廣西崇左532500）

SCoT標(biāo)記在甘蔗上的創(chuàng)新利用

吳建明1，2，3，黃 杏1，2，3，丘立杭1，2，3，陳榮發(fā)1，2，3，李楊瑞1，2，3*，甘崇昆4

（1.農(nóng)業(yè)部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530007；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所，廣西南寧530007；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心，廣西南寧530007；4.崇左市農(nóng)業(yè)局土肥站，廣西崇左532500）

SCoT是一種新型的分子標(biāo)記，2009年開(kāi)發(fā)以來(lái)已經(jīng)成功應(yīng)用于種質(zhì)資源親緣關(guān)系的鑒定、發(fā)育進(jìn)化分析、遺傳圖譜的構(gòu)建、基因差異表達(dá)分析等諸多研究領(lǐng)域。作者根據(jù)SCoT技術(shù)原理，首次將SCoT標(biāo)記應(yīng)用于甘蔗基因差異表達(dá)分析，結(jié)合自身研究結(jié)果對(duì)SCoT標(biāo)記在甘蔗上的研究應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，并就SCoT技術(shù)應(yīng)用于基因差異表達(dá)所面臨的挑戰(zhàn)和未來(lái)發(fā)展前景進(jìn)行了分析與討論，以期為科研工作者在甘蔗分子標(biāo)記的選擇上多一種參考依據(jù)。

甘蔗；分子標(biāo)記；SCoT；差異表達(dá)

SCoT（Start codon targeted）標(biāo)記具有單引物、操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低等特點(diǎn)，2009年，SCoT分子標(biāo)記自誕生之日起，就引起了生物科學(xué)家們極大的興趣[1]。作者根據(jù)SCoT技術(shù)原理，首次成功應(yīng)用SCoT標(biāo)記對(duì)甘蔗進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，并新開(kāi)發(fā)了34條引物[2]。目前，關(guān)于SCoT標(biāo)記的相關(guān)研究已經(jīng)有大量的報(bào)道，已成功應(yīng)用于包括果樹(shù)、經(jīng)濟(jì)作物、糧食作物、中草藥、花卉等多種植物，研究的內(nèi)容涉及種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、抗性、差異表達(dá)分析等多個(gè)領(lǐng)域。SCoT標(biāo)記廣泛應(yīng)用以來(lái)日趨成熟、完善。目前，已經(jīng)和一些最常用的分子標(biāo)記進(jìn)行比較分析，該技術(shù)具有穩(wěn)定可靠、操作簡(jiǎn)便、成本低、引物少等顯著優(yōu)點(diǎn)，在多方面研究領(lǐng)域取得了較大的進(jìn)展。SCoT標(biāo)記在遺傳育種、物種親緣關(guān)系鑒別、基因組作圖、基因定位、基因庫(kù)構(gòu)建和基因克隆等方面將突顯更重要作用。SCoT標(biāo)記在甘蔗的抗病、抗寒、抗旱、遺傳進(jìn)化等方面得到研究應(yīng)用。本文對(duì)SCoT標(biāo)記在甘蔗上研究應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，以期為科研工作者在選擇分子標(biāo)記技術(shù)研究方面多一種選擇提供參考。

1 SCoT標(biāo)記在甘蔗上反應(yīng)體系篩選研究

SCoT標(biāo)記目前開(kāi)發(fā)的引物可以在不同物種間通用，但不同物種之間模板、引物、dNTPs、Taq酶和Mg2+均對(duì)擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)生或多或少的影響。因此不同的反應(yīng)體系篩選研究能給研究同一物種的工作者提供重要參考依據(jù)，減少試驗(yàn)次數(shù)和節(jié)省試驗(yàn)費(fèi)用。蘇亞春等[3]（2012）采用L16（45）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，探討了模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物及Taq酶5個(gè)因素對(duì)甘蔗SCoT-PCR擴(kuò)增效果的影響，建立了甘蔗SCoT-PCR的優(yōu)化反應(yīng)體系，并對(duì)多態(tài)性引物進(jìn)行了篩選。本課題組對(duì)甘蔗cDNA-SCoT差異顯示PCR反應(yīng)的cDNA模板、SCoT引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶和Mg2+等因子進(jìn)行優(yōu)化，建立甘蔗cDNA-SCoT反應(yīng)體系[4]。徐剛紅等[5]以甘蔗黑穗病菌交配型菌株基因組DNA為模板，在單因素優(yōu)化試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L16（45）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)影響甘蔗黑穗病菌SCoT-PCR反應(yīng)體系的Mg2+、dNTPs、引物、rTaq DNA聚合酶和模板用量5個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，建立優(yōu)化的甘蔗黑穗病菌SCoT-PCR反應(yīng)體系。從前人的研究結(jié)果對(duì)比可看出，除dNTP和引物濃度比較一致外，其他因素差異還是比較大。這可能是由于不同研究者使用不一樣的模板（DNA和cDNA）或不同篩選方法或不同甘蔗品種所致。

2 SCoT標(biāo)記在甘蔗上檢測(cè)方法比較研究

聚丙烯酰胺凝膠電泳是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)，只有變性與非變性聚丙烯酰胺凝膠兩種形式，且分辨力??；瓊脂糖凝膠的凝膠孔徑大，適合大分子DNA電泳和需要快速簡(jiǎn)單分析的DNA電泳，電泳方式一般采用水平潛水電泳。優(yōu)點(diǎn)是快速簡(jiǎn)單，但分辨率不是很高，對(duì)于差異較小的DNA片段難以分辨?？筛鶕?jù)不同實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行選擇。陳香玲等[6]對(duì)cDNA-SCoT瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠兩種檢測(cè)方法進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明，聚丙烯酰胺凝膠電泳中，cDNA條帶呈黑褐色，背景為淺黃色，主帶和弱帶清晰易讀，瓊脂糖凝膠條帶亮白，背景為黑色，主帶明顯，副帶較模糊。陳榮發(fā)[7]也對(duì)cDNA-SCoT瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠兩種檢測(cè)方法進(jìn)行比較分析，其結(jié)果也基本一致。從兩者的研究結(jié)果可發(fā)現(xiàn)瓊脂糖凝膠模糊的帶，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)可以清晰分辨；且聚丙烯酰胺凝膠電泳可檢測(cè)到瓊脂糖凝膠肉眼看不到的帶。說(shuō)明聚丙烯酰胺凝膠更容易篩選差異表達(dá)片段，如果條件允許建議用聚丙烯酰胺凝膠篩選差異表達(dá)基因。

3 SCoT標(biāo)記在甘蔗上研究應(yīng)用現(xiàn)狀

3.1 SCoT在甘蔗遺傳多樣性的研究

2009年SCoT成功應(yīng)用于水稻之后，該標(biāo)記已經(jīng)廣泛應(yīng)用于花生、芒果、玉米、菠蘿等植物，近年該技術(shù)也在甘蔗中得到應(yīng)用研究。宋煥忠等[8]利用SCoT分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)采自廣西的50份斑茅無(wú)性系進(jìn)行遺傳多樣性分析，從46條引物中篩選出擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定、條帶清晰和有多態(tài)性的引物15條，擴(kuò)增位點(diǎn)336個(gè)，其中多態(tài)性位點(diǎn)284個(gè)，多態(tài)性為83.93%。陳平華等[9]利用SCoT分子標(biāo)記檢測(cè)甘蔗單花粉粒間多態(tài)性，結(jié)果顯示，單花粉粒間的基因位點(diǎn)的變異程度隨使用的SCoT引物不同而存在差異。有些引物擴(kuò)增具有高度變異性、有些引物擴(kuò)增的片段比較大、有些引物擴(kuò)增的基因位點(diǎn)保守性強(qiáng)。說(shuō)明SCoT分子標(biāo)記技術(shù)完全適用于甘蔗遺傳多樣性的分析，只是不同引物擴(kuò)增結(jié)果差異較大，需要對(duì)引物進(jìn)行篩選。

3.2 SCoT標(biāo)記應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)分析

3.2.1 cDNA-SCoT應(yīng)用于霉素誘導(dǎo)甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)的差異表達(dá) 根據(jù)SCoT技術(shù)原理，作者首次成功應(yīng)用SCoT標(biāo)記進(jìn)行赤霉素誘導(dǎo)甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)的差異表達(dá)分析。結(jié)果表明，通過(guò)46條引物篩選了約700個(gè)cDNA片段，獲得差異片段30個(gè)。有18個(gè)基因片段受赤霉素上調(diào)而12個(gè)基因片段下調(diào)；其中16個(gè)TDFs序列和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已錄入的基因具有較高的相似性，按照其功能可分為6類(lèi)，即能量與代謝相關(guān)基因（占總數(shù)的20.0%）、未知功能蛋白（占總數(shù)的20.0%）、未知基因（占總數(shù)的46.7%）、信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因（占總數(shù)的6.7%）、轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因（占總數(shù)的3.3%）和細(xì)胞凋亡基因（占總數(shù)的3.3%）[10]。隨后，作者首次利用cDNA-AFLP、cDNA-SRAP和cDNA-SCoT三種技術(shù)結(jié)合分析赤霉素誘導(dǎo)甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)的差異表達(dá)，結(jié)果表明，不同技術(shù)擴(kuò)增結(jié)果各有特點(diǎn)，但不同技術(shù)也能擴(kuò)增出相同基因差異片段，如GID1、1，3，4-trisphosphate 5/6-kinase、S-adenosylmethionine、hypothetical protein、Ribosomal gene等[11]。說(shuō)明cDNA-AFLP、cDNA-SRAP和cDNA-SCoT技術(shù)均是研究基因差異表達(dá)的重要工具，但各技術(shù)在原理、方法、結(jié)果等方面均有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，研究者可以根據(jù)不同的研究方向和目的選擇自己需要的方法或不同方法結(jié)合應(yīng)用。

3.2.2 cDNA-SCoT應(yīng)用抗逆性研究 植物可以利用自身的功能來(lái)適應(yīng)外界環(huán)境的脅迫。在逆境條件下，表現(xiàn)出明顯的時(shí)空特異性、組織特異性和條件誘導(dǎo)性的基因表達(dá)；在生理生化上做出反應(yīng)，表現(xiàn)出的抗寒、抗凍、抗鹽、抗病蟲(chóng)害等性狀。根據(jù)這些特性，通過(guò)對(duì)不同細(xì)胞在不同狀態(tài)及不同分化階段的基因表達(dá)差異，可以發(fā)現(xiàn)與抗性相關(guān)的基因。陳香玲等[12]選用了桂糖28號(hào)（強(qiáng)抗寒性）和新臺(tái)糖22號(hào)（弱抗寒性）兩個(gè)甘蔗品種，分別構(gòu)建了低溫處理與對(duì)照的RNA混合池，利用cDNA-SCoT法進(jìn)行了差異顯示研究。結(jié)果，102條SCoT引物擴(kuò)增出600多條帶，長(zhǎng)度在100～1800bp之間。兩個(gè)甘蔗品種在低溫下有部分相同的基因表達(dá)，5個(gè)TDF分別與脫水素、半胱氨酸型肽酶、多胺氧化酶、C4磷酸羧化酶和過(guò)氧化氫酶基因具有很高的同源性，只在抗寒品種中穩(wěn)定出現(xiàn)的兩個(gè)TDF功能未知，可能與甘蔗的抗寒基因表達(dá)相關(guān)。陳榮發(fā)[7]采用水培系統(tǒng)培養(yǎng)甘蔗幼苗，并于人工氣候室在4℃下進(jìn)行低溫處理，以25℃培養(yǎng)為對(duì)照，分別在處理后1 d、3 d、5 d和7 d取樣，構(gòu)建處理與對(duì)照的RNA混合池，利用cDNA-SCoT法進(jìn)行差異顯示研究。結(jié)果表明，15條引物擴(kuò)增出了43條特異條帶，長(zhǎng)度在100～750 bp之間，獲得22條穩(wěn)定的EST序列，5個(gè)與已登記的基因具有較高的同源性，其他17個(gè)特異片段的序列未能找到同源信息。兩者使用同一技術(shù)分析同一甘蔗品種，獲得的差異基因片段既有相同的，也有差異的片段。這些研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了該技術(shù)的有效性。獲得不同差異片段可能是由于分析的部位和處理的時(shí)期不一樣導(dǎo)致。

植物的抗旱性是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及多個(gè)生理因素的作用，也受到多個(gè)基因共同作用導(dǎo)致。目前常用研究基因差異表達(dá)的方法如mRNA差異顯示技術(shù)、SSH、SAGE、cDNA-AFLP、cDNA-SRAP等均已經(jīng)應(yīng)用于不同植物的抗旱性差異表達(dá)研究。cDNA-SCoT是近年發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)，吳凱朝[13]使用cDNA-SCoT差異顯示方法分離得到135個(gè)TDFs，可以分為14類(lèi)：新陳代謝、能量代謝、運(yùn)輸途徑、通信及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞循環(huán)及DNA加工、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、蛋白質(zhì)合成、蛋白質(zhì)加工、結(jié)合功能蛋白、轉(zhuǎn)座子、毒性及質(zhì)粒蛋白、細(xì)胞分生物合成、防御和未分類(lèi)蛋白。雖然得到了很多的差異片段，但是要證實(shí)哪些基因與抗旱性相關(guān)還需要進(jìn)一步進(jìn)行功能驗(yàn)證。

陳明輝等[14]構(gòu)建宿根矮化病侵染處理與對(duì)照的RNA混合池，利用cDNA-SCoT法進(jìn)行差異顯示研究。結(jié)果表明，80條SCoT引物擴(kuò)增出500多條帶，長(zhǎng)度在100～1800 bp之間。獲得22條高質(zhì)量的EST序列，主要涉及能量代謝、防衛(wèi)反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)類(lèi)代謝等方面。進(jìn)一步基因功能分析顯示，油菜素內(nèi)酯合成蛋白、NBS-LRR類(lèi)抗性蛋白、茉莉酸誘導(dǎo)蛋白、α-微管蛋白、ABA脅迫成熟蛋白、富含脯氨酸蛋白、翻譯起始因子eif-2b α亞族等可能參與了甘蔗宿根矮化病病原菌互作的過(guò)程。從這些研究結(jié)果可以看出，SCoT技術(shù)首次成功應(yīng)用于甘蔗差異表達(dá)分析后，已在甘蔗的節(jié)間伸長(zhǎng)機(jī)理、抗寒、抗旱、抗病等方面得到進(jìn)一步研究應(yīng)用。目前，該技術(shù)除了甘蔗以外已在芒果[15]、西瓜[16-17]、大豆[18]、花生[19-20]、柑橘[21]、鐵皮石斛[22]等植物上得到廣泛應(yīng)用，且得到了較好的進(jìn)展。

4 展望

隨著分子生物學(xué)不斷發(fā)展，越來(lái)越多的技術(shù)應(yīng)用于基因差異表達(dá)分析，如mRNA差異顯示、SSH、SAGE、cDNA-AFLP、cDNA-SRAP、cDNA-SCoT等技術(shù)。這些技術(shù)廣泛應(yīng)用于如不同發(fā)育時(shí)期、生理生態(tài)或病理過(guò)程中的基因表達(dá)分析，且已經(jīng)分離了影響這些過(guò)程的相關(guān)基因。這些基因的獲得為分子育種奠定了基礎(chǔ)。雖然cDNA-SCoT作為一種新差異表達(dá)技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于多種植物分析，但它如今卻碰上了一個(gè)強(qiáng)勁對(duì)手——RNA-Seq，因該技術(shù)具有定量更精確、可重復(fù)性更高、檢測(cè)范圍更廣、分析更可靠等特點(diǎn)。此外，RNA-Seq還能發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本、SNP、剪接變體，并提供等位基因特異的基因表達(dá)。但RNA-Seq技術(shù)也存在一些新問(wèn)題，一是數(shù)據(jù)量的龐大如何更好地詮釋?zhuān)慷切枰^多的樣品起始量，這就使得來(lái)源極為有限的生物樣品受到限制[23]；三是RNA-Seq技術(shù)費(fèi)用比較高，對(duì)一些小課題及基礎(chǔ)條件較差的地方比較難普及。雖然這些技術(shù)都已經(jīng)很成熟且應(yīng)用于各方面的研究，但不同技術(shù)在原理、方法、結(jié)果等方面均有各自的特點(diǎn)，就選擇某一種技術(shù)而言，要根據(jù)具體情況如基因組大小、RNA提取量多少、實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?shí)驗(yàn)條件、課題經(jīng)費(fèi)等條件而決定。當(dāng)然如果條件允許，應(yīng)利用不同技術(shù)結(jié)合應(yīng)用將獲得更全面的基因表達(dá)信息，也可以對(duì)不同差異表達(dá)技術(shù)擴(kuò)增結(jié)果加以相互印證，這在作者的研究結(jié)果已經(jīng)得到證實(shí)[9]。

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Innovative Application of SCoT Markers on Sugarcane

WU Jian-ming1,2,3,HUANG Xing1,2,3,QIU Li-hang1,2,3,CHEN Rong-fa1,2,3,LIYang-Rui1,2,3*,GAN Chong-kun4
(1.Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement,Ministry of Agriculture,China,Nanning 530007;2. Sugarcane Research Institute,Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530007;3.Sugarcane Research Center,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530007;4.Soil and Fertilizer Station,Chongzuo Agricultural Bureau,Chongzuo 532500)

According to the principle of SCoT,for the first time,SCoT markers was used to analyze the gene differential expression in sugarcane,combined own study,application status of SCoT markers on sugarcane were reviewed,and the challenges and development prospects of SCoT in differentially expressed genes was discussed, in order to provide more references for researchers to choose molecular markers on sugarcane.

sugarcane;molecular marker;SCoT;differential expression

S566.103；Q78

B

1007－2624（2017）01－0051－03

10.13570/j.cnki.scc.2017.01.017

2016-10-08

國(guó)家自然科學(xué)基金（31360312），廣西自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2015GXNSFDA139011），國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃863計(jì)劃（2013AA102604），廣西自然科學(xué)基金（2014GXNSFBA118087），國(guó)際科技合作計(jì)劃（2013DFA31600），廣西八桂學(xué)者專(zhuān)項(xiàng)基金（2013），廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院發(fā)展基金項(xiàng)目（2014YP03，2014YD02，2015YM13，2015YT03）。

吳建明（1978-），男，廣西寧明縣人，博士，副研究員，主要從事甘蔗分子生物學(xué)研究。E-mail：wujianming2004@126.com

李楊瑞（1957-），男，博士、廣西壯族自治區(qū)終身教授、博士生導(dǎo)師，廣西“甘蔗種質(zhì)創(chuàng)新利用”崗位八桂學(xué)者，主要從事甘蔗栽培、育種和生物技術(shù)研究。E-mail：liyr@gxaas.net