任振波，候毅銳，鄭 偉，張 雷，虞 微，黃 琳

(解放軍第208醫(yī)院，吉林 長春130062)

表達CD20的正常B細胞對CD20特異cTCR+T細胞抗白血病活性的影響

任振波*，候毅銳，鄭 偉，張 雷，虞 微，黃 琳

(解放軍第208醫(yī)院，吉林 長春130062)

急性淋巴細胞白血病(ALL)為預后極差的一種類型急性白血病。既往治療以化療為主，生存期極短。造血干細胞移植(HSCT)為唯一能治愈本病的方法，但由于缺乏配型相合供體及資金等，HSCT也只能挽回少部分ALL患者的生命。近20年來國外研究的用嵌合抗原受體T細胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)[1]治療ALL已有成功的報道，且沒有移植物抗宿主病副作用，具有廣泛的應用前景，有取代HSCT成為治療B-ALL、CLL、NHL的一種新的方法的趨勢。

經過20多年的發(fā)展，CAR-T的設計已經越來越完善，但仍存在許多問題。如on-target效應(靶效應)(腫瘤溶解綜合征、細胞因子風暴、巨細胞綜合征、神經毒性、B細胞缺如及低丙種球蛋白血癥)；off-target(脫靶效應)等。輸注細胞前是否需要進行預處理及用什么方法進行預處理能否解決on-target效應還未確定。國內開展的中心很少。據(jù)Anupama Ahuja[2]報道鼠B細胞減少可以抑制系統(tǒng)性免疫反應，并研制了表達CD20的B細胞轉基因鼠，應用大劑量鼠抗人CD20單抗導致B細胞明顯減少，取得了明顯的臨床療效。我們設想在輸注CAR-T細胞前給予抗CD20抗體進行預處理減少B淋巴細胞，觀察CAR-T細胞的活性及抗腫瘤效果。

1 材料與方法

1.1 動物、細胞系

Thy1.2+野生型(WT)鼠，人CD20(hCD20)轉基因鼠、Leu16+T細胞、CL4細胞TCR轉基因鼠和Thy1.1+和Thy1.2+Bbalb/c鼠購自美國The Jackson Laboratory。hCD20特異cTCR+T細胞；MB185- hCD20/Thy1.1-ffLuc-Neo腫瘤細胞，Thy1.1+Leu16+CD8+T細胞，Leu16+CD8+T細胞，Thy1.1+Leu16+T細胞。

1.2 試劑和儀器

熒光偶聯(lián)抗體：mCD4，mCD8，hCD20，Thy1.1，CD3，CD28購自BD Bioscience。

抗hCD20由ATCC(American type culture collection)。雜交瘤HB-9645用FRCRC(Fred Hutchinson cancer Reserch center)生物設備進行。流式細胞儀使用BD Bioscience的FACS(熒光激活細胞分離儀)；抗mCD20和抗hCD20單抗購自美國eBioscience。ELISA試劑盒為美國eBioscience公司產品。CD20- CAR-T細胞購自美國ATCC。

1.3 鼠骨髓和脾細胞的制備

用CO2將鼠窒息后摘取鼠淋巴結和脾臟，用40 μm濾網過濾產生單細胞懸液；骨髓(BM)骨髓通過RPMI1640沖洗股骨骨髓腔取得；血、淋巴結、BM和脾細胞用低滲液體溶解后用流式細胞儀分析。

1.4 過繼轉導及B細胞去除

白血病細胞在指數(shù)生長期時用PBS洗滌后置Hank’s平衡鹽液中通過尾靜脈注入鼠中。T細胞在刺激后的第4-5天通過尾靜脈注入。靜脈注射抗hCD20單抗200μg后測定CD20特異T細胞數(shù)量。

1.5 體外T細胞分析

用流式細胞儀通過測定DDAO+的百分數(shù)將TB細胞結合的CFSE+DDAO+的百分數(shù)分開以測定T細胞的百分數(shù)。

1.6 生物發(fā)光成像

給鼠腹膜內注射熒光素鉀，然后用X線攝像，用生物成像軟件分析發(fā)光成像資料，單位為光子/s/cm2/sr，并可對確定部位進行測定。

1.7 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 16．0軟件進行統(tǒng)計學分析，兩樣本均數(shù)的比較用t檢驗，多個樣本均數(shù)的比較用方差分析。生存分析用Kaplan-Meie log-rank檢測。以P<0．05為差異有顯著性。

1.8 方法

1.8.1 將107Thy1.1+Leu16+T細胞通過靜脈注入Thy1.2+WT鼠和hCD20鼠，7天后取鼠的脾細胞，用流式細胞儀分析Thy1.1+CD4和CD8供者細胞及鼠自身B細胞。

1.8.2 給WT鼠注射107Thy1.1+Leu16+CD8+T細胞，于24小時后注射2×107WT或hCD20脾細胞做對比。注射3天后檢測血中(供者)Thy1.1+CD8+細胞。注射1周后取鼠脾細胞再測一次Thy1.1+CD8+細胞。

1.8.3 給WT鼠和hCD20鼠靜脈注射2×107MB185- hCD20/Thy1.1-ffLuc-Neo白血病細胞。3天后注射Leu16+cTCR(治療)及空載體轉導的Thy1.1+CD8+T細胞，然后進行生物發(fā)光成像。

1.8.4 注射T細胞2天后抽取WT鼠和hCD20鼠的外周血檢測Thy1.1+CD8+T細胞。實驗重復2次，每組用鼠3-4只)。

1.8.5 注射T細胞2天后，對照白血病生物發(fā)光信號和外周血供者CD8+T細胞百分數(shù)。實驗重復2次，每只WT鼠分別注射0.1、0.3、107 個Leu16+T細胞。

2 結果

2.1 將107Thy1.1+Leu16+效應T細胞注入WT鼠和hCD20鼠中1周后，Thy1.1+供者細胞在WT鼠脾中CD4細胞占3.5%；CD8細胞占4.8%，但在hCD20鼠中分別僅占0.02%(P<0.01)和0.008%(P<0.01)，提示在hCD20鼠中抗原特異性T細胞減少。

2.2 鼠自身B細胞的數(shù)量在hCD20鼠中和WT鼠的脾中是相似的(P<0.05)，說明T細胞減少限制了轉入細胞的抗B細胞活性。

2.3 給WT鼠注射Leu16+T細胞，于24 h后注射2×107WT或hCD20脾細胞做對比。注射3天后，在注入hCD20脾細胞的WT鼠的血中與注入WT脾細胞的WT鼠相比，Thy1.1+供者細胞明顯減少(1.32%:4.1%CD8+Thy1.1+；P<0.01)。

2.4 注射1周后，Thy1.1+供者細胞也減少(0.4%:2.4%CD8+Thy1.1+；P<0.01)。2.5 先給野生型(WT)鼠及hCD20鼠注射2×107白血病細胞，3天后再靜脈注射107Leu16+CD8+T細胞，在WT鼠內3天白血病生物發(fā)光信號減弱，但在hCD20鼠中的白血病的生長極小受到影響(抑制)。

2.6 在Thy1.1+供者細胞中，在注入后2天的hCD20宿主中的血CD8T細胞僅占1.3%，而在WT宿主中為12.2%(P<0.001)。

2.7 用滴定法測量進入具有白血病的WT宿主中的Leu16+T細胞表明0.1-0.3×107Leu16+T細胞在WT宿主中與在hCD20宿主中的107Leu16+T細胞的效果一致。這些結果表明CD20特異T細胞在與正常B細胞反應時減少，而在與白血病B細胞反應時不減少。

3 討論

嵌合型抗原受體T細胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)是從腫瘤患者的血液或腫瘤組織中提取的T淋巴細胞，通過基因工程技術，采用特異性CAR轉染后，進行體外培養(yǎng)增值，進而產生一定數(shù)量的、對某種腫瘤細胞抗原有特異識別功能的CAR-T細胞，再將CAR-T細胞回輸?shù)侥[瘤患者體內，從而誘發(fā)抗腫瘤細胞作用，建立預防腫瘤復發(fā)的持久免疫力[3]。CAR-T通過抗原抗體結合的原理特異性識別腫瘤細胞表面的抗原，因此無主要組織相容性復合體(MHC)限制，還可以避免因腫瘤細胞MHC下調或丟失導致的免疫逃逸。而且通過在嵌合基因設計時增加共刺激分子信號，可增強CAR-T細胞的腫瘤殺傷活性。經過20多年的發(fā)展，CAR-T的設計已經越來越完善，手段也越來越多。

經過26年的研究，CAR-T技術已經發(fā)展出三代。第一代CAR-T在細胞內只有一個T細胞CD3ξ受體的信號區(qū)；第二代在第一代基礎上增加了一個共刺激分子信號：第三代則在第一代基礎上增加了2個共刺激分子信號。第一代CAR-T在體內存在時間太短且臨床效果不佳。第三代CAR-T已被用于套細胞淋巴瘤及濾泡性非霍奇金淋巴瘤臨床試驗，但并未顯示出比第二代更優(yōu)越的臨床結果。

目前在血液腫瘤臨床應用上較為成功的主要是第二代CAR-T技術，轉染的共刺激分子主要是CD28或CD137(4-1BB)。

注入的效應T細胞的持續(xù)存在已被證實為腫瘤過繼T細胞免疫治療效果的決定因素。臨床實驗調查過繼輸入cTCR+T細胞證明該T細胞僅短暫存在于有大量能產生抗原的病人體內[4,5]。與這些臨床研究一致的是我們的結果顯示正常B細胞表達CD20能降低CD20特異cTCR+T細胞的存活和功能，且提示抗體介導的B細胞減少可能是提高CD20特異T細胞治療效果的有效方法。已證實正常B細胞可以使提呈給初始T細胞的抗原能力下降或數(shù)量減少[6,7]。相比之下，記憶性T細胞在應答B(yǎng)細胞表達的抗原時可以擴增[7]。CD20特異cTCR+T細胞在與正常B細胞應答時減少，表明B細胞表達的抗原的致耐受性潛能沒有被之前激活的T細胞消除。雖然T細胞減少說明CD20特異cTCR+T細胞抗白血病功能在接觸到表達CD20的正常B細胞之后有限性，在T細胞減少之前也許有其他機制限制T細胞功能。靶抗原在正常組織的高表達可以干擾T細胞的抗腫瘤功能，其過程是通過促進cTCR下調、T細胞脫敏以及通過增加全部抗原表達細胞減少體內效應器對靶目標的比例。因此，正常組織的抗原可能損害抗原特異T細胞的抗腫瘤功能，即使T細胞依然存活。

體外實驗表明，正常人B細胞上高表達CD20抗原可以從CD20特異cTCR+T細胞表面下調cTCR分子[8]。正常TCR的下調可以降低效應器功能及敏感性[9]，表明cTCR下調可能限制對靶目標的識別。持續(xù)暴露于B細胞上的CD20分子也許能損害CD20特異cTCR+T細胞的存活。臨床經驗表明在有大量抗原負荷的病人血中cTCR+T細胞減少[4，5]。全淋巴細胞減少證明可以增加T細胞活性[10，11]，但在過繼轉入B細胞抗原特異的T細胞之前選擇性B淋巴細胞減少的效果還未評估。雖然幾個B細胞相關分子以TCRs為靶目標，包括CD19[12，13]，CD20[14，15]，CD22[16，17]，沒有研究論及在模型機制中的體內cTCR+T細胞的功能，在此模型當中正常細胞和腫瘤細胞表達相同的靶分子。在此研究中，我們以免疫功能正常鼠中正常細胞和白血病細胞上的CD20為靶目標，正常B細胞上CD20的表達嚴重損害cTCR+CD8+T細胞介導的白血病免疫治療，導致T細胞減少。在B細胞缺乏CD20的鼠中和用單抗的CD20B細胞減少的鼠中cTCR+T細胞轉移至骨髓且除掉了白血病細胞。結果顯示白血病模型鼠在T細胞輸入之前B細胞減少可以提高B細胞抗原特異性cTCR+T細胞在體內的功能和存活。CD19抗原的變異，以及具有干細胞樣特征的B-ALL起始細胞不表達CD19是應用CD20的原因。

綜上所述，應用抗CD20單抗導致B細胞減少明顯提高T細胞在白血病體內的活性及抗白血病效果，可以在人體內采用此預處理方法進行CD20特異cTCR+T細胞治療急性B淋巴細胞白血病或B淋巴細胞淋巴瘤的臨床實驗。

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此項目受吉林省科技廳項目資助(項目編號20160101165JC)

1007-4287(2017)02-0326-03

2016-05-26)

*通訊作者