姬小利，王敏，李玲玲，周君梅

人誘導多能干細胞向視網(wǎng)膜色素上皮細胞分化及其應用于臨床治療的研究進展

姬小利，王敏，李玲玲，周君梅

視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細胞是位于視網(wǎng)膜最外層的單層細胞，呈六角形，胞內(nèi)富含黑色素。其功能主要包括：①吞噬感光細胞外節(jié)段；②代謝視紫紅質(zhì)；③參與構成血-視網(wǎng)膜屏障；④合成黑色素等。RPE細胞的功能喪失會引起多種視網(wǎng)膜疾病，如年齡相關黃斑變性、Stargardt 病等[1]。RPE 細胞已經(jīng)到達終末分化階段，損傷后無法再生，因此細胞移植成為治療其病變的理想方法。具有多向分化潛能的干細胞可作為 RPE 細胞的種子來源。研究者們曾利用胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）[2]、成體干細胞如骨髓間充質(zhì)干細胞[3]，定向誘導分化為 RPE 細胞進行移植治療。但由于 ESCs 存在倫理學和免疫排斥等問題[4]、成體干細胞存在增殖能力和分化潛能有限等問題[5]，阻礙了其在臨床上的應用。誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）的出現(xiàn)為 RPE 細胞的移植治療帶來了新的希望。

ESCs 的研究是 iPSCs 研究的重要前期基礎。ESCs 來源于早期囊胚的內(nèi)細胞團，其在體外合適的培養(yǎng)環(huán)境下可自我更新、定向分化。ESCs 的獲取需破壞早期胚胎，故其來源受限，且分化后的細胞用于異體移植治療時會發(fā)生免疫排斥。因此，研究者通過向成體細胞中導入和 ESCs 多能性密切相關的基因，以起始的成體細胞為種子細胞，通過誘導重編程建立了具有 ESCs 特性的自體來源的 iPSCs。iPSCs最初于 2006年由日本科學家 Takahashi 和 Yamanaka[6]通過逆轉錄病毒將 4 種轉錄因子（Oct3/4、Sox2、Klf4 和c-Myc）導入小鼠的成纖維細胞使其重編程而獲得。2007年，Takahashi 等[7]和 Yu 等[8]分別將人的皮膚成纖維細胞重編程為 iPSCs，為其臨床應用提供了可能。近年來，iPSCs重編程技術已經(jīng)從最初的 DNA 途徑[6]、RNA 途徑[9]拓展到蛋白[10]以及目前的小分子化合物途徑[11]。隨著定向誘導分化方案的不斷優(yōu)化，其誘導效率及安全性也進一步得到了提高。人 iPSCs 是將患者自身來源的體細胞重編程為多能干細胞，避開了人 ESCs 建系時需要破壞早期胚胎的倫理問題；其在體外可被誘導分化為特定類型的細胞如神經(jīng)細胞[12]、心肌細胞[13]、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞及色素上皮細胞[14-15]等用于自體的細胞移植治療，解決了免疫排斥和細胞來源受限的問題。由于其具有重大意義，iPSCs 建系僅 6年即獲得 2012年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。近十年來，iPSCs 誘導分化及細胞移植治療，一直是研究者們關注的焦點。

本文擬就人 iPSCs 向 RPE 細胞分化、利用人 iPSCs來源的 RPE 細胞進行臨床移植治療以及治療中所面臨的問題等進行綜述。

1 人 iPSCs 向 RPE 細胞的分化

1.1 自發(fā)分化法

自發(fā)分化法即不添加任何外源因子，使 iPSCs 自發(fā)分化，這是研究者最先嘗試的一種誘導分化方法。即通過將iPSCs 培養(yǎng)液中維持其干細胞特性所需的堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）撤去，后續(xù)通過不斷的培養(yǎng)、分選，即可獲得含有色素的小克隆，與人ESCs 來源的 RPE 細胞及流產(chǎn)胎兒來源 RPE 細胞進行比較，iPSCs 自發(fā)分化得到的 RPE 細胞在形態(tài)、特異性標志物及功能方面均與前兩者十分相似[16-18]。自發(fā)分化不需要添加外源因子、操作簡單，是相對簡單的一種分化方法。但由于分化效率低下（＜ 1%）、細胞分化不同步，獲得的 RPE 細胞需要長時間分選和純化后才能用于后續(xù)研究。因此，研究者嘗試了更高效率的共培養(yǎng)，如根據(jù)其發(fā)育特點循序添加誘導因子等定向誘導分化方法。

1.2 共培養(yǎng)誘導分化法

2002年，Kawasaki 等[19]在誘導靈長類動物 ESCs 向外胚層細胞分化的過程中，發(fā)現(xiàn) ESCs 與基質(zhì)細胞 PA6共培養(yǎng) 3 周后可觀察到 RPE 細胞的出現(xiàn)。隨后，Haruta等[20]和 Hirano 等[21]通過同樣的共培養(yǎng)方式，均獲得了ESCs 來源的 RPE 細胞。在此研究基礎上，Okamoto 和Takahashi[22]將食蟹猴來源的 iPSCs 與 PA6 細胞共培養(yǎng)，得到的 PRE 細胞不僅具有典型的六邊形形態(tài)，并且表達其特異性標志物如 RPE65、CRALBP 等。共培養(yǎng)誘導分化體系中，用于共培養(yǎng)的各種細胞通過分泌因子釋放到培養(yǎng)液中，提高了 iPSCs 向 RPE 細胞的分化效率，但是具體發(fā)揮作用的因子及其機制目前并不清楚。雖然共培養(yǎng)可以在一定程度上提高 iPSCs 向 RPE 細胞分化的效率，但是其潛在的異源細胞污染為臨床應用帶來了隱患。因此，該誘導方法更多用于研究 RPE 細胞分化的機制，但在分化后的移植治療研究中并不常用。

1.3 外源因子誘導分化法

根據(jù)特定類型細胞的體內(nèi)發(fā)育特點，定向誘導分化法可通過循序添加決定細胞命運的外源因子來縮短誘導時間、提高誘導效率、促進同步分化。目前人 iPSCs 向 RPE 細胞定向誘導分化的外源因子主要包括一些轉錄因子、重組蛋白和小分子化合物等。

1.3.1 細胞因子或重組蛋白誘導法 基于在前期研究中發(fā)現(xiàn)的 Dkk-1、Lefty 和 Noggin 等與外胚層分化的相關性，這些外源性的細胞因子或重組蛋白被應用于多能干細胞向RPE 細胞的定向誘導分化。2008年，Osakada 等[23]使用Dkk-1 聯(lián)合 Lefty 將人的 ESCs 誘導分化為 RPE 細胞。在此研究基礎之上，2009年，該課題組使用同樣的方案誘導人來源的 iPSCs 向 RPE 細胞分化，第 35 天觀察到約有 30% 的克隆表達 PRE 細胞特異性標記物，第 40 天約有 39% 的克隆有色素形成，隨后又觀察到 RPE 細胞典型形態(tài)的出現(xiàn)。該研究不僅得到了 iPSCs 來源的 RPE 細胞，而且其誘導效率及時間與 ESCs 向 RPE 細胞的誘導十分接近。2011年，Meyer 等[24]在誘導人 iPSCs 向 RPE 細胞分化的過程中，首先加入 Noggin 和 Dkk-1，在第 20 天，觀察到約有 20% 的視泡樣結構的細胞團出現(xiàn)，將這些細胞團挑選出來繼續(xù)分化培養(yǎng)，并在誘導體系中加入 TGF-β 超家族成員 Activin A，培養(yǎng) 40～60 d 后發(fā)現(xiàn)細胞色素加深、RPE 細胞特異性基因表達水平明顯增高。2012年，Zahabi等[25]聯(lián)合使用 bFGF、Noggin、RA 以及 Shh，誘導 4 周后可以看到分化的細胞團，35 d后可以觀察到鵝卵石樣色素細胞出現(xiàn)。2016年，Lidgerwood 等[26]通過使用雞尾酒誘導法（同時加入 IGF1、Dkk-1、Noggin、bFGF、B27 和 N2）誘導 20 d，初步觀察到色素克隆的出現(xiàn)，第 40～60 天獲得了大量的色素克隆，除了形態(tài)學、功能學等方面的鑒定，該團隊通過 RNA-seq 對第 60 天獲得的 RPE 細胞進行基因表達分析，結果表明人 iPSCs 來源的 RPE 細胞與成人來源的 RPE 細胞在基因表達上具有高度的相似性。在誘導的適當時機循序加入細胞因子或者重組蛋白，縮短了誘導時間、提高了誘導效率，但這些外源性細胞因子或重組蛋白大多是動物源性或者細菌源性，存在著免疫排斥及跨物種污染等風險，且不同批次之間的差異性也可能導致誘導效果的巨大差異，因而也是亟待解決的問題。化學小分子也因其穩(wěn)定性好、批次差異小以及不存在跨物種間污染等優(yōu)勢而被用于定向誘導分化研究。

1.3.2 小分子化合物誘導法 小分子化合物以其獨特的優(yōu)勢在干細胞研究中的應用越來越廣泛，其選擇也是基于前期研究中發(fā)現(xiàn)的小分子的作用通路和 RPE 細胞的體內(nèi)發(fā)育特征。Osakada 等[27]在其前期用重組蛋白（Dkk-1、Lefty）誘導 ESCs 分化為 RPE 細胞的研究基礎上，利用兩種分別可以阻斷 Wnt、Nodal 信號通路的小分子化合物抑制劑CKI-7 和 SB-431542，誘導人 iPSCs 向 RPE 細胞分化，40 d 后觀察到約有 29.1% 的色素克隆出現(xiàn)，第 60 天，約有 29% 的細胞表現(xiàn)出了 RPE 細胞典型的六邊形形態(tài)。Westenskow 等[28]在誘導人 iPSCs 向 RPE 細胞分化的過程中，對比 Nicotinamide + Activin A 及 Nicotinamide +IDE-1 兩種誘導方法，發(fā)現(xiàn)用小分子抑制劑 IDE-1 替換Activin A，不僅同樣可以在 5～7 周的時間獲得 RPE 細胞，而且大大降低了費用。此外，Maruotti 等[29]利用高通量技術篩選出兩種可以促進人 iPSCs 向 RPE 細胞分化的小分子化合物 Chetomin（CTM）和 Nicotinamide（NIC），用 CTM + NIC 誘導 2 周后，轉移到 RPE 細胞基礎培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng) 1～2 周，即可觀察到色素克隆出現(xiàn)，5 周后，色素克隆占滿了整個培養(yǎng)基。與 Osakada 等[27]的小分子化合物結合重組蛋白的誘導方案相比，Maruotti 等[29]用兩種化學小分子 CTM 和 NIC，將人 iPSCs 向 RPE 細胞的誘導分化時間縮短到 35 d，其誘導效率也提高到了 45% ～60%。綜上，從最初的與重組蛋白聯(lián)合應用以期增加誘導效率、縮短誘導時間，到目前單獨應用小分子化合物進行誘導分化，小分子化合物憑借其無免疫排斥和跨物種間污染等風險、化學性質(zhì)穩(wěn)定和批次差異性小等優(yōu)點，在 iPSCs 向RPE 細胞的誘導分化研究中，得到研究者們越來越多的青睞。

2 人 iPSCs 來源 RPE 細胞的移植治療

眼憑借其組織結構小、修復需要的細胞量少、可直視下手術、定位準確、免疫豁免區(qū)有利于移植細胞存活等優(yōu)點，在細胞移植治療領域存在較大優(yōu)勢[30]。2004年，Haruta等[20]將猴 ESCs 來源的 RPE 細胞移植到 4 周齡皇家外科學院大鼠（royal college of surgeon rat，RCS）的視網(wǎng)膜下區(qū)，移植的 RPE 細胞通過提高感光細胞的存活率而改善大鼠的視功能。隨后，研究者們利用人 ESCs 來源的 RPE 細胞在動物模型上進行移植治療，結果表明，移植 ESCs 來源的 RPE 細胞不僅可以在一定程度上改善其視功能，且安全性和移植效率均可得到保證[31-32]。2011年，美國食品藥品管理監(jiān)督局批準了使用人 ESCs 來源的 RPE 細胞治療年齡相關性黃斑變性（NCT01344993）和 Stargardt 病（NCT01345006）的 I/II 期臨床試驗[33]，通過對接受移植治療的患者進行為期 22 個月的評估觀察，接受移植的18 例患者中，10 例患者的視力得到明顯改善，7 例視力不變，1 例視力下降。此外，在整個過程中未發(fā)現(xiàn)免疫排斥、腫瘤發(fā)生等安全性問題。在 ESCs 來源的 RPE 細胞移植的研究基礎上，研究者們開始嘗試用人 iPSCs 來源的 RPE細胞進行移植治療，旨在避免使用 ESCs 進行相關實驗所引起的免疫排斥及醫(yī)學倫理等問題。Carr 等[34]將人 iPSCs來源的 RPE 細胞移植到出生 22～23 d RCS 大鼠的視網(wǎng)膜下區(qū)，移植的 RPE 細胞可通過不斷吞噬脫落的感光細胞膜盤來幫助維持其代謝，從而改善大鼠視功能。Li 等[35]在其前期分別利用胎鼠來源 RPE 細胞[36]以及人 ESCs 來源的 RPE 細胞[37]進行移植治療的基礎上，用人 iPSCs 來源的 RPE 細胞移植到新生 2 d 視網(wǎng)膜變性的模型鼠身上，在其存活的 6 個月內(nèi)，視網(wǎng)膜電流圖顯示其視功能有明顯的改善。為了確保人 iPSCs 來源的 RPE 細胞在臨床應用中的安全性，Kanemura 等[38]和 Kamao 等[39]首先將人 iPSCs來源的 RPE 細胞移植到大鼠和猴視網(wǎng)膜下區(qū)，均未觀察到免疫排斥或腫瘤發(fā)生等安全性問題。在此基礎上，該團隊于2014年得到日本政府批準后實施了世界上第一例自體iPSCs 來源的 RPE 細胞的臨床試驗[40]：研究者首先將一位患有年齡相關性黃斑變性患者的體細胞重編程為 iPSCs，再將其定向誘導分化為 RPE 細胞，然后將其用于自身的移植治療。自體來源的 iPSCs 雖然避免了免疫排斥等問題，但其制備時間及費用、突變位點的糾正等問題不容忽視。2017年 4月，日本實施了世界上首例異體來源 iPSCs 來源RPE 細胞的移植治療[41]：研究者為一名患有老年黃斑變性的 60 歲男性患者移植了異體來源的 RPE 細胞，移植過程順利，移植效果目前正在追蹤觀察中，該研究預計共實施5 例異體 iPSCs 移植。日本目前正在積極創(chuàng)辦一個“用于可再生醫(yī)學的 iPSCs 干細胞庫”，以此來滿足大多數(shù)日本人口的需求匹配。由不同捐獻者的 iPSCs 所組成的干細胞庫將有望使干細胞移植成本更低且更方便。將來，異體iPSCs 移植有望像同型輸血一樣方便。

此外，通過檢索美國臨床試驗注冊網(wǎng)站（https://www.clinicaltrials.gov），其中涉及到 iPSCs 向 RPE 細胞分化及應用的臨床試驗項目共有 4 項（NCT02162953、NCT02464956、NCT01432847 和 NCT02193724），由此可見，雖然 iPSCs 在臨床應用中的安全性問題有待進一步考察，但是其憑借自體來源，避免了免疫排斥及醫(yī)學倫理等優(yōu)勢，在臨床應用中具有更加廣闊的前景。

3 人 iPSCs 來源的 RPE 細胞用于臨床治療所面臨的問題

雖然人 iPSCs 及其向 RPE 細胞分化的研究已經(jīng)取得突破性進展，但目前亟待解決的問題還有很多，主要包括：①如何進一步提高移植細胞安全性；②如何解決移植細胞的流失問題；③對于遺傳所致的視網(wǎng)膜變性患者，如何規(guī)避移植 iPSCs 來源的 RPE 細胞的遺傳缺陷等。針對這些問題，研究者們也在不斷提出新的解決方案：針對移植細胞的安全性，通過優(yōu)化重編程方案[6-11]（重編程水平從病毒轉染、蛋白質(zhì)誘導到目前的小分子化合物誘導）、純化誘導后細胞[23-24]（流式細胞分選純化、手動挑選色素克隆），可以降低 iPSCs 重編程過程及其本身定向分化不完全所致的潛在致瘤性、大大提高移植細胞的安全性；針對移植細胞流失的問題，細胞膜片[39]及支架材料[42]的應用可提高移植細胞在視網(wǎng)膜下區(qū)的定植和存活；針對遺傳所致的視網(wǎng)膜變性患者面臨的移植細胞的遺傳缺陷，利用 CRISPR-Cas9 等新一代基因編輯技術，對患者的病變基因位點予以糾正，其用于自體移植治療的細胞不再攜帶有致病基因位點，可避免移植自體來源 RPE 細胞的再致病。目前 CRISPR-Cas9 技術在臨床上已經(jīng)開始應用，2016年 10月，四川大學腫瘤學家盧鈾團隊，首次利用 CRISPR-Cas9 技術對免疫細胞進行基因編輯，然后將其用于肺癌患者的自體治療[43]。北京大學研究團隊也正在籌劃將該技術應用到膀胱、前列腺以及腎臟等方面的惡性腫瘤治療上[44]。雖然目前 CRISPR-Cas9 用于臨床疾病的治療尚在起步階段，我們相信，隨著技術的成熟，將 CRISPR-Cas9 技術聯(lián)合 iPSCs 應用于遺傳因素所致的RPE 患者的治療具有重要前景。此外，異體 iPSCs 的移植也為解決該問題開辟了一條更方便、快捷的新途徑。

綜上所述，iPSCs 技術的建立被認為是干細胞研究領域的重大突破，不僅因為其在基礎研究領域的重要性，更因其在許多難治病和罕見病的細胞移植治療方面正逐漸從基礎走向臨床。目前人 iPSCs 向 RPE 細胞的誘導分化方案已經(jīng)較為成熟，相信人 iPSCs 來源的 RPE 細胞的移植可作為一種新的治療方法應用到臨床中，以造福視網(wǎng)膜色素變性患者。

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[41]Cyranoski D.Japanese man is first to receive 'reprogrammed' stem cells from another person.Nature, (2017-03-28) [2017-05-08].http://www.nature.com/news/japanese-man-is-first-to-receive-reprogra mmed-stem-cells-from-another-person-1.21730.

[42]Thomson HA, Treharne AJ, Walker P, et al.Optimisation of polymer scaffolds for retinal pigment epithelium (RPE) cell transplantation.Br J Ophthalmol, 2011, 95(4):563-568.

[43]Cyranoski D.CRISPR gene-editing tested in a person for the first time.Nature, 2016, 539(7630):479.

[44]Nature announces west China hospital's first CRISPR latest process:human trials have already begun.y-lp.cn, (2016-11-16) [2017-05-08].https://www.pharmacodia.com/web/newinfo/information_8a2d983758 6ca3b60158703eee3b009c.html.(in Chinese)

Nature公布華西醫(yī)院全球首例CRISPR最新進程: 人體試驗已經(jīng)開始.E藥臉譜網(wǎng), (2016-11-16) [2017-05-08].https://www.pharmacodia.com/web/newinfo/information_8a2d9837586ca3b60158 703eee3b009c.html.

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.04.011

國家自然科學基金（81270742、81370700、81470911）；上海交通大學醫(yī)工交叉基金（YG2016MS32）；上海市衛(wèi)計委重點課題（201540389）

200040 上海交通大學附屬兒童醫(yī)院中心實驗室（姬小利、王敏）；200040 上海市兒童醫(yī)院中心實驗室（李玲玲、周君梅）

周君梅，Email：junmei_zhou@139.com

2017-05-08