張正鵬

（甘肅省武威市涼州區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，武威733000）

甜葉菊物理誘變育種的發(fā)展

張正鵬

（甘肅省武威市涼州區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，武威733000）

介紹了誘變育種的原理、優(yōu)點(diǎn)、誘變劑及其技術(shù)，綜述了甜葉菊物理誘變育種（γ照射、重輻射、離子束、紫外線）研究的發(fā)展。為快速培養(yǎng)高品質(zhì)甜葉菊新種質(zhì)提供參考。

甜葉菊；物理誘變育種；γ照射；誘變劑；甜菊糖；甜菊糖苷；萊鮑迪苷

全世界己有幾十個(gè)國家利用誘變技術(shù)誘變植物，成功選育了幾千個(gè)品種。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織和國際原子能機(jī)構(gòu)（FAO/IAEA），在突變品種數(shù)據(jù)庫（MVD）至少收集3233個(gè)突變品種。約77%的突變作物品種是由種子繁殖，以種子繁殖而不是其他營養(yǎng)繁殖可很好提供突變誘導(dǎo)原始原料[1]。60%的作物突變品種是在亞洲生產(chǎn)的，而中國人貢獻(xiàn)超過25%。在MVD，谷物在所有突變的作物品種中幾乎占一半（48%），其次是花類（20%）、豆類（14%）、蔬菜、飼料、食用油植物和樹木和其他（3%）。這些品種，創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟(jì)和社會效益。甜葉菊作為一種天然的非熱量的、安全的高甜度甜味劑，其發(fā)展顯示出巨大的潛力，甜菊糖特別是萊鮑迪苷A（Reb A）口感好沒有任何副作用。甜菊糖還具有抗微生物、抗真菌、防病毒、抗炎、抗高血壓、抗高血糖、抗腫瘤、抗腹瀉、利尿和調(diào)節(jié)免疫功能等治療和保健功能[2]，應(yīng)用和需求廣泛，而且在不斷增長和發(fā)展。因此需要采用多種方法和途徑創(chuàng)造、培育產(chǎn)質(zhì)量高的、多樣性的甜葉菊品種滿足生產(chǎn)與商業(yè)發(fā)展需要。如果群體出現(xiàn)較少的變異性狀，有些性狀只能通過突變育種而改善。與傳統(tǒng)的育種程序相比，誘變育種是在短時(shí)間擴(kuò)大變異性、分離可取的經(jīng)濟(jì)性狀的潛在的方法，對改良甜菊糖產(chǎn)量與質(zhì)量有很大價(jià)值與可用性[3]。國內(nèi)外研究人員使用各種誘變方法與技術(shù)進(jìn)行了甜葉菊新種質(zhì)的培養(yǎng)與甜菊糖的改良[2-3]。為此將該方面的研究予以綜述，總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，為將來更快速創(chuàng)新更優(yōu)良的甜葉菊新品種進(jìn)而滿足人們?nèi)找嬖鲩L的需求做貢獻(xiàn)。

1 誘變育種的原理、技術(shù)及物理誘變特點(diǎn)

1.1 誘變育種的原理

誘變或突變是指個(gè)體在環(huán)境條件下發(fā)生遺傳變異的過程。自然界中發(fā)現(xiàn)的變異是植物進(jìn)化過程中發(fā)生的自然突變的積累，除了自然突變，通過物理和化學(xué)誘變劑誘變創(chuàng)造突變體已廣泛應(yīng)用不同作物的科學(xué)領(lǐng)域中。它是進(jìn)化中的主要因素，因?yàn)椴煌来g發(fā)生的變化可發(fā)展成新的個(gè)體、種和屬[4-5]。突變可以發(fā)生在兩個(gè)方面：基因堿基和/或染色體的數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化。突變體被定義為具有永久性遺傳變異的活生物，可用分子方法或通過表型工具區(qū)分[2]?？偟膩碚f，誘變劑處理損害細(xì)胞核DNA，隨機(jī)誘變的新突變在DNA修復(fù)機(jī)制的過程可遺傳[1]。這些改變也在細(xì)胞質(zhì)發(fā)生，導(dǎo)致染色體或基因組突變使植物育種者挑選有利的突變體[5]。然而，誘變育種主要用物理和化學(xué)方法產(chǎn)生誘變，而其他突變的類型通常在功能基因組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)[6]。

1.2 誘變育種的優(yōu)點(diǎn)及成效

由于自然突變率較低，植物育種家尋求新的育種技術(shù)，誘發(fā)突變的目的是增加突變頻率以便選擇合適的變異[2，5]。因此，突變育種是在進(jìn)化過程中為獲得所需的性狀或特征提供一種替代的方式。誘變育種較傳統(tǒng)育種方法和轉(zhuǎn)基因（GMO）更有優(yōu)勢[5]。誘導(dǎo)突變的主要優(yōu)點(diǎn)是：可形成多性狀突變體，不同于轉(zhuǎn)基因的方式只一個(gè)單獨(dú)性狀；突變誘導(dǎo)可以幫助建立突變系的范圍，確定特定性狀的基因，為分子功能基因組學(xué)研究建立分子基因數(shù)據(jù)庫支撐，對于未來植物品種的發(fā)展增加生物信息學(xué)[2]。

1.3 物理誘變技術(shù)的特點(diǎn)

用誘變技術(shù)有助于創(chuàng)造選定的理想性狀的突變體。誘變劑分為可分為物理和化學(xué)誘變劑[1]。為了擴(kuò)大遺傳多樣性，通過植物種子，營養(yǎng)體如莖段、嫩枝芽和塊莖經(jīng)誘變劑處理誘導(dǎo)突變提高作物種子和無性繁殖的生產(chǎn)力[5-6]。據(jù)報(bào)道，突變誘導(dǎo)對無性繁殖作物更有效[2]。物理誘變劑是用來直接開發(fā)突變品種最常見的誘發(fā)突變技術(shù)，用于誘導(dǎo)突變的輻射類型分為紫外線（UV）輻射和電離輻射[1]。波長250～290nm的紫外線只限于處理無細(xì)胞的外來組織（即發(fā)育中的花粉粒和花粉管的生殖細(xì)胞），因?yàn)樗鼈冇羞m度的滲透能力和輕度的生理損傷而無大妨礙。電離輻射（X射線、γ射線、快中子和熱中子，α和β粒子、重輻射、離子束等）對植物組織有更好的穿透能力，可誘導(dǎo)更多的化學(xué)變化；電離輻射各有自己的特性和變化[1，5]。物理誘變劑影響植物誘變率的兩個(gè)關(guān)鍵因素是能量和穿透力。但其他參數(shù)，如，源的可用性和可訪問性，誘變劑的適宜性，處理和后處理的安全管理，和處理費(fèi)用，都可影響一個(gè)特定誘變劑的性能[7]。γ照射由于其廣泛的可用性和多功能性其使用設(shè)施是優(yōu)選的。在植物誘變，利用外部的放射性同位素鈷-60（60Co）、銫-137（137Cs）和小范圍的钚-239（239Pu）的蛻變發(fā)射γ射線。一般來說，所有的γ輻照器是被隔離防護(hù)，只有訓(xùn)練有素、認(rèn)證的人員可以管理輻照源，有特別的預(yù)防措施以避免意外發(fā)生[1]。γ細(xì)胞輻照器，在γ射線源有一種放射性同位素，通常用于急性照射（即在短時(shí)間內(nèi)高劑量照射植物）；與此相反，慢性照射（即長時(shí)間低劑量照射植物）可在γ輻照室、γ溫室或γ場進(jìn)行[7]。γ射線是短波長電離輻射但穿透力高，使原子或分子相互作用產(chǎn)生自由基，這些自由基能破壞或改變植物的細(xì)胞成分[8-9]。電離過程分為三大機(jī)制：光電效應(yīng)、康普頓散射和γ射線穿過植物組織產(chǎn)生電子偶[7]。根據(jù)照射水平，它們影響植物的種子萌發(fā)、形態(tài)、解剖、生化和生理，γ射線引起組織水平的形態(tài)學(xué)顯著變化和細(xì)胞水平的生化反應(yīng)[1]。

2 物理誘變技術(shù)在甜葉菊育種中的應(yīng)用

2.1 γ射線在甜葉菊中的應(yīng)用

所有物理誘變劑中，最常用的是γ射線和X射線[1]。據(jù)FAO/IAEA報(bào)告，在過去的40年中，應(yīng)用γ射線誘導(dǎo)突變已經(jīng)廣泛化，而X射線的使用卻顯著下降；γ射線是最有能量的電磁輻射，從10 keV至幾百keV都很有能量[8]。通過γ射線照射植物開發(fā)大量有用的突變體成為可能，并在無性繁殖植物表現(xiàn)出越來越大的潛力，特別是甜葉菊[2]。已進(jìn)行了γ輻照處理甜葉菊植物誘變育種的研究。

S Pande等研究了γ射線對S.rebaudiana體外培養(yǎng)的影響。所使用的劑量分別為5、10、15、20、25和30 kR。將種子用γ射線輻照進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，愈傷組織增殖和體細(xì)胞胚胎發(fā)生在MS+2.5 mg/L 2,4-D培養(yǎng)基中。高劑量γ射線照射的外植體壞死，體細(xì)胞胚胎發(fā)生率隨γ輻射劑量的增加而降低，其發(fā)生顯著受高劑量的γ射線影響。植株產(chǎn)生的種子經(jīng)γ射線5～10 kR（可能為Gy）劑量照射影響愈傷組織誘導(dǎo)生長；經(jīng)γ射線高劑量如25 kR和30 kR（可能為Gy）照射的種子延遲愈傷組織誘導(dǎo)生長。表明低劑量的γ射線輻射甜葉菊生產(chǎn)變異性是有效的[10]。γ輻射有助于開發(fā)甜葉菊糖含量高的新品種。Shahid等對不同的繁殖技術(shù)（體外和體內(nèi)）和γ輻射對甜菊糖苷（STV）和Reb A含量的影響進(jìn)行了研究，種子和愈傷組織經(jīng)不同劑量的γ射線照射，其致死劑量（LD50）為8.75 Gy和生長指數(shù)GR50為13.33 Gy。2.5 Gy劑量的γ照射處理種子的發(fā)芽率（20%）最高（對照為23.31%）。種子和愈傷組織培養(yǎng)獲得小苗。甜菊種子輻射后體外芽培養(yǎng)獲得的STV含量較高（2.808±0.070mg/g DW），比其他體內(nèi)和γ照射的組織高[11]。

確定誘變劑的有效使用劑量能夠以最小的副作用誘導(dǎo)理想的突變體，是確保突變誘導(dǎo)成功的關(guān)鍵[2]。高劑量不可避免地增加死亡率和不育性，而較低的劑量可使植物在處理后恢復(fù)。因此，為了獲得誘變劑有效的劑量，在進(jìn)行材料大量照射前確定致死劑量LD50是至關(guān)重要的[12]。LD50是指發(fā)生突變頻率最高，幸存的一半死亡、另一半存活的劑量。LD50的值根據(jù)不同的植物屬、種而不同[2]。例如，甜葉菊的急性照射LD50是29 Gy，慢性照射LD50是45 Gy[10]，木薯（Manihot esculenta L.）的LD50是27.5 Gy，麻瘋樹（Jatropha curcas L.）為600 Gy，豌豆（Pisum sativum L.）為200 Gy[2]。Norazlina等成功地進(jìn)行了γ射線處理甜葉菊繁殖和離體誘變研究。結(jié)果，莖尖在添加1 mg/L KTMS培養(yǎng)基培養(yǎng)3周后顯示最高的叢生芽誘導(dǎo)和增殖（5.50±1.95a）。敏感性試驗(yàn)鑒定甜葉菊芽LD50和選擇體外誘變的有效劑量。在0、10、20、30、40、60和80 Gy劑量進(jìn)行急性和慢性γ射線照射。甜葉菊的急性照射LD50是29 Gy，慢性照射LD50是45 Gy。篩選的有效劑量為10、20、30和40 Gy。低劑量和高劑量γ射線照射的芽存活率差異顯著。所有非輻照芽和在10 Gy劑量照射的芽均達(dá)到100%的存活率，且形成的新芽數(shù)量最高，分別為5.00±1.98和5.06±1.98。隨著輻射劑量的增加，莖尖存活率下降。60和80 Gy劑量，芽尖0%存活，全部死亡。隨著γ劑量的增加，甜菊幼苗成活率顯著下降。急性照射的有效劑量為10、20和30 Gy，這3個(gè)選定的劑量被用于甜菊芽的體外誘變[13]。

γ輻照對甜葉菊愈傷發(fā)生和活性物質(zhì)生產(chǎn)有影響，γ輻照顯著改變愈傷組織顏色和形態(tài)，STV和生物量生產(chǎn)不同劑量顯示沒有大的變化；愈傷組織培養(yǎng)物15 Gy劑量略有提高酚醛樹脂和類黃酮含量的生產(chǎn)，20 Gy劑量增強(qiáng)DPPH為基礎(chǔ)的抗氧化活性[14]。處理葉子突變育種在改善甜葉菊性狀上起到很重要的作用。葉片愈傷組織接種于MS+BA 1 mg/L+NAA+IBA+GA3 0.3 mg/L培養(yǎng)基。30d后，生長旺盛的愈傷組織轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基，并經(jīng)γ輻照（5、10、15和20 Gy）處理。結(jié)果，觀察到γ射線劑量越大越抑制愈傷組織的增殖，增殖率88.61%～79.16%（對照為95.83%）。同樣，10、15和20 Gy劑量誘導(dǎo)的愈傷組織呈易碎、顆粒和松軟狀，對照則緊湊。此外，5、10和20 Gy劑量顯著降低愈傷組織鮮生物量（FCB），而15 Gy劑量FCB（1660mg）比對照（1520mg）增加。色譜數(shù)據(jù)顯示15 Gy劑量STV含量（0.251mg/g DCB）比對照組（0.232 mg/g DW）略有提高，而其他的劑量STV含量下降。在20 Gy的愈傷組織培養(yǎng)物中觀察到較高的抗氧化活性（88.73%）。在15 Gy處理愈傷組織培養(yǎng)觀察到較高的總酚含量（TPC；43.90 mg/g DCB）和總黃酮濃度（TFC；6.87 mg/g DCB）。結(jié)論：S.rebaudiana經(jīng)γ射線輻照并未出現(xiàn)愈傷組織培養(yǎng)的生物量和生物活性化合物生產(chǎn)的主要變化[14]。Awad也報(bào)道了甜葉菊在γ輻射劑量20 Gy和30 Gy總碳水化合物增加，劑量10 Gy和20 Gy總蛋白含量增加，核酸RNA增加而總DNA下降[15]。杜尚廣等采用5、15、30、60、90、120和150 Gy劑量的60Co-γ射線對甜葉菊莖段進(jìn)行處理，得出60Co-γ射線誘變的LD50為24 Gy，處理后的甜葉菊形態(tài)差異顯著，隨著輻射劑量的增強(qiáng)，甜葉菊死亡率在增加，5～30Gy劑量死亡率為1.7%～20.5%，60～150 Gy劑量死亡率為92.7%～100%；5～30 Gy輻射劑量，可溶性多糖含量比對照高15.29%～76.77%[16]。

體細(xì)胞無性系變異被認(rèn)為是重要的變異來源，已證明在番茄、馬鈴薯、小麥、水稻、高粱、玉米、大蒜等作物上是可行的。Ali等將微繁殖6周齡的甜葉菊組培苗莖尖和節(jié)段分別以0、750、1500和2250 R劑量的γ射線輻射處理，獲得適宜外植體后，在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，愈傷組織轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基中添加0、0.2%、0.4%和0.6%的NaCl。結(jié)果，莖尖外植體愈傷組織誘導(dǎo)率（82.5%）高于節(jié)段外植體（75.6%）；莖尖外植體獲得的再生根（75.0%）也高于節(jié)段外植體（62.5%）。有些植株相對耐鹽脅迫。隨著γ射線劑量的增加，愈傷組織誘導(dǎo)和根形成逐漸減少。γ射線0 R劑量（對照組）生根數(shù)最高，所有鹽度濃度平均值為4.7。隨著鹽度濃度的增加，生根數(shù)減少。關(guān)于γ射線和鹽度共同作用的影響，比鹽度或γ射線的單獨(dú)作用，對生根數(shù)量影響更大。γ射線劑量為0、750、1500和2250 R（0、7.5、15和22.5 Gy）外植體愈傷平均數(shù)分別為7.9、2.8、2.5和2.25。0.6%鹽度最低數(shù)量γ射線劑量15和22.5 Gy時(shí)生根數(shù)為0.5[17]。

2.2 重輻射、離子束和紫外線的應(yīng)用

以甜葉菊鮮葉片為實(shí)驗(yàn)材料，利用近紅外光譜儀，進(jìn)行甜葉菊重離子輻照的誘變效應(yīng)研究，結(jié)果表明，重離子輻射可提高甜葉菊種子發(fā)芽率，但對細(xì)胞具有嚴(yán)重?fù)p傷作用[18]。

為發(fā)掘創(chuàng)建甜葉菊抗、耐寒性突變種質(zhì)，以重離子輻照劑量60、80 Gy處理甜葉菊品種守田2號干種子，結(jié)果兩種處理甜葉菊種子成活率分別為42%和33%，獲得的兩株甜葉菊抗寒品系，其含糖量較高，STV含量與Reb A含量比對照品種分別高30%和22%，新品系2007-800-5平均干葉產(chǎn)量為222kg/667m2，比對照守田2號增產(chǎn)13%。總苷（STV+Reb A）含量13.3%，RA占總苷的75.5%，比對照高8.6個(gè)百分點(diǎn)，屬于高糖苷、特極品，已審定命名為安甜菊四號[19]。

離子注入誘變技術(shù)是通過加速氣體離子轟擊生物材料，使生物大分子及細(xì)胞發(fā)生損傷，這種損傷不易修復(fù)，突變體能較快穩(wěn)定，且在存活率較高的情況下可得到較高的突變率；用于輻照的離子參數(shù)多樣，能拓寬突變譜[19]。閔笛等用不同劑量低能N+離子注入甜葉菊種子，結(jié)果，經(jīng)輻照后植株高度、葉片、葉面積和糖苷含量都得到提高；低劑量的N+離子束能促進(jìn)甜葉菊發(fā)芽率，高劑量則抑制其發(fā)芽率；隨著輻照劑量的增高，植株的株高和甜菊糖含量等呈先下降后升高的趨勢[20]。蘇婷婷研究了4個(gè)不同劑量的N+離子束輻照甜葉菊種子，結(jié)果，隨著劑量增加發(fā)芽率增加，超過600×2.5×103N+/cm2劑量，發(fā)芽率下降，（200～600）×2.5×103N+/cm2三個(gè)劑量10d的發(fā)芽率為57.33%～68.33%（對照56.33%），其中400×2.5×103N+/cm2劑量對發(fā)芽勢和發(fā)芽率改善最顯著。經(jīng)N+離子束輻照后，M1代植株中篩選出高糖苷突變體9株[21]。

楊敬敏等評論了60Co-γ輻射和離子束注入對甜葉菊5個(gè)雜交組合后代突變的影響，結(jié)果，兩種處理對甜葉菊后代植株有明顯的誘變效應(yīng)，經(jīng)60Co-γ和離子束注入的甜葉菊雜交后代種子發(fā)芽率均顯著低于對照，經(jīng)60Co-γ注入的雜交后代幼苗成活率顯著高于對照，但經(jīng)離子束注入的幼苗成活率顯著低于對照；除葉寬外，經(jīng)離子束注入的雜交后代植株的其他7個(gè)生長指標(biāo)均顯著高于60Co-γ注入的植株。它們表現(xiàn)出較低的高度，一致的葉形狀，較少的分支，節(jié)間長度短，抗倒伏、耐寒[22]。為改善甜菊糖品質(zhì)，以藤倉赤霉Gibberella fujikuroi為出發(fā)菌株，采用紫外（UV）和5-溴尿嘧啶（5-BU）及EMS復(fù)合誘變的方法，確定UV誘變的最佳劑量為12W、25cm，輻照120s，EMS化學(xué)誘變的最佳劑量為0.10mol/L、處理時(shí)間8min。篩選得到26株初選菌株，其中MS05和MS17菌株發(fā)酵效果最好且可穩(wěn)定遺傳，發(fā)酵后Reb A含量比對照分別顯著增加22.98%和18.55%。兩菌株發(fā)酵甜葉菊葉片提取液的Reb A含量比發(fā)酵前分別提高48.25%和39.69%[23-24]。

3 展望

盡管上述物理誘變技術(shù)在甜葉菊上進(jìn)行了一定的應(yīng)用研究，但甜葉菊的研究范圍仍然有限，所獲得的結(jié)果還遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)和商業(yè)的需求，仍需要進(jìn)一步開發(fā)甜菊糖產(chǎn)質(zhì)量更高的甜葉菊新品種（系）。通過對甜菊的研究，總結(jié)并探索γ射線與其它物理或化學(xué)等方法創(chuàng)新整合技術(shù)，培養(yǎng)優(yōu)良的理想性狀的甜葉菊新種質(zhì)是可能的，將為甜葉菊和甜菊糖生產(chǎn)第一大生產(chǎn)國的中國的發(fā)展注入新的力量。

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Development of Physical Mutation Breeding of Stevia

ZHANG Zheng-peng
(Agricultural Technology Service Center of Liangzhou District,Wuwei 733000,Gansu)

The principle,advantages,mutagen and mutagenesis technology were introduced.The development of physical mutagen(gamma irradiation,physical mutagenesis of heavy ion beam radiation,ultraviolet)breeding research in Stevia was summarized to provide references for the rapid creation of high quality Stevia germplasms.

Stevia;physical mutation breeding;gamma irradiation;mutagen;steviol glycoside;stevioside; rebaudioside A

S566.9

B

1007－2624（2017）05－0061－04

10.13570/j.cnki.scc.2017.05.019

2017-04-04

張正鵬（1984-），甘肅武威人，碩士研究生，農(nóng)藝師，主要從事農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)與推廣工作。