王菁

阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型及中藥組分治療研究進(jìn)展

王菁

阿爾茨海默病；轉(zhuǎn)基因；動(dòng)物模型；中藥組分

阿爾茨海默?。╝lzheimer's disease，AD）是一種以進(jìn)行性記憶減退、認(rèn)知功能障礙為特征的神經(jīng)退行性疾病，已成為老年人群中繼心血管病、腫瘤和腦卒中之后的第四大死亡因素[1]。目前全世界AD患者高達(dá)3600萬，至2030年將有6570萬患者，全球用于AD的醫(yī)療費(fèi)用超過6040億美元[2]。AD臨床表現(xiàn)記憶力和思維能力減退，發(fā)展為語言表達(dá)困難、喪失生活自理能力，最終死于感染等嚴(yán)重并發(fā)癥。AD主要病理特征為細(xì)胞外以β-淀粉樣蛋白（betaamyloid，Aβ）沉積為核心形成的老年斑、細(xì)胞內(nèi)以過度磷酸化的tau蛋白為核心形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofib-rillary tangles，NFT）以及特定腦區(qū)中樞神經(jīng)元大量丟失[3]。

1 以Aβ為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型

現(xiàn)階段制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的思路主要以體現(xiàn)AD特征為導(dǎo)向，模擬AD病理特征制備轉(zhuǎn)基因小鼠成為研究AD的重要手段。以β-淀粉樣蛋白沉積為核心形成的老年斑是AD主要病理特征之一，淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）在非淀粉樣蛋白水解途徑中，α-分泌酶催化APP不產(chǎn)生Aβ沉積，其催化裂解后的APPs片段和羧基端片段中均不含完整的Aβ，故該途徑不產(chǎn)生老年斑的沉積；在淀粉樣蛋白水解途徑中，β-分泌酶和γ-分泌酶分別催化APP產(chǎn)生Aβ沉積，β-分泌酶在Aβ氨基端的位置切斷APP，生成一段APPs和包含Aβ的羧基段片段，后者又被γ-分泌酶催化剪切，最終釋放出Aβ[4]。腦內(nèi)Aβ斑塊沉積導(dǎo)致神經(jīng)元變性壞死和周圍膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化，最終引起局部炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙，最終發(fā)展成AD[5]。

大多數(shù)研究者主要使用家族性AD中APP和PSEN（早老蛋白）突變基因來構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型。PSEN突變基因與人類早期AD發(fā)展密切相關(guān)，但是僅表達(dá)人類PSEN1（早老蛋白1）或PSEN2（早老蛋白2）突變基因的轉(zhuǎn)基因小鼠并未出現(xiàn)Aβ斑塊沉積[6]。Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠是轉(zhuǎn)人類APP695基因小鼠，到5月齡時(shí)能檢測(cè)到Aβ沉積，隨著Aβ沉積逐漸增加，學(xué)習(xí)記憶能力損傷。與單轉(zhuǎn)基因小鼠相比，表達(dá)人類PSEN1和APP突變基因的雙轉(zhuǎn)基因小鼠能更快形成Aβ斑塊沉積，同時(shí)還出現(xiàn)神經(jīng)炎癥反應(yīng)和認(rèn)知功能減退[7]。其中β-分泌酶在內(nèi)穩(wěn)態(tài)神經(jīng)功能和催化APP產(chǎn)生Aβ中具有重要作用。相比僅APP轉(zhuǎn)基因小鼠，表達(dá)BACE1和APP的雙轉(zhuǎn)基因小鼠Aβ形成速度更快和更多Aβ沉積[8]。

2 作用于β-淀粉樣蛋白的藥物

針對(duì)Aβ在AD發(fā)病機(jī)制中的重要地位，如何減少Aβ的產(chǎn)生成為治療AD的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。與Aβ密切相關(guān)的分泌酶是至今AD藥物開發(fā)的關(guān)鍵靶點(diǎn)，一方面α-分泌酶催化可溶性βAPP產(chǎn)生，從而抑制Aβ的生成；另一方面通過抑制β-或γ-分泌酶則能減少Aβ沉積[4]。

2.1 β-分泌酶抑制劑β-分泌酶是催化Aβ產(chǎn)生的初始和控速步驟，在Aβ生成過程中起決定性作用。抑制β-分泌酶的活性能從上游控制Aβ生成，從而起到防治AD的作用[3]。β-分泌酶抑制劑作為AD治療藥物，需要滿足以下條件：具有較高的抑制活性，較強(qiáng)的特異性，良好的生物利用度，最關(guān)鍵的是能夠穿越血腦屏障，這也是研發(fā)中所面臨的最大挑戰(zhàn)[9]。

目前作用于β-分泌酶的中藥有效成分研究取得長足進(jìn)步，其中研究最常見的人參皂苷Rg1能夠通過激活PPARγ活性，抑制β-分泌酶的轉(zhuǎn)錄翻譯，從而下調(diào)β-分泌酶mRNA和蛋白的表達(dá)水平，最終減少Aβ生成[10]。李維組[11]發(fā)現(xiàn)黃芪總苷通過抑制APP表達(dá)，降低β-分泌酶分泌以及促進(jìn)α-分泌酶釋放，進(jìn)而抑制Aβ生成，最終改善AD小鼠學(xué)習(xí)記憶功能。研究表明[12]，三七皂苷R1能夠通過雌激素受體通路來抑制β-分泌酶的表達(dá)，從而降低AD患者腦內(nèi)神經(jīng)元中Aβ含量。體外試驗(yàn)[13]發(fā)現(xiàn)，淫羊藿黃酮和淫羊藿苷能顯著性抑制細(xì)胞中β-分泌酶活性，減少APP基因轉(zhuǎn)染和Aβ生成。Zhu等[14]研究發(fā)現(xiàn)黃連素通過激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2途徑，下調(diào)β分泌酶表達(dá)，從而減少Aβ的產(chǎn)生。官杰等[15]研究復(fù)方還腦益聰方對(duì)APP轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠腦內(nèi)Aβ、β-分泌酶表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)其通過減少β、γ-分泌酶以及APP表達(dá)，抑制Aβ產(chǎn)生來改善AD小鼠學(xué)習(xí)記憶功能。

綜上所述，雖然中藥組分和天然產(chǎn)物作為β-分泌酶靶標(biāo)的抑制劑取得了一定的成績，但還存在明顯的不足[9]。此外，天然產(chǎn)物的藥理作用機(jī)制復(fù)雜，對(duì)β-分泌酶的抑制作用研究僅停留于藥效學(xué)研究水平，具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

2.2 γ-分泌酶抑制劑γ-分泌酶是一種存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的多亞基整膜蛋白復(fù)合體，主要參與APP重要跨膜蛋白的切割和水解過程。研究表明，γ-分泌酶是由四個(gè)亞單元（PS、NCT、APH1和PEN2）組成的膜內(nèi)蛋白水解酶。其中，四個(gè)亞單位中PS在跨膜蛋白處理中發(fā)揮核心作用，是引起家族性AD的主要原因；NCT具有γ-分泌酶的底物結(jié)合位點(diǎn)，即γ-分泌酶的底物首先由NCT特異性結(jié)合。APH1和PEN2是γ-分泌酶裂解sAPPβ所必需的[16]。

γ-分泌酶抑制劑的設(shè)計(jì)原則為將γ-分泌酶作為天冬氨酸蛋白酶的特性以及底物APP的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為依據(jù)，主要為肽醛類、雙氟酮類、羥乙基類等人工合成化合物。研究[17]表明，γ-分泌酶抑制劑LY-411575化合物能使APP小鼠中海馬區(qū)Aβ水平降低，同時(shí)未發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)途徑異常，但遺憾的是具有很強(qiáng)的胃腸道副作用。目前，以γ-分泌酶為靶點(diǎn)的中藥單體研究已成為中醫(yī)藥防治AD的新途徑。研究[18]表明，淫羊藿苷能下調(diào)快速老化小鼠（SAMP8）海馬中PS1基因表達(dá)，可能是通過抑制γ-分泌酶活性進(jìn)而起到治療AD的作用。何首烏中水溶性成分二苯乙烯苷能下調(diào)APP轉(zhuǎn)基因小鼠海馬區(qū)PS1表達(dá)和抑制γ-分泌酶活性，進(jìn)而達(dá)到防治AD的作用[19]。體外研究[20]表明，海風(fēng)藤中五味子乙素能抑制M146L細(xì)胞中γ-分泌酶活性，從而降低Aβ1-42表達(dá)。姜黃素能夠改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，提示可能是通過減少海馬CA1區(qū)PS2陽性表達(dá)，抑制γ-分泌酶活性，降低Aβ表達(dá)水平[21]。以上中藥有效成分對(duì)γ-分泌酶均具有一定的干預(yù)作用，為AD治療和預(yù)防提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也將是今后的一個(gè)主要研究方向。

3 以tau蛋白磷酸化為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型

在構(gòu)建具有β-淀粉樣蛋白沉積病理特征的轉(zhuǎn)基因小鼠過程中發(fā)現(xiàn)，許多APP轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)AD病理學(xué)和行為學(xué)改變先于β-淀粉樣蛋白沉積。雖然這些轉(zhuǎn)基因小鼠中具有Aβ斑塊沉積和認(rèn)知功能障礙，但是它們沒有解決另一個(gè)主要的AD病理特征—神經(jīng)原纖維纏結(jié)[22]。

tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，正常狀態(tài)下可促進(jìn)微管蛋白形成微管，并維持細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性和神經(jīng)元可塑性[22]。tau蛋白由位于17號(hào)染色體上的tau基因選擇性剪切表達(dá)。由于tau蛋白過度磷酸化形成NFT，導(dǎo)致細(xì)胞骨架穩(wěn)定性下降，相關(guān)的軸突運(yùn)輸障礙以及相應(yīng)神經(jīng)元的活性降低。那么Aβ淀粉樣斑塊和NFT兩者之間存在怎么的關(guān)系？Aβ淀粉樣斑塊和NFT怎樣誘導(dǎo)AD發(fā)生？這些難題至今未解決。

為了闡明tau蛋白異常磷酸化在AD發(fā)病機(jī)制中的作用，試圖采用過表達(dá)野生型或人類突變tau基因來制備轉(zhuǎn)基因模型小鼠來尋找突破口。研究[23]發(fā)現(xiàn)G272V和P301S突變的tau基因?qū)е罗D(zhuǎn)基因小鼠NFT的形成和嚴(yán)重的認(rèn)知功能障礙。tau轉(zhuǎn)基因小鼠JNPL3，開始未出現(xiàn)Aβ淀粉樣斑塊和認(rèn)知障礙，后期才出現(xiàn)神經(jīng)元丟失和NFT病理變化。為了模擬與AD相關(guān)的NFT病理改變，tau基因敲除小鼠與表達(dá)人基因組tau的小鼠雜交，最終表達(dá)人類而不是小鼠tau基因[24]。在制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型時(shí)，未真正考慮到物種本身所攜帶的基因表達(dá)情況，導(dǎo)致有些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型未能表現(xiàn)理想的AD病理特征。

為了彌補(bǔ)單轉(zhuǎn)基因小鼠模型未能完全模擬Aβ斑塊和NFT的缺點(diǎn)，能同時(shí)表達(dá)人類APP、PSEN和tau基因的三轉(zhuǎn)基因小鼠模型被逐漸重視。Tanemura等[25]建立了APP、PSEN和tau基因的三轉(zhuǎn)基因小鼠模型，能同時(shí)模擬出Aβ和tau病理特征，即生成具有神經(jīng)毒性的Aβ和磷酸化tau蛋白，進(jìn)而形成老年斑和NFT。另外，三轉(zhuǎn)基因小鼠能夠模擬其他AD病理和行為學(xué)特征包括：膠質(zhì)增生、突觸損傷和學(xué)習(xí)記憶障礙[26]。

4 作用于tau蛋白磷酸化的藥物

目前，tau蛋白磷酸化水平是體內(nèi)多種蛋白激酶的磷酸化和脫磷酸化之間平衡所致，因此以抑制蛋白激酶磷酸化活性或增強(qiáng)脫磷酸化酶活性為思路而開發(fā)的小分子抑制劑成為抗AD藥物研究的重要方向之一[27]?，F(xiàn)階段研究最多的GSK-3β和CDK5是最有效的磷酸化tau蛋白激酶之一，與NFTs存在高度的共定位，酶活性與tau蛋白過度磷酸化成正相關(guān)，因此被認(rèn)為是與AD密切相關(guān)的關(guān)鍵tau蛋白磷酸化激酶[28-29]。中藥成分黃連素作用于igAPP突變小鼠發(fā)現(xiàn)，其通過抑制GSK-3β活性，進(jìn)一步通過AKT/ GSK-3β信號(hào)通路，減少β-CTF的生成，降低非可溶性Aβ的產(chǎn)生[30]。中藥成分山茱萸環(huán)烯醚萜苷（CIG）能夠抑制tau蛋白磷酸化，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和神經(jīng)元分化，對(duì)細(xì)胞和動(dòng)物模型均能起到神經(jīng)保護(hù)作用[12]。

5 結(jié)語與展望

盡管最為廣泛使用的多轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型能在遺傳學(xué)上模擬AD特征性病理學(xué)特征包括細(xì)胞外Aβ沉積和NFT等，但是還不能完全模擬出人類AD的所有特征。隨著轉(zhuǎn)基因模型研究的不斷進(jìn)步，理想的轉(zhuǎn)基因模型將不斷出現(xiàn)，屆時(shí)將加快AD治療藥物篩選。

AD是一種由多致病因素所致疾病，依據(jù)“單一分子、單一靶標(biāo)”的理論研究的藥物只能緩解AD病情而非治愈。近年來，隨著對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和多向藥理學(xué)的認(rèn)識(shí)，研究者逐漸改變單靶點(diǎn)藥物治療的思路，開發(fā)能同時(shí)調(diào)控多個(gè)靶點(diǎn)的高效而安全的“多靶點(diǎn)導(dǎo)向的活性配體”，提供了更廣闊的AD藥物研發(fā)思路。

［1］WHO.Dementia：A Public Health Priority［J］.Perspect Public Health，2012，5（3）：123-125.

［2］Alzheimer's Disease International.World Alzheimer Report. http：//www.alz.co.uk/research/files/WorldAlzheimerReport［EB/α］.pdf，2015.

［3］Hyman BT.New neuropathological criteria for Alzheimer disease［J］.Arch Neuro，1998，55（9）：1174-1176.

［4］Yonick D，Lauing K，Stock SR，et al.Mesenchymal stem cells facilitate fracture repair in an alcohol-induced impaired healing model［J］.J Orthop Trauma，2012，26（12）：712-718.

［5］Veerhuis R.Histological and direct evidence for the role of complement in the neuroinflammation of AD［J］.Current Alzheimer Research，2011，8（1）：34-58.

［6］Oddo S，Caccamo A，Kitazawa M，et al.Amyloid deposition precedes tangle formation in a triple transgenic model of A-lzheimer's disease［J］.Neurobiology of Aging，2003，24（8）：1063-1070.

［7］Morrissette DA，Parachikova A，Green KN，et al.Relevance of transgenic mouse models to human Alzheimer disease［J］.Biol Chem，2009，284（10），6033-6037.

［8］Schaeffer EL，F(xiàn)igueiro M，Gattaz WF.Insights into Alzheimer disease pathogenesis from studies in transgenic animal models［J］.Clinics Sao Paulo，2011，66（1）：45-54.

［9］周禹，程肖蕊，周文霞，等.以β-分泌酶為靶標(biāo)的阿爾茨海默病防治藥物研發(fā)進(jìn)展［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2012，28（2）：149-154.

［10］Lin N，Chen LM，Pan XD，et al.Tripchlorolide Attenuates β-amyloid Generation via Suppressing PPARγ-Regulated BACE1 Activity in N2a/APP695 Cells［J］.Molecular Neurobiology，2011，675（1-3）：15-21.

［11］李維祖.黃芪總苷對(duì)糖皮質(zhì)激素和β-淀粉樣蛋白協(xié)同誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究［D］.安徽醫(yī)科大學(xué)，2010.

［12］Nord L C，Sundqvist J，Andersson E，et al.Analysis of oestrogen regulation of alpha-，beta-and gamma-secretase gene and protein expression in cultured human neuronal and glial cells［J］.Neuro-degenerative diseases，2010，7（6）：349-364.

［13］李林，張?zhí)m.中藥治療阿爾茨海默病的作用特點(diǎn)［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2012，39（8）：816-828.

［14］Zhu F，Wu F，Ma Y，et al.Decrease in the production of beta-amyloid by berberine inhibition of the expression of beta-secretase in HEK293 cells［J］.Bmc Neuroscience，2011，12（50）：1-8.

［15］官杰，劉劍剛，李浩，等.還腦益聰方提取物對(duì)阿爾茨海默病模型小鼠腦組織Aβ、APP及相關(guān)分泌酶表達(dá)的影響［J］.中藥新藥與臨床藥理，2011，22（3）：236-240.

［16］劉劍敏，姜鳳超.γ-分泌酶抑制劑的研發(fā)現(xiàn)狀［J］.藥學(xué)進(jìn)展，2004，28（11）：491-497.

［17］黃雪媚.針對(duì)阿爾茨海默病中Aβ42靶點(diǎn)的抗體與天然藥物的效應(yīng)分析［D］.吉林大學(xué)，2011.

［18］劉美霞，劉劍剛，李浩.以γ分泌酶為靶點(diǎn)治療阿爾茨海默病的中藥單體及組分研究進(jìn)展［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2014，34（3）：376-379.

［19］邢穎，張?zhí)m，李林.二苯乙烯苷對(duì)APP轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和腦內(nèi)β-淀粉樣肽表達(dá)的影響［J］.中國新藥雜志，2006，15（7）：510-513.

［20］劉薇，余銳，吳家華，等.五味子乙素抑制M146L細(xì)胞Aβ42生成的機(jī)制研究［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2006，41（12）：1136-1140.

［21］王蓬文，李瑞晟，王虹，等.姜黃素對(duì)APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠Aβ生成和降解的影響［J］.中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2010，18（5）：368-377.

［22］Walsh DM，Tseng BP，Rydel RE，et al.The oligomerization of amyloid β-protein begins intracellularly in cells derived from human brain［J］.Biochemistry，2000，39（35）：10831-10839.

［23］Rockenstein E，Mante M，Alford M，et al.High beta-secr-etase activity elicits neurodegeneration in transgenic mice despite reductions in amyloid-beta levels：implications for the treatment of Alzheimer disease［J］.Journal of Biological Chemistry，2005，280（38）：32957-32967.

［24］Schindowski K，Bretteville A，Leroy K，et al.Alzheimer's disease-like tau neuropathology leads to memory deficits and loss of functional Synapses in a novel mutated tau transgenic mouse without any motor deficits［J］.American Journal of Pathology，2006，169（2）：599-616.

［25］Tanemura K，Murayama M，Akagi T，et al.Neurodegeneration with tau accumulation in a transgenic mouse expressing V337M human tau［J］.Neurosci，2002，22（1）：133-141.

［26］Salkovic-PetrisicM，KnezovicA，HoyerS，etal.What have we learned from the streptozotocin-induced animal model of sporadic Alzheimer's disease，about the therapeutic strategies in Alzheimer's research［J］.Journal of Neural Tr-ansmission，2013，120（1）：233-252.

［27］解鴻波，陳秀杰，劉磊，等.Tau蛋白激酶及其抑制劑的研究進(jìn)展［J］.中國藥物化學(xué)雜志，2015，（3）：221-230.

［28］Hanger DP，Anderton BH，Noble W.Tau phosphorylation：the therapeutic challenge for neurodegenerative disease. Trends Mol Med［J］.Trends in Molecular Medicine，2009，15（3）：112-119.

［29］Avila J.Tau phosphorylation and aggregation in Alzheimer's disease pathology［J］.Febs Letters，2006，580（12）：2922-2927.

［30］Durairajan SS，Liu LF，Lu JH.Berberine ameliorates beta-amyloid pathology，gliosis，and cognitive impairment in an Alzheimer's disease transgenic mouse model［J］.Neurobiol Aging，2012，33（12）：2903-2922.

（收稿：2016-09-09修回：2016-12-16）

浙江省金華市中醫(yī)院中藥房（金華321000）