曾 杰 劉 瑤 焦薇薇 許明賀 王 杰綜述 王傳航審校

1. 中日友好醫(yī)院（北京 100029）；2. 西南醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院

·綜 述·

糖尿病勃起功能障礙動(dòng)物模型的制備

曾 杰1劉 瑤2焦薇薇1許明賀1王 杰1綜述 王傳航1審校

1. 中日友好醫(yī)院（北京 100029）；2. 西南醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院

流行病學(xué)調(diào)查顯示，糖尿病患者中ED的發(fā)病率為19.5%～75.2%[1,2]。隨著糖尿病發(fā)病率的不斷升高，糖尿病勃起功能障礙（DMED）的發(fā)病率也日漸增高，預(yù)計(jì)我國(guó)到2025年DMED患者會(huì)達(dá)到4000萬(wàn)[3]。對(duì)疾病的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究可以指導(dǎo)臨床診療，而制備合適的動(dòng)物模型是進(jìn)行高質(zhì)量實(shí)驗(yàn)研究的前提。本文針對(duì)DMED動(dòng)物模型的制備進(jìn)行綜述。

一、造模動(dòng)物的選擇

綜合考慮實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?jīng)費(fèi)狀況、動(dòng)物自身特點(diǎn)、飼養(yǎng)環(huán)境和與人體結(jié)構(gòu)的相似度等因素，選用恰當(dāng)?shù)脑炷?dòng)物可以確保實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性和可信性。實(shí)踐中常選擇大鼠、小鼠、兔、豬等動(dòng)物，少數(shù)情況下也選擇靈長(zhǎng)類動(dòng)物如猴[4]。

在DMED的造模中，嚙齒類動(dòng)物因?yàn)閮r(jià)格較低和技術(shù)成熟等原因故較多的被選用[5]。其中，大鼠盆腔及陰莖組織的神經(jīng)反射、血管走向以及相關(guān)受體分布等與人類有較強(qiáng)相似度，而且抗感染能力強(qiáng)和繁殖周期短[6]，故在DMED的造模中使用最多。小鼠因體型小易捕捉，發(fā)育迅速，性成熟早，尾部血管豐富，在DMED的分子病因?qū)W機(jī)制研究中選用較多[7]。

與其他常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相比，豬和人類在解剖結(jié)構(gòu)、生理病理等方面具有更大的相似度，與人的基因純合度為95%，人工選育的小型豬由于性格溫順而易于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，特別是隨著現(xiàn)代動(dòng)物保護(hù)意識(shí)的增強(qiáng)和“3R原則[即減少（Reduction）、優(yōu)化（Refinement）和替代（Replacement）]”的實(shí)行，小型豬在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中具有更大優(yōu)勢(shì)[8]。有研究采用高脂高糖飼料喂廣西巴馬小型豬，半年后有50%小型豬產(chǎn)生糖尿病，1年后DMED的總成模率為13%[9]。

兔大小適宜、方便管理，其陰莖結(jié)構(gòu)和人很相似，尤其是在海綿體張力的神經(jīng)與非神經(jīng)因素方面[10]，且沒(méi)有陰莖骨，海綿體組織相對(duì)豐富。陳國(guó)強(qiáng)等[11]從兔的耳緣靜脈注射四氧嘧啶，成功建立糖尿病動(dòng)物模型，再通過(guò)測(cè)定海綿體內(nèi)壓，成功建立DMED動(dòng)物模型。Pereira等[12]采取相同的方式建立家兔DMED模型，通過(guò)病理和免疫組化檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)發(fā)生ED的機(jī)制是血管結(jié)構(gòu)變化，陰莖血液供應(yīng)減少。

嚙齒類動(dòng)物雖然廣泛用于建立人類疾病動(dòng)物模型，但是由于存在巨大的種屬差異，很多在動(dòng)物研發(fā)中證明對(duì)鼠有效的藥物卻對(duì)人無(wú)效。靈長(zhǎng)動(dòng)物從生物學(xué)上來(lái)說(shuō)是人類的近親，相比其他動(dòng)物模型，靈長(zhǎng)類動(dòng)物可更好地復(fù)制人類疾病[13]。但是由于數(shù)量相對(duì)少、費(fèi)用昂貴等因素，目前缺少使用非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物建立DMED模型的報(bào)道。

二、DM動(dòng)物模型的建立

（一）1型糖尿?。═ype 1 diabetes mellitus，T1DM）動(dòng)物模型

T1DM動(dòng)物模型的建立多基于破壞動(dòng)物胰島，方式有藥物誘導(dǎo)和手術(shù)切除胰腺[14]。手術(shù)切除胰腺對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物傷害較嚴(yán)重，操作有一定難度，批量造模困難。藥物誘導(dǎo)簡(jiǎn)便易操作，常用的藥物有鏈脲佐菌素（STZ）和四氧嘧啶（alloxan,ALX）。STZ和ALX對(duì)動(dòng)物胰島β細(xì)胞有特異的破壞作用，可減少或終止動(dòng)物胰島素分泌，引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物患糖尿病。

STZ是一種誘導(dǎo)DNA雙鍵斷裂的強(qiáng)烷基化藥劑，可抑制葡萄糖運(yùn)轉(zhuǎn)，影響葡萄糖激酶功能，損傷胰島β細(xì)胞。據(jù)報(bào)道[15]，成年雄性長(zhǎng)尾猴靜脈注射STZ,兩個(gè)月后再次注射該藥,定期靜脈抽血可發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)尾猴血糖水平明顯升高，內(nèi)源性胰島素明顯降低。由于大鼠和小鼠以及同種動(dòng)物不同品系之間對(duì)STZ敏感性不同，藥物注射劑量和給藥方式等也有差異。有報(bào)道稱，一次性給小鼠大劑量注射STZ（100mg/kg）[16]，大鼠注射STZ（55～65mg/kg）[17]可導(dǎo)致胰腺β細(xì)胞壞死，建立無(wú)炎癥性T1DM模型。也有研究報(bào)道，小鼠小劑量（40mg/kg）連續(xù)腹腔注射STZ，可引發(fā)自身免疫性損害，誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫性T1DM動(dòng)物模型[18]。

ALX對(duì)胰島β細(xì)胞具有特殊的破壞作用，可通過(guò)產(chǎn)生超氧自由基終止胰島素的分泌。以兔為造模動(dòng)物，可采用耳緣靜脈注射ALX的方式，連續(xù)2次小劑量（首次按80mg/kg，24h后按照120mg/kg）給藥比1次大劑量（150mg/kg）給藥成模率更高（80%/20%），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率更低（10%/70%）[19]。梁沛余等[20]認(rèn)為多次ALX給藥法建立糖尿病大鼠模型時(shí)，第1次大鼠腹腔注射ALX 100 mg/kg，24h后補(bǔ)注相同劑量是最佳給藥時(shí)間和劑量。丁利等制備T1DM小鼠模型時(shí)[21]，利用ALX腹腔兩次注射法，首次劑量為120mg/kg，24h后再次注射80mg/kg，可防止小鼠低血糖的發(fā)生，降低死亡率。

（二）2型糖尿?。═ype 2 diabetes mellitus，T2DM）動(dòng)物模型

在T2DM模型動(dòng)物的構(gòu)建中，為避免大劑量注射STZ導(dǎo)致T1DM和動(dòng)物血糖過(guò)低而死亡，可采用煙酰胺（NAA）預(yù)先15min注射保護(hù)胰島β細(xì)胞，再給STZ破壞，能夠建立成模率高、病死率低、癥狀明顯的T2DM模型[22,23]。大鼠可預(yù)先注射NAA100～200mg/kg，小鼠可預(yù)先注射NAA120～240mg/kg，有助于清除氧自由基，減輕STZ導(dǎo)致的胰島細(xì)胞氧化損害。

飲食聯(lián)合藥物干預(yù)也是建立T2DM動(dòng)物的重要手段，樂(lè)嶺等[24]利用高脂飲食喂養(yǎng)SD大鼠，8周后大鼠體質(zhì)量增加，腹腔脂肪明顯增多，以小劑量STZ腹腔注射誘導(dǎo)糖尿病，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)甘油三酯、游離脂肪酸和胰島素抵抗指數(shù)升高，高血糖與胰島素抵抗均出現(xiàn)，與人類T2DM病理生理特點(diǎn)相似。在利用小鼠[25]、獼猴[26]造模時(shí)，給予高脂高糖飲食飼養(yǎng)后，再使用藥物制備DM模型，也能發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)肥胖、高脂血癥、胰島素抵抗，符合人類T2DM的臨床特點(diǎn)和病理特征。因此，這種造模方法簡(jiǎn)便可行，重復(fù)性好，是研究T2DM機(jī)制和并發(fā)癥較為理想的模型。

在實(shí)驗(yàn)性DM動(dòng)物模型之外，近年也有自發(fā)性T2DM動(dòng)物模型應(yīng)用于相關(guān)研究。例如OLETF大鼠、GK大鼠、db/db小鼠、黑線倉(cāng)鼠等，具有慢性DM病程、多食、輕度肥胖、胰腺增生等特點(diǎn)，早期可出現(xiàn)胰島素抵抗、糖脂代謝紊亂，繼而胰島功能逐步減退，很接近人類T2DM。而且，OLETF大鼠具有由于代謝紊亂而致的血管內(nèi)皮功能障礙的病理表現(xiàn)[27]，血管內(nèi)皮功能障礙是ED的病理基礎(chǔ)之一，因此利用自發(fā)性T2DM動(dòng)物建立2型糖尿病勃起功能障礙模型是值得研究的方向。

近年來(lái)基因編輯技術(shù)已成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)，通過(guò)對(duì)基因組進(jìn)行精確定點(diǎn)修飾，可快速構(gòu)建動(dòng)物模型。利用基因編輯技術(shù)，研究者已經(jīng)成功制備T2DM動(dòng)物模型[28]。然而，目前基因工程動(dòng)物模型有成本較高、單基因模擬、繁殖時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)，也可能因脫靶效應(yīng)而引發(fā)生物安全風(fēng)險(xiǎn)，仍需隨著基因工程技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展，建立科學(xué)安全的多基因修飾的動(dòng)物模型。

三、勃起功能的評(píng)估

DM造模成功后，下一步需評(píng)估實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的勃起功能。誘導(dǎo)陰莖勃起的方法有血管活性藥物海綿體注射法、負(fù)壓吸引法、電刺激法、可視性性興奮刺激法等，在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中常使用阿撲嗎啡實(shí)驗(yàn)、電刺激法以及模擬自然狀態(tài)下交配行為等。

阿撲嗎啡（APO）作為一種非選擇性的中樞多巴胺受體激動(dòng)劑，可通過(guò)激動(dòng)D1、D2樣受體，誘發(fā)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生陰莖勃起。研究者對(duì)DM兔予APO皮下注射,觀察和記錄勃起狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)DM兔表現(xiàn)出顯著的勃起功能抑制[29]。DM大鼠成模后進(jìn)行APO實(shí)驗(yàn)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，勃起次數(shù)和勃起率逐漸降低，從中可篩選出DMED大鼠進(jìn)行研究[30]。此法評(píng)價(jià)陰莖勃起的判定標(biāo)準(zhǔn)具有一定主觀性，對(duì)于動(dòng)物同樣的表現(xiàn)，不同的實(shí)驗(yàn)者可能會(huì)產(chǎn)生判斷上的差異。

運(yùn)用電刺激動(dòng)物陰莖海綿體神經(jīng)誘發(fā)勃起，再通過(guò)換能器讀取陰莖海綿體內(nèi)壓（ICP），ICP可直接反映陰莖的勃起功能，因此該法較為客觀準(zhǔn)確。用電刺激大鼠陰莖海綿體神經(jīng)后測(cè)量ICP及平均頸動(dòng)脈壓（MAP），對(duì)比正常組和T2DM組大鼠的ICP和MAP，可發(fā)現(xiàn)T2DM組的ICP明顯低于正常組[31]。通過(guò)改良ICP測(cè)量方法，選擇陰莖腳作為穿刺部位，利用倒刺狀穿刺針進(jìn)行穿刺，可使進(jìn)針?lè)€(wěn)定精準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)測(cè)定ICP成功率可達(dá)100%[32]。利用電刺激盆神經(jīng)，也可以誘發(fā)兔[11]、狗[33]等動(dòng)物陰莖勃起，評(píng)價(jià)其勃起功能。電刺激法在國(guó)外是評(píng)價(jià)陰莖勃起功能的標(biāo)準(zhǔn)方法，穩(wěn)定準(zhǔn)確，重復(fù)性較好，故應(yīng)用較為廣泛[34,35]，但也有操作方法復(fù)雜、對(duì)動(dòng)物創(chuàng)傷大、電刺激參數(shù)難以把握等不足。

評(píng)價(jià)動(dòng)物勃起功能也可采用交配實(shí)驗(yàn)，通過(guò)以藥物誘導(dǎo)雌鼠發(fā)情，隨后將雌鼠和STZ注射后的糖尿病雄鼠放在一起，觀察記錄雄鼠乘騎、插入、射精次數(shù)及射精潛伏期、射精后間隔來(lái)評(píng)價(jià)勃起功能[36]。馬凱偉等[37]將DM大鼠分為APO組、西地那非組和模型組，分別予以相應(yīng)藥物干預(yù)后用發(fā)情雌鼠與之配對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)造模動(dòng)物經(jīng)過(guò)藥物刺激后的狀態(tài)難以準(zhǔn)確體現(xiàn)勃起功能，相比之下，由發(fā)情雌鼠誘導(dǎo)更可能激發(fā)出模型雄鼠陰莖的確切勃起。該法易受環(huán)境影響，有的勃起功能正常的動(dòng)物可能因與雌性動(dòng)物同籠受驚，缺乏交配主動(dòng)性，從而會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

四、小結(jié)

目前，在人類身上進(jìn)行性功能的相關(guān)研究受到倫理等多方因素的制約，因此研究者需要設(shè)計(jì)各種DMED的動(dòng)物模型，研究并闡明糖尿病導(dǎo)致ED的發(fā)病機(jī)制、藥物的藥理作用等。在DMED實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中，嚙齒類動(dòng)物模型的建立比較成熟，在較大程度上取代其他動(dòng)物成為DMED的主要?jiǎng)游锬Ｐ汀Ｗ詈?，探索建立更加符合人類生理病理特點(diǎn)的糖尿病動(dòng)物模型，提高評(píng)價(jià)勃起功能的方法的準(zhǔn)確性，減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物傷害，降低實(shí)驗(yàn)成本，提高成模率，是今后研究工作的著力點(diǎn)之一。

致謝：本課題受國(guó)家自然科學(xué)基金資助（編號(hào)：81673978）

糖尿病; 勃起功能障礙; 疾病模型, 動(dòng)物

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（2017-05-30收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2017.04.017

R 587.1; R 698.1