張亮，張健

· 綜述 ·

基因表達評分在非糖尿病冠心病診斷中的應用進展

張亮1，張健1

現(xiàn)有的冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┰\斷手段主要有心電圖、心臟超聲、冠狀動脈造影、冠狀動脈CTA及心肌灌注成像（MPI）等，其中冠狀動脈造影是診斷冠心病的金標準，臨床中在冠狀動脈造影檢查前通常使用非侵入性檢查手段進行危險因素評估，但均存在特異性差或敏感度低等缺陷，不利于冠心病的早期診斷。

基因表達評分（GES）是基于患者年齡、性別以及通過qRT-PCR的方法定量檢測患者外周血中23個基因表達水平使用特定公式（表1）進行計算從而得出相應評分，其用于非糖尿病患者冠心病檢測已被多中心研究證實。

1 基礎(chǔ)研究

1.1 研究背景 冠心病及其并發(fā)癥，如急性心肌梗死、心力衰竭，具有極高的致死率和致殘率。在當今心臟病學實踐中，治療指南[1]建議對于中?；颊咄扑]無創(chuàng)性影像檢查，對于高?；颊咄扑]行冠狀動脈造影。然而在實際臨床工作中，對于可疑胸痛患者的危險分層缺少明確指征，且無創(chuàng)性影像檢查僅能篩查出不到40%的冠心病患者[2,3]。另外在女性可疑胸痛患者中，使用如心電圖、心臟超聲等無創(chuàng)性檢查并不能很好的排除非冠心病患者[4]，因此一種無創(chuàng)準確的冠心病早期檢測手段在冠心病診療中顯得更為迫切需要，COURAGE（Clinical Trials Utilizing Revascularization and Aggressive Drug Evaluation）研究[5]也推薦盡量使用創(chuàng)傷性較小的診斷手段來確診疾病。外周血的基因表達變化非常靈敏的反應冠心病的發(fā)生發(fā)展狀態(tài)[6]，目前已有研究[7,8]表明，定量測定外周血中相關(guān)基因的表達量可反應冠心病的嚴重程度，因此通過非侵入性的血液檢查，可以可靠的評估冠心病的發(fā)病風險。

1.2 基因選擇 冠心病的主要發(fā)病因素是冠狀動脈粥樣硬化，而動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展與炎癥密切相關(guān)[9]。一些炎癥細胞與因子聚集在損傷的內(nèi)皮周圍，促使動脈粥樣硬化的形成和易損斑塊的破裂。由于血液循環(huán)，動脈粥樣硬化的先天性免疫應答和適應性相關(guān)的循環(huán)血細胞包括嗜中粒細胞，NK細胞，B、T淋巴細胞特異性表達相關(guān)的基因間接的表現(xiàn)在外周血中，如CASP5[10]在脂核進展的過程中表達水平明顯上調(diào)；KLRC4[11]通過激活NK細胞進而減少動脈粥樣硬化過程中淋巴細胞計數(shù)。

DUKE大學CATHGEN實驗室展開一項研究，共納入195例患者，經(jīng)過微陣列分析篩選出2438個冠心病相關(guān)基因，進行相關(guān)性分析后選出88個基因用于RT-PCR，分別對非糖尿病和糖尿病患者進行冠心病相關(guān)基因表達量分析（其中非糖尿病患者124例，糖尿病患者71例），陽性組判定標準：在一個主要的器官中有一處最大狹窄≥75%，或有兩處≥50%為病例組，對照組為所有主要血管中＜25%狹窄。最終在非糖尿病人群與糖尿病人群中分別確定42和12個顯著相關(guān)的基因（P＜0.05）且兩者之間沒有重疊基因，所以后續(xù)臨床研究只針對非糖尿病患者。PREDICT（Personalized Risk Evaluation and Diagnosis in the Coronary Tree）研究【http://www.clinicaltrials.gov, NCT00500617】中納入198例非糖尿病冠心病患者，經(jīng)過微陣列分析篩選出5935個冠心病相關(guān)基因，通過生物相關(guān)性分析數(shù)據(jù)特異、生物相關(guān)性以及RT-PCR后基因表達水平測定共篩選出113個冠心病基因。選擇PREDICT組[12]中640例非糖尿病樣本（病例組/對照組：210/430），用RT-PCR分析這113個基因，從而進行算法開發(fā)。用LASSO分析基因表達的相關(guān)性，將基因進行分類，用嶺回歸分析（Ridge Regression），基于基因表達相關(guān)聚類和細胞類型分析，最終確定與冠心病相關(guān)的類群，包括性別、年齡以及6個基因組23個基因，包括20個冠心病相關(guān)基因及3個管家校準基因。

1.3 基因評分系統(tǒng) 以基因表達評分系統(tǒng)為基礎(chǔ)的Corus CAD算法包含患者年齡、性別以及全血中6個基因組共23個基因，它提供一個1-40的評分，其陰性預測值達95%；評分≤15分的患者冠狀動脈狹窄程度≤25%，且1年內(nèi)的血運重建及不良事件的發(fā)生率極低，基因表達評分與心血管事件及血運重建具有明顯的相關(guān)性[13]。隨著分數(shù)增高，其冠狀動脈狹窄程度越高，該評分可以預測冠心病發(fā)病風險。在一項前瞻性實驗中[14]，使用該算法用ROC分析交叉驗證估計AUC=0.70（95%CI：0.65～0.75），在臨床中具有較好的應用價值。另外，基因表達評分在女性人群中的應用表現(xiàn)尤其出色[15]。

1.4 實驗影響因素 一項實驗[16]通過全血質(zhì)控品來考察批內(nèi)變異及批間變異情況，包括人員，儀器，試劑在內(nèi)一共分析11個影響因素。批內(nèi)和批間變異性分別是0.092和0.059，總體變異性是0.11。將11個影響因素進行回歸分析發(fā)現(xiàn)，檢測板和cDNA試劑盒是主要的影響因素?？傮w上看，RNA提取試劑盒，cDNA合成以及qRT-PCR貢獻了大部分批間變異（52.3%），其次是操作和儀器（18.9%，9.2%），其余19.6%未知。批間變異中的PCR過程在總體變異中貢獻最大，試劑批次是批內(nèi)變異中的主要因素。

2 臨床研究

2.1 GES優(yōu)于核素心肌灌注顯像（MPI） COMPASS（Coronary Obstruction Detection by Molecular Personalized Gene Expression）[17]研究是一項多中心的前瞻性試驗，共納入537例非糖尿病患者，將入選者外周血樣本用于GES檢測，之后這些患者又接受了MPI檢測。對于MPI檢測異常的患者接受冠狀動脈造影或者冠狀動脈CTA。最終431例患者完成了GES、MPI和冠狀動脈成像（冠狀動脈造影或CT血管成像）?；颊咂骄挲g56±10歲（48%為女性）。預先設(shè)定終點是GES受試者操作特性分析確定的＞50%狹窄。GES受試者工作特征曲線下面積（AUC）為0.79，靈敏度，特異性及陰性預測值分別為89%、52%和96%，對應的閾值為＜15分，患者占比46%。通過受試者操作特性以及再分類分析GES優(yōu)于其它臨床因子，并與最大動脈狹窄程度呈高度相關(guān)關(guān)系。對患者進行6個月的隨訪顯示，GES＞15的患者中，有97%的患者，即28名患者中有27例出現(xiàn)不良心血管事件或接受血管重建。GES在冠心病的檢測中有高靈敏度和高陰性預測值。在這項臨床實驗中，GES優(yōu)于其它臨床因子和MPI。

2.2 GES與冠狀動脈狹窄程度及斑塊負荷高度相關(guān) 為尋求確定GES與通過CT血管成像檢測得到的患者冠狀動脈狹窄之間的相關(guān)性。在一項前瞻性實驗中[18]，研究者對526例非糖尿病患者分別進行冠狀動脈CT檢查和GES檢測，結(jié)果得出基因評分與冠狀動脈狹窄程度呈正相線性關(guān)系。另外一項研究[19]分析了PREDICT和COMPASS研究中來源于59個中心的610例患者（平均年齡57±11歲；50%為男性），這些患者進行冠狀動脈CTA得到狹窄程度以及GES評分。根據(jù)冠狀動脈狹窄程度將冠狀動脈CTA結(jié)果分為5級，0：無狹窄，①極小狹窄，②輕微狹窄，③中等狹窄，④嚴重狹窄，⑤堵塞。通過單因素方差（ANOVA）以及受試者工作特征曲線（ROC）進行相關(guān)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GES與CTA評分（r=0.37；P＜0.001）高度相關(guān)。通過方差分析，隨著GES值升高，冠狀動脈狹窄程度也不斷增加（P＜0.001）；GES與最大冠狀動脈狹窄（r=0.41；P＜0.01）及狹窄評分指數(shù)（r=0.38，P＜0.01）高度相關(guān)，GES低值（＜15）靈敏度為0.90，GES高值（＞28）特異性為0.87。GES與通過CT血管成像檢測得到的患者動脈粥樣硬化斑塊和狹窄之間高度相關(guān)。一項基于ATLANTA（Assessment of Tissus characteristics,Lesion morphology and hemodynamics by Angiography with fraction flow reserve,intravascular ultrasound and virtual histology and Non-invasive computed Tomography in Atherosclerotic plaques）研究結(jié)果的臨床試驗[20]，通過使用IVUS/VH測量冠狀動脈斑塊負荷（包括纖維組織、壞死脂核、鈣質(zhì)密度），用斯皮爾曼等級相關(guān)關(guān)系處理測量結(jié)果與基因表達評分的關(guān)系。試驗共納入18例患者，平均年齡61.1±8.6歲，67%為男性，平均GES21.6±9.4分，經(jīng)過斯皮爾曼等級相關(guān)處理后認為GES不僅僅與冠心病相關(guān)，而且與斑塊負荷有關(guān)，其鈣化程度越高、斑塊體積越大，相應GES越高。

2.3 基因表達評分穩(wěn)定性 穩(wěn)定性是檢測分子生物診斷手段是否可靠的重要指標。一項[21]研究使用受試者操作特性曲線（ROC）分析來源于PREDICT研究中樣本中基因表達評分，研究者重新檢測了保存5年的PREDICT研究中驗證樣本隊列（n=526），基因表達評分平均值從5年前的20.3分變?yōu)?年后的19.8分（n=501），另外將173例約1年前入組的COMPASS研究患者樣本用于GES檢測，基因表達評分平均值有微小的上升，從15.9分～17.3分，相對應的冠心病風險上升2.5%，表明血液中的基因表達并不會隨時間而發(fā)生量的明顯改變，其中一些微小的變化考慮是由于心血管藥物的使用所導致。

3 GES在臨床中的應用

3.1 使用GES診斷冠心病 IMPACT-PCP（Investigation of a Molecular Personalized Coronary Gene Expression Test on Primary Care Practice Pattern）研究[22]是一項評估Corus CAD評分在醫(yī)師對于首次就診的阻塞性冠心病患者中的診斷策略的影響。在4個初級護理機構(gòu)中用基因表達評分（GES）診斷穩(wěn)定的、非急性的、非糖尿病并伴有胸痛和相關(guān)癥狀的患者。所有接受GES檢測的患者，記錄他們在GES之前和之后的診斷策略。GES是通過外周血中23個基因表達水平的計算對冠心病進行診斷，陰性預測值為96%。結(jié)果證實在251例受試者中，140例女性（56%）；平均年齡56歲（標準差13.0），平均體質(zhì)指數(shù)30 mg/kg2（標準差6.7）。平均GES為16（范圍1～38），127例患者（51%）低GES。251例中有145例患者在GES后改變了診斷方案，在對247例（98%）患者為期30 d的隨訪中，僅有1例MACE事件（低GES評分患者發(fā)生出血性卒中）報道。由此認為將GES整合入冠心病的診斷流程中顯示出臨床實用性，可以優(yōu)化患者的診斷評估。

3.2 使用GES預測MACE 臨床中已經(jīng)證實血液GES可用于冠心病的預測，然而對于那些接受冠狀動脈造影的患者，GES是否同樣能夠預測其主要心血管不良事件及血運重建情況從而對治療進行相關(guān)指導。一項基于PREDICT 研究結(jié)果的臨床試驗[23]，共納入1160例患者，通過隨訪造影及基因表達評分，評估其在1年內(nèi)MACE（主要心血管不良事件）和血管重建情況，研究結(jié)束時共1116例完成隨訪，其30 d不良事件率為23%，12個月不良事件率增加2.2%。GES與MACE/血管重建率相關(guān)，GES大于15的患者，＞30 d MACE/血管重建的風險增加，MACE總發(fā)生率為1.5%（17/1116），17例中3例GES≤15。全部低GES組（n=396），MACE/血管重建陰性預測值為90%。由此推測基因表達評分在臨床中可篩選出無阻塞性冠心病以及1年內(nèi)發(fā)生MACE可能性低的患者。

3.3 使用GES指導醫(yī)師避免過度檢查 IMPACT-CARD（Investigation of a Molecular Personalized Coronary Gene Expression Test on Cardiology Practice Pattern）研究[24]是一項前瞻性臨床試驗，為了評估GES是否影響心臟科醫(yī)師在冠心病患者臨床診斷中的決策。該項研究共納入83例穩(wěn)定性冠心病患者，分別由6位心臟科醫(yī)師根據(jù)臨床因素及患者癥狀作出臨床決策，包括侵入性檢查或無創(chuàng)性檢查，然后根據(jù)GES結(jié)果重新作出最終決策。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有48例患者[58%，95%CI（46%，69%）]的診療意見發(fā)生變動，更多的患者接受了少量的、無創(chuàng)檢查，在這部分人群中高達91%的患者GES≤15分。而對于那些檢查項目增多的患者，其GES均有不同程度的升高。在這項研究中，結(jié)果表明在臨床實踐中可以通過基因表達評分來指導低?；颊弑苊饨邮苓^度的醫(yī)療檢查的方法是有效可行的。

4 展望與不足

GES可有效的評估冠心病風險，可以預測冠狀動脈狹窄程度、斑塊負荷，在冠心病的檢測中具有高靈敏度和高陰性預測值，優(yōu)于其它臨床因子和MPI。目前以GES為代表的項目Corus@CAD檢測已在美國50個州，印度，以色列等地獲得了檢測許可，并被美國安泰保險和考文垂的健康保險納入醫(yī)療保險覆蓋范圍。近來，國外越來越多的科研團體展開對GES在疾病中的應用，美國心臟病協(xié)會亦發(fā)表臨床策略聲明[25]討論在未來臨床中基因如何在心臟疾病的診斷與治療中發(fā)揮作用，亦代表了當今醫(yī)療的大趨勢。

GES作為一項新型的檢測手段，在應用初期仍存在諸多不足，對于糖尿病人群、合并全身反應綜合征、系統(tǒng)性感染、服用類固醇藥物或化療藥物的人群，會干擾GES的準確性。且目前國外研究所納入的人群多為白種人，對于亞洲人群，其研究結(jié)果需要進一步驗證。

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本文編輯：張靈

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