林晨 溫成平 范永升

·實(shí)驗(yàn)研究·

蘄蛇乙醇提取物多肽成分的蛋白組學(xué)研究

林晨 溫成平 范永升

目的通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析蘄蛇乙醇提取物中的多肽類成分。方法雙向凝膠電泳技術(shù)分離多肽，染色后切取多肽斑點(diǎn)膠內(nèi)酶切，利用基質(zhì)輔助激光解吸離子飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS/MS）分析酶切后抽提的肽段，獲取的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)一步用于數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，鑒定相關(guān)肽段序列。結(jié)果采用稀乙醇熱浸法每克蘄蛇藥材多肽溶出率為5.48%。凝膠圖像顯示各等電點(diǎn)區(qū)間均有2kDa的多肽分布，無(wú)法通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)檢索方式有效鑒定，而在15kDa區(qū)間存在的膠點(diǎn)中高置信度匹配到多個(gè)肽段。結(jié)論采用稀乙醇熱浸法能有效提取蘄蛇干燥藥材中的多肽成分。

蘄蛇；多肽；蛋白質(zhì)組學(xué)；凝膠電泳；質(zhì)譜鑒定

中藥蘄蛇為蝰科動(dòng)物五步蛇Agkistrodon acutus（Guenther）的干燥體，具有祛風(fēng)散寒，舒筋活絡(luò)的功效，《景岳全書(shū)》稱頌其“風(fēng)毒惡瘡，俱為要藥”[1]。近年研究表明，蘄蛇含有核苷類[2]和磷脂類[3]成分，但對(duì)這些成分的生物活性并無(wú)相關(guān)報(bào)道。另一方面，蘄蛇屬于動(dòng)物藥，以干燥蛇體入藥，富含蛋白質(zhì)，藥材中總氨基酸含量接近70%[4]，但一直以來(lái)對(duì)這類成分的研究較少。劉訓(xùn)紅等[5]早期研究從蘄蛇提取物中測(cè)得一類分子量未知的酸性蛋白，丁興紅等[2]通過(guò)生物酶解方法從蘄蛇中提取出130kDa的Ⅱ型膠原蛋白，具有炎癥抑制活性[6-7]。最近，柴士偉等[8]以蘄蛇藥材中四種氨基酸總含量為指標(biāo)來(lái)優(yōu)化湯劑的煎煮工藝。但目前對(duì)傳統(tǒng)的酒浸、煎煮提取方法中獲取的肽類成分的表征及其活性尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。

基于生物質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究相比傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)鑒定方法（如免疫學(xué)或氨基酸末端測(cè)序），簡(jiǎn)化了蛋白純化流程，能夠高通量、高靈敏度分析復(fù)雜樣品，在中藥復(fù)雜體系作用機(jī)制的分析中得到廣泛應(yīng)用。目前生物質(zhì)譜的蛋白質(zhì)鑒定可分為自上而下（top-down）以及自下而上（bottom-up）的兩種策略，top-down策略由于數(shù)據(jù)庫(kù)搜索算法的局限性和較高的假陽(yáng)性率，使其在蛋白質(zhì)鑒定的質(zhì)量控制方面的問(wèn)題十分突出，bottom-up策略將蛋白質(zhì)酶解成肽段再進(jìn)行分析，帶電量較低，能夠獲得更小的分析物相對(duì)分子質(zhì)量，有利于提高質(zhì)譜檢測(cè)的靈敏度[9]。本研究基于凝膠電泳的top-down策略研究蘄蛇乙醇提取物中的多肽成分，通過(guò)雙向凝膠電泳以及MALDI-TOF-TOF MS串聯(lián)質(zhì)譜分析，有效分離和識(shí)別溶出的多肽，為進(jìn)一步探討蘄蛇肽類成分的功能活性及藥效提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器KTA purifier 100蛋白純化系統(tǒng)（美國(guó)GE公司）；Scientific Appliskan酶標(biāo)儀（ThermoFisher公司）；PROEAN IEF等電點(diǎn)聚焦儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；PROTEANⅡxi垂直電泳槽（美國(guó)Bio-Rad公司）；5800 MALDI-TOF/TOFтм串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX公司）；ALPHA 1-2 LD plus冷凍干燥機(jī)（德國(guó)Christ公司）；默克密理博Synergy超純水儀（德國(guó)Merck公司）；ST 8R離心機(jī)（ThermoFisher公司）；BS423S分析天平（sartorius公司）；DZG-6020真空烘箱（杭州卓馳儀器有限公司）。

1.2 試劑無(wú)水乙醇（杭州龍山精細(xì)化工有限公司，批號(hào)20140114），氯化鈉（上海試四赫維化工有限公司，批號(hào)20150710）均為市售分析純。四甲基乙二胺（TEMED），過(guò)硫酸銨（AP），1.5M Tris二硫蘇糖醇（DTT），碘乙酰胺（IAA），11cm非線性IPG膠條，pH3-10兩性電解液，30%丙烯酰胺預(yù)混溶液，precision plus蛋白mark（貨號(hào)161-0377）均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（貨號(hào)P0015，上海碧云天生物技術(shù)研究所），考馬斯亮藍(lán)G-250（貨號(hào)北京索萊寶科技有限公司），溴酚藍(lán)（美國(guó)sig-ma公司），1×PBS磷酸鹽緩沖液（杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.3 供試藥材蘄蛇藥材由浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司提供，粉碎過(guò)80目篩備用。

2 方法

2.1 溶出率測(cè)定參照2010版《中國(guó)藥典》Ⅰ部附錄ⅩA：浸出物測(cè)定法下的熱浸法[10]所述，稱取藥材粉末25.024g，烘干30min，加入10倍量50%稀乙醇，密閉回流提取，溶液沸騰后保持微沸1h后室溫冷卻，收集溶液，5000×g離心20min，棄去底部藥渣沉淀，收集上清液，0.45μm超濾膜濾過(guò)。吸取10μL提取液，BCA法測(cè)定中多肽濃度，按照試劑盒說(shuō)明操作。重復(fù)3次取均值，計(jì)算提取液中多肽成分的含量和溶出率。

2.2 樣品處理提取液-20℃靜置過(guò)夜，待絮狀沉淀完全析出，5000×g離心30min，棄去上清，收集沉淀，-56℃凍干后保存。

取出凍干樣品，加入20mmol/L PBS磷酸緩沖液10mL完全復(fù)溶，BCA法測(cè)定溶液中多肽的濃度。

2.3 雙向凝膠電泳參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行雙向凝膠電泳分析。等點(diǎn)聚焦用11cm IPG預(yù)制膠條（pH3～10非線性）。凍干樣品500μg溶解于400μL水化緩沖液（0.2%Bio-Lyte 3/10ampho兩性電解質(zhì)，0.001%溴酚藍(lán)），膠內(nèi)被動(dòng)水化上樣，膠條溶脹時(shí)間18h。等點(diǎn)聚焦時(shí)長(zhǎng)為30 000V hr，膠條依次在平衡液1和平衡液2中震蕩浸潤(rùn)15min后轉(zhuǎn)入16%分離膠，20mA恒定電流30min，25mA恒定電流繼續(xù)電泳7.5h。電泳結(jié)束后迅速剝離凝膠，置于考馬斯亮藍(lán)染色液中，染色液配制方法參照文獻(xiàn)[12]。凝膠脫色至背景清晰后放入EXQuest spot cutter切膠系統(tǒng)，選取顯色清晰的膠點(diǎn)精細(xì)切取。

2.4 質(zhì)譜分析切取的凝膠用50mmol/L碳酸氫銨/乙腈振蕩清洗，膠粒脫色完全后用測(cè)序級(jí)胰蛋白酶37℃膠內(nèi)酶解過(guò)夜提取多肽，用Zip Tip脫鹽后合并酶解液凍干。凍干后的酶解樣品用20%乙腈完全復(fù)溶，吸取1μL和CHCA基質(zhì)溶液按2:1體積比混合后點(diǎn)樣，自然干燥后，樣品靶用氮?dú)獯祪舴湃雰x器進(jìn)靶槽，用串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（5800MALDI-TOF/ TOF，AB SCIEX）進(jìn)行測(cè)試分析。質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)：激光源為波長(zhǎng)355nm的Nd：YAG激光器，加速電壓為2kV，采用正離子反射模式和自動(dòng)獲取數(shù)據(jù)的模式采集數(shù)據(jù)，一級(jí)質(zhì)譜（MS）掃描范圍為800～000Da，選擇信噪比>50的母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜（MS/MS）分析，每個(gè)樣品點(diǎn)上選擇8個(gè)母離子，二級(jí)質(zhì)譜（MS/MS）累計(jì)疊加2500次，碰撞能量2kV。

2.5 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索質(zhì)譜原始文件用Mascot2.2軟件檢索NCBI中的有鱗目（Squamata）蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，尋找匹配的肽段序列及相關(guān)蛋白質(zhì)。搜庫(kù)參數(shù)如下：Typeofsearch：Combined（MS+MS/MS）；Enzyme：Trypsin；Fixedmodifications：Carbamidomethyl（C）；Dynamical modifications：Oxidation（M）；Mass values：Monoisotopic；PeptideMassTolerance：±100ppm；FragmentMassTolerance：±0.4Da；PeptideCharge State：1+；Max Missed Cleavages：1

3 結(jié)果與分析

3.1 多肽溶出率烘干后，藥材粉末稱重為24.817g。BAC法測(cè)定不同濃度蛋白標(biāo)準(zhǔn)液對(duì)應(yīng)的吸光度，并繪制成0～0.5mg/mL濃度區(qū)間內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.9628x-0.1201（R2=0.9978），計(jì)算醇提液中總蛋白含量為1.360g，計(jì)算肽類成分溶出率為5.48%。

3.2 凝膠電泳分析凝膠圖像顯示，蘄蛇藥材經(jīng)過(guò)稀乙醇熱浸，溶出多種肽類成分，其中2kDa左右的多肽在弱酸性、中性及弱堿性的等電點(diǎn)（PI）區(qū)間內(nèi)均有分布；在接近中性PI的區(qū)域發(fā)現(xiàn)兩個(gè)多肽膠點(diǎn)，相對(duì)分子量在15kDa（圖1，封底）。

3.3 肽段質(zhì)譜鑒定凝膠中的多肽膠點(diǎn)經(jīng)過(guò)脫色和測(cè)序級(jí)trypsin胰蛋白酶酶解后抽提膠內(nèi)的肽段，采用MALDI-TOF-TOF MS串聯(lián)質(zhì)譜分析。獲得的數(shù)據(jù)采用一級(jí)肽指紋質(zhì)量與二級(jí)肽碎片質(zhì)量綜合分析法Combin-ed（MS+MS/MS），用MASCOT在NCBI有鱗目（Squamata）蛋白質(zhì)庫(kù)進(jìn)行搜索；一、二級(jí)質(zhì)譜綜合得分及可信度參數(shù)分別設(shè)定為Protein Score≥60，Protein Score CI%≥95%。其中，從2號(hào)膠點(diǎn)酶解肽段的一級(jí)質(zhì)譜選擇質(zhì)量質(zhì)量較高的5個(gè)母離子（圖2，封底），對(duì)其碎片進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜鑒定，最終匹配到5個(gè)肽段，總分為323，屬于木紋響尾蛇（Crotalus horridus）以及東部菱背響尾蛇（Crotalus adamanteus）的骨骼肌肌動(dòng)蛋白（Actin，alpha skeletal muscle），氨基酸序列分別為GYSFVTTAER（圖3A，封底），AVFPSIVGRPR（圖3B，封底），QEYDEAGPSIVHR（圖3C，封底），IWHHTFY-NELR（圖3D，封底），SYELPDGQVITIGNER（圖3E，封底）。另外，從3號(hào)膠點(diǎn)的酶解肽段的一級(jí)質(zhì)譜圖譜中（圖4，封底）挑選信噪比> 50的母離子對(duì)其碎片進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，鑒定出一個(gè)肽段，屬于鏡王蛇（Ophiophagus ha-nnah）膠原蛋白α鏈上的一個(gè)片段，得分為66，其氨基酸序列為GESGPAGPAGPAGPAGAR（圖3F，封底）。

4 討論

已有研究[2]表明，蘄蛇每克藥材含核苷類成分0.5～1mg，總磷脂13～44mg[3]，含量較低且對(duì)其藥效尚無(wú)相關(guān)報(bào)道，只能作為考察藥材質(zhì)量的參考指標(biāo)?！睹}癥治方》[13]、《雜病廣要》[14]等古籍在用藥上特別指出用“蘄蛇肉”或“去皮骨取凈肉”，據(jù)此推測(cè)相對(duì)于皮和骨，蛇肉可能是藥效成分富集的部位。蛇類藥材以干燥全蛇入藥，總氨基酸含量很高[15]，在蛋白質(zhì)水平的研究上，通過(guò)生物酶解方法來(lái)獲取活性蛋白已經(jīng)取得一些進(jìn)展，但對(duì)于傳統(tǒng)的煎煮及酒浸方法中獲取的蛋白/多肽成分的研究尚無(wú)相關(guān)的報(bào)道。

本研究引入蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析蘄蛇乙醇提取物中的肽類成分，凝膠圖像顯示在弱酸性，中性及弱堿性的等電點(diǎn)區(qū)間內(nèi)均有多肽分布，而各區(qū)間內(nèi)的多肽等電點(diǎn)接近，推測(cè)它們是由藥材中原始的大分子蛋白溶出后受熱分解的片段和游離氨基酸隨機(jī)重排形成，這些隨機(jī)形成的肽段由20個(gè)左右的殘基組成，分子量主要集中在2kDa區(qū)域，難以在已有的數(shù)據(jù)庫(kù)中找到匹配的序列?？赡艿脑虬ǎ阂皇悄壳吧哳惖鞍讛?shù)據(jù)庫(kù)中的肽段序列信息還不夠全面；二是經(jīng)過(guò)重排后的肽段序列與天然的片段序列發(fā)生較大變化。我們計(jì)劃通過(guò)色譜純化分離后進(jìn)行Edman降解測(cè)序來(lái)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)可能的活性片段。

劉端勇等[16]認(rèn)為，蟲(chóng)蛇類動(dòng)物藥所含蛋白經(jīng)過(guò)高溫煎煮后變性分解，成為無(wú)生物活性的游離氨基酸。本研究的結(jié)果表明以上觀點(diǎn)并不準(zhǔn)確。對(duì)凝膠上10-15kDa范圍內(nèi)的兩個(gè)多肽膠點(diǎn)膠內(nèi)酶切后進(jìn)行質(zhì)譜分析和蛋白數(shù)據(jù)檢索，高置信度匹配木紋響尾蛇和東部菱背響尾蛇的α骨骼肌蛋白中的多個(gè)肽段序列，這表明蘄蛇干燥藥材中的蛋白在溶出過(guò)程中并未完全降解，除了游離氨基酸，還存在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的肽類成分。近年研究顯示，β-actins是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的一類重要致病性抗原[17-18]，而actin家族成員間序列高度同源。由此推測(cè)，這些多肽片段可能與特異性抗原的耐受相關(guān)。此外還從三號(hào)凝膠點(diǎn)匹配到眼鏡王蛇（Ophiophagus hannah）膠原蛋白α鏈上由18個(gè)殘基組成的一個(gè)肽段。我們注意到這一片段中包含一段完整的抗原表位的核心序列GPAGTAGAR，研究顯示這一序列具有免疫原性，但無(wú)致關(guān)節(jié)炎性[19]。

［1］明.張介賓.景岳全書(shū)（下冊(cè)）［M］.上海：第二軍醫(yī)大學(xué)出版社，2006：1166，

［2］丁興紅.HPLC法測(cè)定蘄蛇中核苷類成分的研究［J］.浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，35（6）：906-908.

［3］林秀玉，李可強(qiáng).商品藥材蘄蛇中總磷脂含量的比較研究［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2009，36（11）：1959-1961.

［4］丁興紅，丁志山，范永升.人工飼養(yǎng)蘄蛇與野生蘄蛇中重金屬元素及氨基酸含量的比較研究［J］.氨基酸和生物資源，2012，34（1）：51-53.

［5］劉訓(xùn)紅,曹洪生.7種蛇類藥材的等電點(diǎn)鑒別研究［J］.中國(guó)中藥雜志，1992，17（6）：329-330.

［6］谷恒存，胡金波，丁志山，等.蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白的提取和鑒定表征［J］.中國(guó)中藥雜志，2013，（21）：3672-3675.

［7］谷恒存，胡金波，丁志山，等.蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白對(duì)CIA大鼠的治療作用［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013，31（10）：2207-2209.

［8］柴士偉，董改英，瞿晶田，等.正交試驗(yàn)優(yōu)選蘄蛇煎煮工藝［J］.中國(guó)藥房，2015，（25）：3569-3571.

［9］張凌怡，王兵兵，上官露露，等.蛋白質(zhì)組學(xué)中的固定化酶反應(yīng)器制備的研究進(jìn)展［J］.色譜，2015（11）.1121-1125.

［10］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典1部［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄62.

［11］Valente KN，Choe LH，Lenhoff AM，et al.Optimization of protein sample preparation for two-dimensional electrophoresis［J］.Electrophoresis，2012，33（13）：1947-1957.

［12］Candiano G，Bruschi M，Musante L，et al.Blue silver：a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis［J］.Electrophoresis，2004，25（9）：1327-1333.

［13］明.吳正倫.脈癥治方卷一［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1992：20.

［14］周德生，陳新宇.《雜病廣要》釋義［M］.太原：山西科學(xué)技術(shù)出版社，2010：931.

［15］王義權(quán),周開(kāi)亞.蛇類藥材的氨基酸分析［J］.基層中藥雜志，1996，10（3）：25-26.

［16］劉端勇，趙海梅，程紹民，等.不同方法炮制蟲(chóng)類中藥治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的啟示［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011，（09）：2241-2242.

［17］Van Beers JJ，Schwarte CM，Stammen-Vogelzangs J，et al.The rheumatoid arthritis synovial fluid citrullinome reveals novel citrullinated epitopes in apolipoprotein E，myeloid nuclear differentiation antigen，and β-actin［J］. Arthritis&Rheumatism，2013，65（1）：69-80.

［18］Darrah EA，Rosen J，Giles T，et al.Peptidylarginine deiminase 2，3 and 4 have distinct specificities against cellular substrates：novel insights into autoantigen selection in rheumatoid arthritis［J］.Annals of the rheumatic diseases，2012，71（1）：92-98.

［19］Tang B，Brand DD，Ma Z，et al.Pathogenesis of collagen induced arthritis：modulation of disease by arthritogenic T-cell epitope location［J］.Immunology，2004，113（3）：384-391.

（收稿：2016-10-26修回：2016-12-04）

Proteomatic Analysis of Peptides from Qishe Ethanol Extract

LIN Chen,WEN Chengping,FAN Yongsheng TCM Clinical and Experimental Institute,Basic Medical College,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou (310053),China

ObjectiveTo investigate peptides contained within the ethanol extracts of Chinese herb Qishe（Agkistrodon acutus（Guenther））by a proteomic analysis.MethodsEthanol extracts of Qishe were produced following steps recorded in the Chinese pharmacopeia.Polypeptides within the samples were initially separated by two-dimensional electrophoresis.Valid spots were cut and trypsin-proteolysed,and were analyzed using TOF-TOF mass spectrometry,data from which were searched in the database to establish the identification.ResultsExtraction rate was 5.48%per gram crude medicine.Polypeptides separated by electrophoresis mainly distributed at 2kDa mark area, indicating their composition of 15-20 amino acids.Produced mass data from two gel spots within 10-15kDa mark area were identified in the database as fragments of skeletal alpha（α）-actin and Type I collagen.ConclusionHeating of ethanol is effective to produce extracts containing polypeptides from Qishe.

agkistrodon acutus;polypeptides;proteomics;electrophoresis;mass spectrometry

浙江中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)科研基金人才專項(xiàng)項(xiàng)目（No.2013ZR01）；浙江省教育廳一般科研項(xiàng)目（No.Y201430952）

浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)研究所（杭州31 0053）

林晨，Tel：13588825780；E-mail：linchen@zcmu.edu.cn