孫真真，楊俊花，郭文博，陳慧英，趙志輝

（1上海海洋大學食品學院，上海 201306；2上海市農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準與檢測技術研究所，上海 201403）

翅靜脈注射DON、FB1、OTA、ZEN毒素對蛋雞生產(chǎn)性能和血液指標的影響

孫真真1，2，楊俊花2*，郭文博1，2，陳慧英1，2，趙志輝2

（1上海海洋大學食品學院，上海 201306；2上海市農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準與檢測技術研究所，上海 201403）

研究了翅靜脈分別注射0.5 mg/kg.BW嘔吐毒素（Deoxynivalenol，DON）、伏馬毒素B1（Fumonisin B1，F(xiàn)B1）、赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）毒素純品對蛋雞生產(chǎn)性能、血常規(guī)及血液生化指標的影響。結(jié)果表明：毒素處理組產(chǎn)蛋率均顯著下降，軟破殼蛋率均顯著升高，DON、OTA和ZEN組采食量顯著降低。血常規(guī)指標中，毒素處理組PLT較對照均顯著降低，其中ZEN組尤為明顯；FB1組WBC、LY、MO和GR較對照顯著升高，而其他處理組無顯著變化。血清生化指標中，4種毒素分別導致蛋雞ALP和GLUC指標較對照顯著降低，而ALT、AST和TBIL則顯著升高?？梢姡犰o脈注射DON、FB1、OTA和ZEN毒素均可使蛋雞生產(chǎn)性能下降，血小板數(shù)目減少，對肝臟、腎臟功能造成一定程度損傷，其中ZEN對蛋雞生產(chǎn)性能、凝血系統(tǒng)以及肝臟、腎臟功能的危害最為嚴重。

霉菌毒素；蛋雞；靜脈注射；生產(chǎn)性能；血液指標

霉菌毒素（Mycotoxin）是由鐮刀菌屬、青霉菌屬和曲霉菌屬等絲狀真菌（Filamentous fungi）在合適環(huán)境下產(chǎn)生的有毒次級代謝物質(zhì)［1］，常見的有黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFB）、伏馬毒素（Fumonisin，F(xiàn)B）、赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）等400余種［2］，具有毒性強、污染頻率高等特點，廣泛污染玉米、小麥等農(nóng)作物和飼料原料［3］。飼喂被霉菌毒素污染的飼料可使動物出現(xiàn)多種不良生理反應，如AFB1造成肝臟損傷、DON影響動物采食量和胃腸道健康、FB1引起肺水腫、OTA導致腎臟損傷、ZEN易引起過敏反應等［4］。此外，過量或長期低劑量的霉菌毒素暴露，還會導致霉菌毒素及其代謝產(chǎn)物在畜禽體內(nèi)殘留蓄積，進而通過肉、蛋、奶等動物性產(chǎn)品進入人體危害人類健康［5］。蛋雞作為畜牧業(yè)中最常見的生產(chǎn)動物，攝入被霉菌毒素污染的日糧會出現(xiàn)采食量減少、生產(chǎn)性能和飼料轉(zhuǎn)化率下降［6-9］、免疫功能損傷等變化［7］。由于霉菌毒素標準品價格昂貴，因此已有研究大多基于自然霉變飼料，存在多種霉菌毒素聯(lián)合污染、成分復雜多變等不確定因素，在很大程度上限制了不同霉菌毒素對蛋雞毒性作用研究的進展。此外，目前多數(shù)相關研究采用口服給藥途徑，雖然簡單方便，但不能保證準確的暴露劑量且動物個體間服藥量存在較大差異，而翅靜脈注射給藥可使藥物直接進入血液循環(huán)，藥效快、損耗小，可保證達到較高血藥濃度前提下降低實驗成本。因此，本研究選用DON、FB1、OTA和ZEN 4種霉菌毒素標準品，通過靜脈注射給藥來分析不同霉菌毒素對蛋雞生產(chǎn)性能、血常規(guī)和血清生化指標的影響，同時比較不同種霉菌毒素對蛋雞的毒性作用及其差異，以期為霉菌毒素對蛋雞的毒理學研究提供重要的依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器

DON、FB1、OTA和ZEN真菌毒素標準品：白色粉末，純品含量大于99%（Pribolab，新加坡），購自北京普華仁生物技術開發(fā)有限公司。DON、FB1粉末均溶于無菌生理鹽水，OTA和ZEN粉末以二甲基亞砜為助溶劑，無菌生理鹽水稀釋終濃度為5%。肝素鈉、18＃Y型留置針、醫(yī)用彈力繃帶購自蘇州靈巖醫(yī)療器械有限公司。

HB系列全自動血細胞分析儀（英諾華，中國），Au5800全自動血液生化分析儀（Beckman，美國），Sorvall高速離心機（Thermo，德國）。

1．2 動物飼養(yǎng)管理及試驗設計

隨機選擇21周齡健康、體重和產(chǎn)蛋率相近的海蘭褐蛋雞100只，選用2層階梯籠養(yǎng)，每籠1只，按照蛋雞封閉式養(yǎng)殖場規(guī)定進行飼養(yǎng)，保證每天充足光照16 h，室溫16—20℃，濕度50%—60%。每日8：00人工喂料一次，自由采食、充足清潔飲水，預試期2周。

試驗開始前，每只雞翅靜脈安裝18＃Y型留置針，醫(yī)用彈力繃帶固定，適應期3 d。將蛋雞隨機分為5組，每組設4個重復，每個重復5只。每日下午15：00，各組蛋雞分別經(jīng)翅靜脈留置針注射無菌生理鹽水（對照組）、DON（DON組）、FB1（FB1組）、OTA（OTA組）、ZEN（ZEN組），各毒素劑量均為0.5 mg/kg.BW，之后注入100 μL肝素鈉抗凝，試驗持續(xù)一周。

蛋雞飼喂基礎日糧（表1）參照雞的飼養(yǎng)標準（NY/T 33—2004）并結(jié)合羅愛瓊等［10］研究配制。

表1 基礎日糧組成及營養(yǎng)水平（風干基礎）Table l Composition and nutrient levels of the basal diet（air dry basis）%

1．3 樣品采集與制備

試驗第8天，每組每個重復隨機選擇3只雞用真空管翅靜脈采集血液5 mL，1 mL加肝素鈉抗凝并快速進行血常規(guī)指標分析；剩余4 mL以4 000 r/min離心10 min，收集血清，－20℃冷凍保存待用。試驗第15天重復采樣。

1．4 樣品檢測

1.4.1 生產(chǎn)性能

試驗期間，詳細記錄每天的蛋重、產(chǎn)蛋數(shù)、軟破殼蛋數(shù)量及每日耗料量，計算日產(chǎn)蛋率、料蛋比等生產(chǎn)性能指標，計算公式參照羅愛瓊等［10］。

1.4.2 血常規(guī)指標測定

白細胞數(shù)（WBC）、血紅蛋白含量（HGB）、血小板（PLT）等13項血常規(guī)指標采用全自動血細胞分析儀進行測定。

1.4.3 血清生化指標測定

總蛋白（TP）、總膽紅素（TBIL）、堿性磷酸酶（ALP）等9項血清生化指標采用全自動生化分析儀進行測定。

1．5 數(shù)據(jù)分析

差異顯著性檢驗采用SPSS 19.0軟件中的單因素方差分析（One-way ANOVA）進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進行Duncan氏多重比較，以P＜0.05為差異顯著，所有結(jié)果均表示為平均值±標準誤。

2 結(jié)果與分析

2．1 翅靜脈注射DON、FB1、OTA和ZEN對蛋雞生產(chǎn)性能的影響

由表2可知，DON、FB1、OTA、ZEN組產(chǎn)蛋率均顯著低于對照組，其中OTA、ZEN組產(chǎn)蛋率較FB1和DON組顯著下降，且FB1組顯著低于DON組。DON、OTA、ZEN組采食量均顯著低于對照組。DON和ZEN組產(chǎn)蛋重較對照組顯著降低。DON組料蛋比顯著高于對照組。DON、FB1、OTA、ZEN組蛋雞軟破殼蛋率均顯著高于對照組，且OTA、ZEN組顯著高于DON、FB1組，F(xiàn)B1組顯著高于DON組。分析可得，OTA、ZEN對蛋雞生產(chǎn)性能的毒性作用較大，F(xiàn)B1次之，DON較小，但仍有顯著性影響。

表2 DON、FB1、OTA、ZEN對蛋雞生產(chǎn)性能的影響Table 2 Effects of DON，F(xiàn)B1，OTA and ZEN on the growth performance of laying hens

2．2 翅靜脈注射DON、FB1、OTA和ZEN對血常規(guī)指標的影響

由表3可知，翅靜脈注射DON，RBC、PLT二周組顯著低于對照組和一周組，PLT一周組較對照組也顯著降低；HCT、MCHC一周組較對照組均顯著降低，其中HCT二周組較對照組也顯著降低；而MPV二周組較對照組顯著升高。FB1組WBC、LY、MO、GR一周、二周組較對照組均顯著升高，其中WBC、GR二周組還顯著高于一周組；PLT對照組、一周、兩周組依次顯著降低；MPV二周組仍顯著高于對照組。OTA組PLT對照組、一周、二周組依次顯著降低；MPV二周組較對照組顯著升高。ZEN組MCHC、PLT一周組較對照組顯著降低，其中PLT二周組也顯著低于對照組；MPV、PDW二周組較對照組均顯著升高，MPV一周組還顯著高于對照組。

翅靜脈注射DON、FB1、OTA、ZEN一周后，F(xiàn)B1組WBC、LY、MO顯著高于對照組、DON、OTA和ZEN組，GR顯著高于DON和OTA組；HCT則DON組顯著低于其他各組；MCHC指標DON和ZEN組分別顯著低于對照組、FB1和OTA組；與對照組相比，毒素處理組PLT均顯著降低，其中ZEN組還顯著低于DON、FB1和OTA組；MPV參數(shù)ZEN組較對照組和DON組顯著升高。試驗第二周，WBC、LY、MO、GR等指標FB1組顯著高于其他各組；RBC、HCT則DON組較對照組明顯降低；與對照組相比，毒素處理組PLT均顯著降低，并且ZEN組PLT在兩周內(nèi)為急劇連續(xù)下降；PDW指標ZEN組較對照組也顯著升高。分析可得，F(xiàn)B1顯著影響蛋雞血液WBC、LY等多個參數(shù)，ZEN對蛋雞血液PLT有較大毒性作用，并且在空白代謝期內(nèi)無恢復跡象；DON、OTA對蛋雞血液的毒性作用次之。

表3 DON、FB1、OTA和ZEN對蛋雞血常規(guī)指標的影響Table 3 Effects of DON，F(xiàn)B1，OTA and ZEN on blood routine indices of laying hens

2．3 翅靜脈注射DON、FB1、OTA、ZEN對血清生化指標的影響

由表4可知，DON一周組ALP、GLUC較對照組顯著降低，而ALT、AST、TBIL較對照組顯著升高，此外二周組ALP、GLUC顯著低于對照組，ALT則升高。FB1組和OTA組與對照組相比，一周組ALP、GLUC顯著降低，ALT、AST、UREA、TBIL則顯著升高；二周組ALP較對照組均明顯降低，ALT則明顯升高。ZEN組ALP、GLUC一周組較對照組均顯著降低，ALT、AST、UREA、CRE、TBIL均顯著升高；二周組ALP、GLUC參數(shù)較對照組顯著降低，ALT則顯著升高。

表4 DON、FB1、OTA和ZEN對蛋雞血清生化指標的影響Table 4 Effects of DON，F(xiàn)B1，OTA and ZEN on the serum biochemical indices of laying hens

分別注射DON、FB1、OTA、ZEN一周后，DON、FB1、OTA、ZEN組ALP、GLUC較對照組均顯著降低；而ALT、AST、TBIL均明顯提高；與對照組相比，F(xiàn)B1、OTA、ZEN組UREA均顯著升高，ZEN組CRE也顯著提高。試驗第二周，各處理組ALP均顯著低于對照組，且OTA組還顯著低于DON、ZEN組；此外，各處理組ALT參數(shù)均明顯高于對照組；DON、ZEN組GLUC較對照組均明顯下降。分析可得，ZEN對蛋雞大多數(shù)血液生化指標均有顯著毒性作用，且ALP、ALT、GLUC等參數(shù)在空白代謝期內(nèi)無恢復跡象；DON、FB1、OTA對蛋雞血液生化毒性作用次之。

3 討論

3．1 翅靜脈注射DON、FB1、OTA、ZEN對蛋雞生產(chǎn)性能的影響

本研究在保證試驗各項條件一致的情況下注射相同劑量的不同毒素，DON組采食量降低并觀察到有嘔吐物，可能是DON造成大腦血清素分泌失調(diào)而影響食欲，也損害了胃腸道黏膜和絨毛而導致吸收受阻［11］，而產(chǎn)蛋率的降低與采食量降低密切相關，還與應激造成營養(yǎng)素吸收抑制有關，進而降低了飼料利用率。這與HAMILTON等［12］報道結(jié)果一致，DON致蛋雞產(chǎn)蛋率和采食量下降。但KUBENA等［13］報道DON對蛋雞產(chǎn)蛋量和雞蛋品質(zhì)并無影響。出現(xiàn)這種不同結(jié)論可能是前人研究大多基于自然霉變飼料飼喂蛋雞，而飼料中成分復雜多變，可能會存在對DON毒素有吸附或者解毒作用的成分，本研究是以DON純品對蛋雞進行翅靜脈注射，可以準確確定暴露劑量，更加明確了DON單一因素對蛋雞產(chǎn)蛋性能的作用。翅靜脈注射FB1引起蛋雞采食量顯著下降，軟破殼蛋率顯著升高。金海濤等［14］研究表明，日糧中添加FB1明顯抑制了雞的采食和降低了飼料轉(zhuǎn)化率，與本研究結(jié)果一致。OTA使蛋雞產(chǎn)蛋率和采食量顯著降低，軟破殼蛋率顯著升高，與ELAROUSSI等［15］研究結(jié)果一致。此外，HAMILITON等［16］也指出OTA可使蛋雞采食量降低20%，蛋殼強度、產(chǎn)蛋率和飼料利用率均有降低。同時，翅靜脈注射ZEN亦顯著降低蛋雞生產(chǎn)水平。目前還未有ZEN對蛋雞生產(chǎn)性能影響的報道，但ALLEN等［17］在火雞的研究中未發(fā)現(xiàn)ZEN對體增重和釆食量產(chǎn)生影響，這可能是海蘭褐蛋雞較火雞對ZEN的毒性更敏感。DON、FB1、OTA、ZEN組軟破殼蛋率較對照組均顯著升高，其中OTA和ZEN組影響最為顯著，可能是因為毒性作用導致蛋殼強度下降而使得蛋雞軟破殼蛋率顯著升高。ZEN對蛋雞產(chǎn)蛋性能的毒性作用最為嚴重，可能不僅僅是因為由營養(yǎng)吸收障礙引起的采食量下降，還有可能是ZEN具有較強的生殖毒性而顯著影響了蛋雞的產(chǎn)蛋性能［18］。

3．2 翅靜脈注射DON、FB1、OTA、ZEN對蛋雞血常規(guī)的影響

血常規(guī)是評價動物健康情況的重要指標之一，并且血常規(guī)各項指標可較確切地報告病況［19］。血小板對止血、免疫等生理及病理過程具有關鍵作用，PLT顯著減少會引起機體的凝血功能下降［20-21］。本研究中對蛋雞翅靜脈注射DON、FB1、OTA、ZEN純品一周停藥后，第二周恢復階段PLT仍持續(xù)降低，說明DON、FB1、OTA、ZEN對蛋雞凝血系統(tǒng)損害影響的持續(xù)時間較長。有研究顯示，喂食OTA污染日糧可對肉雞血常規(guī)指標產(chǎn)生明顯影響，且OTA濃度越大，對其作用越顯著［22］。本研究中OTA處理組蛋雞PLT一周和二周時較對照組均顯著降低，表明OTA可嚴重損害蛋雞的凝血功能，這是由于OTA可與血液中白蛋白結(jié)合并在膽汁和腎臟中不斷循環(huán)，致使OTA在蛋雞體內(nèi)半衰期較長［16］。ZEN處理組蛋雞在一周時PLT較對照組甚至其余處理組均顯著降低，且該組注射一周PLT即降低59.09%，在第二周降低71.87%，表明ZEN對蛋雞凝血系統(tǒng)損傷最為嚴重，這可能是由于ZEN具有極強的血液毒性［23］。此外，DON組蛋雞RBC、HCT、MCHC顯著降低，與霍星華等［24-25］研究報道一致；FB1處理組中蛋雞WBC、LY、MO、GR顯著升高，說明FB1可使蛋雞發(fā)生嚴重的炎癥反應。

3．3 翅靜脈注射DON、FB1、OTA、ZEN對蛋雞血液生化指標的影響

血清生化是表明機體營養(yǎng)吸收情況和各組織器官健康狀態(tài)的關鍵指標［26］。本試驗表明，翅靜脈注射DON、FB1、OTA、ZEN純品一周后，各組均引起蛋雞ALP、GLUC顯著下降，ALT、AST、TBIL顯著增高。在停藥一周后，各處理組AST、UREA、CRE、TBIL均恢復到正常水平，而ALP、ALT仍與對照組表現(xiàn)出顯著差異。FB1組和OTA組中蛋雞ALP、GLUC均顯著降低，ALT、AST、UREA、TBIL均顯著升高，這與WEIBKING等［27］關于FB1研究結(jié)果一致，也與HAMILITON等［16］關于OTA研究結(jié)果一致。ZEN組中蛋雞ALP、GLUC均顯著降低，ALT、AST、UREA、CRE、TBIL均顯著升高，該組各個指標變化最為明顯，影響最為顯著，與?ONKOVá等［28］和?PERANDA等［29］報道一致，有力證實了ZEN對肝臟及腎臟的毒害作用。

ALP是與機體應激性有關的免疫指標，4個處理組中ALP顯著降低，說明DON、FB1、OTA、ZEN均降低了蛋雞自身的免疫功能。血清中ALT、AST是反映肝臟功能的關鍵指標，當肝臟產(chǎn)生病變時細胞膜通透性升高而導致其快速釋放［30］，4個處理組中ALT、AST顯著升高，說明DON、FB1、OTA、ZEN均造成蛋雞肝臟明顯損傷。UREA是機體蛋白質(zhì)代謝情況的一個重要指標，UREA含量上升時表明機體氮沉積量下降或腎功能異常［31］。腎小球濾過率決定了CRE變化規(guī)律，腎功能降低時就可導致CRE在機體內(nèi)蓄積，如果觀察到UREA與CRE同時增加表明腎臟損傷較嚴重［32］。本試驗中FB1、OTA、ZEN引起蛋雞UREA顯著升高，ZEN還引起蛋雞CRE顯著升高，說明FB1、OTA、ZEN使蛋雞的腎臟受損，而ZEN導致蛋雞嚴重的腎損害。4個處理組中TBIL的顯著升高表明蛋雞肝細胞被破壞，肝功能受損［33］，這與肝功能受損時ALP、ALT、AST變化規(guī)律一致。4個處理組中GLUC顯著降低，原因可能是DON、FB1、OTA、ZEN損傷蛋雞腸道黏膜而破壞了蛋雞體內(nèi)糖吸收與利用的平衡關系，進而致使蛋雞腸道對糖類物質(zhì)的吸收障礙［10］。兩周后4個處理組ALP水平仍顯著降低，ALT仍顯著升高，進一步說明了DON、FB1、OTA、ZEN對機體免疫功能和肝臟的損害較為嚴重，且恢復緩慢。

4 結(jié)論

4.1 翅靜脈注射DON、FB1、OTA、ZEN純品均顯著降低了蛋雞的生產(chǎn)性能，其中OTA和ZEN毒性作用較強。

4.2 翅靜脈注射DON、FB1、OTA、ZEN純品對蛋雞血小板數(shù)目影響最為顯著，嚴重損害蛋雞的凝血系統(tǒng)，其中ZEN毒性最強，應激反應最強烈。

4.3 翅靜脈注射DON、FB1、OTA、ZEN純品影響蛋雞血液生化指標主要表現(xiàn)在染毒期，除ALP、ALT外，對后期其他血液生化指標無顯著影響，空白代謝期血液生化指標的影響主要是染毒期效應的延續(xù)，說明DON、FB1、OTA、ZEN均造成蛋雞肝臟、腎臟功能損傷，但在空白代謝期蛋雞通過自身代謝和免疫有一定的恢復，其中ZEN對蛋雞血液生化指標影響最為顯著且恢復緩慢，對蛋雞危害最為嚴重。

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（責任編輯：閆其濤）

Effects of injecting DON，F(xiàn)B1，OTA and ZEN by wing vein on the growth performance，blood indices of laying hens

SUN Zhen-zhen1，2，YANG Jun-hua2*，GUO Wen-bo1，2，CHEN Hui-ying1，2，ZHAO Zhi-hui2
（1College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2Institute of Quality Standard and Testing Technology for Agriculture Products，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201403，China）

The effects of injecting the same dose（0.5 mg/kg.BW）of DON，F(xiàn)B1，OTA and ZEN pure toxin respectively by wing vein on the growth performance，blood routine indices and serum biochemical indices of laying hens were studied.The results showed that laying rates of all toxin treatment groups decreased significantly，the broken and soft shell egg ratios increased significantly，and feed intake reduced significantly in DON，OTA and ZEN groups.In blood routine indices，compared with the control，PLT of toxin treatment groups reduced significantly，especially in ZEN group；WBC，LY，MO and GR of FB1treatment group increased significantly，while there was no significant change in other treatment groups.In serum biochemical indices，ALP and GLUC of toxin treatment groups were significantly lower than those of the control，but ALT，AST and TBIL were significantly higher than those of the control.So，the wing vein injection of DON，F(xiàn)B1，OTA and ZEN toxin could reduce the growth performance of layers and PLT，and damage the liver and kidney function to a certain extent，and ZEN was the most serious treatment.

Mycotoxin；Laying hens；Intravenous injection；Growth performance；Blood index

S831.4

A

1000-3924（2016）06-143-07

2015-11-05

上海市科技興農(nóng)重點攻關項目：真菌毒素對畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估關鍵技術研究［滬農(nóng)科攻字（2013）第3-8號］；上海市農(nóng)委青年人才成長計劃［滬農(nóng)青字（2015）第1-33號］；農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項：飼料高效低耗加工技術研究與示范（201203015）

孫真真（1990—），女，在讀碩士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全評估。E-mail：sunzhenpaomo＠163.com

*通信作者，E-mail：yangjunhua303＠126.com