鮑大鵬，馬元偉，2，王 榮，劉敏祥，茅文俊，汪 瀅*

（1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海 201403；2上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

蛹蟲草凝集素編碼基因JRL-ccm4的初步研究

鮑大鵬1，馬元偉1，2，王 榮1，劉敏祥1，茅文俊1，汪 瀅1*

（1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海 201403；2上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

通過對(duì)蛹蟲草基因組數(shù)據(jù)挖掘，發(fā)現(xiàn)Jacalin類凝集素編碼基因JRL-ccm4，進(jìn)而對(duì)該基因及其編碼產(chǎn)物進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，通過原核異源表達(dá)獲得凝集素蛋白JRL-ccm4，并檢測了表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性測定；通過RT-PCR對(duì)不同生長時(shí)期的蛹蟲草樣品中JRL-ccm4基因的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。研究結(jié)果表明：JRL-ccm4蛋白有一個(gè)JRL結(jié)構(gòu)域，能在原核細(xì)胞中成功表達(dá)；異源表達(dá)的JRL-ccm4蛋白具有抑制金黃色葡萄球菌的活性，有一定抑制人宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖的活性；原基期JRL-ccm4基因表達(dá)水平最高，是菌絲期的3.49倍，是子實(shí)體時(shí)期的2.39倍，表明JRL-ccm4基因可能參與蛹蟲草子實(shí)體形成過程。

蛹蟲草；凝集素；生物信息學(xué)分析；異源表達(dá)；基因功能

蛹蟲草（Cordyceps militaris）又名北蟲草，屬于子囊菌門（Ascomycota）、麥角菌目（Clavicipitales）、麥角菌科（Cordyceps）?，F(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)研究表明，蛹蟲草具有抗疲勞、抗缺氧、抗衰老、以及增強(qiáng)人體非特異性免疫系統(tǒng)的作用［1］，并對(duì)S180艾氏腹水瘤有明顯的抑制效果，同時(shí)對(duì)化療藥物環(huán)磷酰胺具有增效和降低毒性作用［2］。

凝集素是一種非免疫來源的糖結(jié)合蛋白，能使細(xì)胞凝集或糖綴合物（glycoconjugate）沉淀［3］。凝集素是食藥用真菌中重要的活性成分，大型真菌中含有種類豐富的凝集素，對(duì)其開展的研究越來越受到關(guān)注。Jacalin類凝集素（Jacalin-related lectins，JRLs）在植物中是一類能夠與內(nèi)源糖類化合物結(jié)合的非經(jīng)典型凝集素，研究表明，這類凝集素在植物中能夠響應(yīng)生物或非生生物脅迫刺激，參與細(xì)胞調(diào)控與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，行使內(nèi)源功能［4］，與經(jīng)典凝集素在功能上有著明顯區(qū)別［5］。在食、藥用真菌中，Jacalin類凝集素首先在灰樹花（Grifola frondosa）中被發(fā)現(xiàn)，深入研究表明其最大凝集活性表現(xiàn)在子實(shí)體階段，在菌絲及原基中凝集活性較低［6］。但是目前對(duì)食藥菌中Jacalin類凝集素的功能還缺少深入研究。

在前期工作，本研究團(tuán)隊(duì)從蛹蟲草基因組中通過數(shù)據(jù)挖掘獲得了一個(gè)編碼Jacalin類凝集素的基因，在此基礎(chǔ)上，本研究對(duì)該凝集素編碼基因進(jìn)行了原核異源表達(dá)，構(gòu)建了高效異源表達(dá)體系，檢測了異源表達(dá)的凝集素的生物活性，并測定了蛹蟲草不同生長時(shí)期該凝集素編碼基因的表達(dá)水平，為進(jìn)一步深入研究和利用蛹蟲草凝集素提供了有力的科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

1.1.1 供試菌株 蛹蟲草CM-01由中科院上海植物生理生態(tài)研究所王成樹實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑 PDA培養(yǎng)基：土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

PDB培養(yǎng)基：土豆200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

丙烯酰胺、N，N-亞甲叉丙烯酰胺、IPTG、SDS、考馬斯亮藍(lán)R-250、過硫酸銨、甘氨酸、Tris試劑均購自國藥集團(tuán)；蛋白酶抑制劑、反轉(zhuǎn)錄及RT-PCR試劑盒、內(nèi)切酶、DNA T4連接酶和高保真DNA聚合酶均購自大連寶生物工程有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、蛋白定量檢測試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒和RNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；表達(dá)菌株BL21購自上海生工生物工程有限公司；引物合成和基因測序均由上海生工生物工程有限公司完成。

1．2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蛹蟲草JRL-ccm4基因的生物信息學(xué)分析 根據(jù)對(duì)蛹蟲草基因組測序分析，確定出甘露糖結(jié)合凝集素編碼基因JRL-ccm4（GenBank：XM-006666406）［7］，采用Protparam軟件對(duì)該基因編碼的凝集素蛋白的基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析預(yù)測；采用SignalP 4.1 Server進(jìn)行凝集素蛋白信號(hào)肽預(yù)測與分析；采用InterPro對(duì)凝集素蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析；運(yùn)用NetNGlyc 1.0 Server分析凝集素蛋白糖基化位點(diǎn)；利用ClustalX的Muscle比對(duì)方法進(jìn)行同源比對(duì)，參數(shù)為默認(rèn)值；通過TMHMM Sevrver 2.0軟件對(duì)凝集素蛋白的跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測和分析，并采用TargetP 1.1 Sever軟件對(duì)凝集素蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測［8］。

1.2.2 蛹蟲草JRL-ccm4基因的擴(kuò)增與原核表達(dá) 用25℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)4 d的蛹蟲草菌絲提取RNA，以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA作為模板采用高保真DNA聚合酶擴(kuò)增出凝集素JRL-ccm4基因，經(jīng)EcoRI酶切，純化后用T4連接酶連接到經(jīng)EcoRI消化的pET32a載體上，測序驗(yàn)證連入方向及表達(dá)閱讀框正確后，將表達(dá)載體pET-JRL-ccm4轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21中；挑取陽性克隆，用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，菌液以1∶50擴(kuò)大培養(yǎng)200 mL，37℃培養(yǎng)至OD600nm＝0.4—0.6，加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，16℃誘導(dǎo)表達(dá)12 h。

1.2.3 重組蛹蟲草凝集素蛋白JRL-ccm4的提取 8 000 r/min、4℃離心5 min，收集誘導(dǎo)表達(dá)的菌體，加1 mL PBS重懸，加入5 μL蛋白酶抑制劑，用液氮速凍后進(jìn)行研磨，用5 mL PBS沖洗研缽，收集沖洗液置于離心管，12 000 r/min、4℃離心15 min，收集上清和沉淀。SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達(dá)情況，經(jīng)細(xì)菌過濾器除菌后置于－20℃保存。

1.2.4 重組蛹蟲草凝集素蛋白JRL-ccm4抑菌活性測定 固體LB培養(yǎng)基融化后，待溫度降至50℃時(shí)，以1%的接種量加入過夜培養(yǎng)的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌菌液，混勻后立即倒平板，待平板凝固后在表面滴加2 μL蛋白提取液，以空載體表達(dá)產(chǎn)物作為陰性對(duì)照，用氨芐青霉素作為陽性對(duì)照，將平板置于37℃培養(yǎng)10 h后觀察結(jié)果。

1.2.5 重組蛹蟲草凝集素蛋白JRL-ccm4抑制人宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖試驗(yàn) 收集生長至對(duì)數(shù)期的HeLa細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至5×104個(gè)/mL，加入96孔板（100 μL/孔）后，置5%CO2下，37℃孵育至細(xì)胞單層鋪滿孔底，加入蛋白提取液，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)。5%CO2，37℃孵育24 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞長勢(shì)。每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；然后小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩5 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀測量570 nm處各孔的吸光值。

1.2.6 蛹蟲草不同生長時(shí)期JRL-ccm4基因表達(dá)的相對(duì)定量 25℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)4 d的蛹蟲草菌絲，過濾收集后置于－80℃保存；濾液中包含了大量芽生孢子，取200 μL濾液注射至單個(gè)蠶蛹，置于25℃培養(yǎng)20 d至蟲體長出菌絲體后，轉(zhuǎn)至22℃光照培養(yǎng)箱誘導(dǎo)原基形成，然后收集原基置于－80℃保存；繼續(xù)培養(yǎng)30 d至子實(shí)體成熟，收集子實(shí)體，同時(shí)提取菌絲、原基、子實(shí)體的總RNA，采用兩步法進(jìn)行熒光定量PCR。

提取樣品總RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA備用，選用微管蛋白基因（Tubulin）作為內(nèi)參基因，使用DNAMAN軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（表1）。反應(yīng)體系（20 μL）為：2×SYBR Premix Ex Taq 10.0 μL，10 μmol/L的上下游引物各0.8 μL，cDNA模板2 μL，ROX Reference Dye（50×）0.4 μL，ddH2O 6 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃，5 min；95℃30 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。

表1 熒光定量PCR使用引物Table 1 Primer for RT-PCR

2 結(jié)果與分析

2．1 蛹蟲草JRL-ccm4基因的生物信息學(xué)分析

蛹蟲草JRL-ccm4基因序列為2 292 bp，根據(jù)cDNA序列推導(dǎo)出所編碼的凝集素蛋白JRL-ccm4的氨基酸序列，共有764個(gè)氨基酸殘基，分別在186、376、523位氨基酸殘基處有糖基化位點(diǎn)，530—550位預(yù)測可能有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，JRL-ccm4蛋白分子量為83.35kDa，理論等電點(diǎn)（pI）為8.76，不穩(wěn)定系數(shù)為46.57，脂肪系數(shù)為71.69；無信號(hào)肽，亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示該凝集素蛋白在線粒體基質(zhì)中，置信度為76.2%。從第630—764個(gè)氨基酸殘基位置為保守結(jié)構(gòu)域；將蛹蟲草凝集素蛋白JRL-ccm4氨基酸序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行蛋白質(zhì)同源性檢索，用ClustalX比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與來源于布氏蟲草（C.brongniartii）、鐮刀菌（Fusarium langsethiae）、綠僵菌（Metarhizium brunneum）的凝集素蛋白相似性分別達(dá)到83.42%、55.64%和58.25%。由此可見，蛹蟲草JRL-ccm4基因編碼的蛋白JRL-ccm4與真菌凝集素蛋白家族具有同源性，可以判定為是一種新的真菌凝集素蛋白。

2．2 蛹蟲草JRL-ccm4基因的擴(kuò)增與原核表達(dá)

利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)的引物序列為上游5’-GAATTCATGGCCCCCAGATTTCTC-3’，下游5’-GAATTCGTACGTATTACCCTCCG TCA-3’，將JRL-ccm4基因連入PET-32a載體。經(jīng)測序驗(yàn)證表達(dá)框正確，可以用于蛋白表達(dá)。在BL21菌株中經(jīng)12 h誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白表達(dá)情況（圖1），可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)誘導(dǎo)的菌株中產(chǎn)生分子量約為80 kDa的蛋白條帶。

2．3 重組蛹蟲草凝集素蛋白JRL-ccm4抑菌及抑制人宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖活性

蛹蟲草凝集素蛋白JRL-ccm4提取液對(duì)大腸桿菌生長無抑制作用，而對(duì)金黃色葡萄球菌有一定抑制效果，Amp作為陽性對(duì)照，抑菌圈直徑為（2.1±0.1）cm；JRL-ccm4蛋白抑菌圈直徑為（1.2±0.1）cm（圖2）。用蛋白濃度測定試劑盒測得蛋白提取液濃度為1.8 mg/mL，對(duì)人宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖的抑制率為11.7%。

圖1 異源表達(dá)JRL-ccm4蛋白的SDS-PAGE分析Fig．1 SDS-PAGE for heterologous expression of JRL-ccm4

圖2 JRL-ccm4蛋白抑制金黃色葡萄球菌生長Fig．2 JRL-ccm4 inhibits the growth of Staphylococcus aureus

2．4 蛹蟲草不同生長時(shí)期JRL-ccm4基因表達(dá)的相對(duì)定量

不同生長時(shí)期的蛹蟲草形態(tài)見圖3。以菌絲期JRL-ccm4基因的表達(dá)量為對(duì)照組進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，原基期的表達(dá)量上調(diào)了3.49倍，子實(shí)體期較菌絲期上調(diào)了1.46倍，結(jié)果表明JRL-ccm4基因在原基期有較高的表達(dá)量，可能在原基形成或子實(shí)體形成過程中起到調(diào)節(jié)作用。

圖3 不同生長時(shí)期的蛹蟲草Fig．3 Different growing stage of C．militaris

3 討論

蛹蟲草的人工栽培獲得成功和系列產(chǎn)品的開發(fā)，豐富了食用菌類的滋補(bǔ)保健品和功能食品［9］。肖磊［10］曾經(jīng)從蛹蟲草子實(shí)體中分離純化出了凝集素并做了生物活性分析，結(jié)果表明蛹蟲草凝集素對(duì)6種病原真菌有較強(qiáng)的抑制作用，皮下注射凝集素對(duì)小貓淋巴瘤有明顯的抑制作用，但對(duì)蛹蟲草凝集素在體內(nèi)的作用以及相關(guān)分子生物學(xué)研究一直存在空白。

在本研究的前期工作中，通過對(duì)蛹蟲草的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)數(shù)個(gè)凝集素編碼基因并都具有一定水平的表達(dá)。本研究選擇其中表達(dá)水平較高的JRL-ccm4基因進(jìn)行了常規(guī)的分子生物學(xué)研究，所建立的技術(shù)路徑和所獲得的研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步在分子層面深入了解蛹蟲草凝集素的功能和開發(fā)價(jià)值提供了工作基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果表明蛹蟲草JRL-ccm4基因在原基期的表達(dá)量最高，推測該基因可能與子實(shí)體發(fā)育調(diào)控相關(guān)聯(lián)。但是由于基因表達(dá)后還需要一個(gè)翻譯合成蛋白的過程，所以在蛹蟲草中Jacalin類凝集素的最高凝集活性也可能會(huì)出現(xiàn)在子實(shí)體生長階段，這與Nagata等［6］的研究發(fā)現(xiàn)灰樹花中Jacalin類凝集素的凝集活性在子實(shí)體階段達(dá)到最高的研究結(jié)果具有一致性。但是該基因是否是蛹蟲草子實(shí)體形成所必需的關(guān)鍵基因，以及Jacalin類凝集素在子實(shí)體發(fā)育中起何種作用，還需要通過基因敲除等研究手段加以深入研究。

［1］KUO Y C，LIN C Y，TSAI W J，et al.Growth inhibitors tumor cells inCordyceps sinensis other than cordycepin and polysaccharides［J］.Cancer Investigation，1994，12（6）：611-615.

［2］陳桂寶，羅梅初，劉實(shí)晶，等.蛹蟲草的藥理作用研究［J］.中草藥，1997，28（7）：415-417.

［3］GOLDSTEIN I J，HUGHES R C，MONSIGNY M，et al.What Should Be Called a Lectin［J］.Nature，1980，285（5760）：66-66.

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［8］何述棟.黑蕓豆凝集素的純化和生物信息學(xué)及結(jié)構(gòu)與功能特性研究［D］.哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2015.

［9］陳艷秋.蛹蟲草人工優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)栽培技術(shù)研究［J］.中國食用菌，2002，21（5）：20-22.

［10］肖磊.蛹蟲草凝集素的純化、生化性質(zhì)測定及其抗腫瘤、抗植物病原真菌的研究［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

（責(zé)任編輯：張睿）

Preliminary study of a jacalin-related lectin-like gene JRL-ccm4 in Cordyceps militaris

BAO Da-peng1，MA Yuan-wei1，2，WANG Rong1，LIU Min-xiang1，MAO Wen-jun1，WANG Ying1*
（1Institute of Edible Fungi，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201403，China；
2College of Food Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

Through the Cordyceps militaris genome data mining，a lectin gene encoding JRL-ccm4 was found.In this research，the gene and its encoding product were analyzed by bioinformatics，and heterologously expressed and examined the biological activity of the protein in Escherichia coli.The JRL-ccm4 gene expression level in different growth periods of C.militaris was tested by qRT-PCR.The results showed that the JRL-ccm4 proteins had a JRL domain structure which could be successfully expressed in prokaryotic cells.The protein of the JRL-ccm4 could inhibit growth of Staphylococcus aureus and partly inhibit cervical cancer HeLa cell proliferation；the JRL-ccm4 had the highest amount of gene expression in stromata，which was 3.49 times that of hyphae period and 2.39 times in the period of the fruiting body.It suggested that the gene could be related to fruit body development.

Cordyceps militaris；Lectin；Bioinformatics analysis；Heterologous expression；Gene function

S567.35；S646

A

1000-3924（2016）06-001-04

2016-10-20

上海市青年人才成長計(jì)劃2015（1-10）

鮑大鵬（1969—），男，博士，研究員，主要從事真菌分子遺傳研究。E-mail：baodp＠hotmail.com，Tel：18918162096

*通信作者，E-mail：wyhrx＠126.com