梁 霞高 超唐 勇▲劉翰楠吳健勇李宇虹龐 波陳 玉

1.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科，廣西南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科，廣西南寧 530021

三維共培養(yǎng)模型下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞侵襲、遷移及增殖能力的影響

梁 霞1高 超2唐 勇2▲劉翰楠2吳健勇2李宇虹2龐 波2陳 玉2

1.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科，廣西南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科，廣西南寧 530021

目的探討三維共培養(yǎng)下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）對(duì)CNE2細(xì)胞侵襲、遷移及增殖能力的影響。方法采用Transwell小室對(duì)HUVEC細(xì)胞和CNE2細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，CCK-8法比較兩組實(shí)驗(yàn)中CNE2細(xì)胞增殖能力，細(xì)胞計(jì)數(shù)法比較細(xì)胞遷移能力，以及Matrigel膠法比較侵襲能力。結(jié)果HUVEC與CNE2共培養(yǎng)條件下，共培養(yǎng)組遷移能力顯著高于非共培養(yǎng)組（P＜0.01）。共培養(yǎng)組侵襲能力顯著高于非共培養(yǎng)組（P＜0.01）。在增殖實(shí)驗(yàn)中，共培養(yǎng)組和非共培養(yǎng)組的OD值第3天，第4天及第5天，共培養(yǎng)組的細(xì)胞增殖率顯著高于非共培養(yǎng)組（P＜0.05）。結(jié)論在三維共培養(yǎng)條件下，HUVEC對(duì)CNE2鼻咽癌細(xì)胞的侵襲、遷移及增殖能力有促進(jìn)作用。

三維共培養(yǎng)模型；CNE2鼻咽癌細(xì)胞；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；增殖；遷移；侵襲

鼻咽癌是我國(guó)南方地區(qū)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其中廣東、廣西、湖南等地發(fā)病率最高，具有顯著的地域和種族聚集特點(diǎn)[1-2]。手術(shù)根治難度較大，放療是其主要治療手段[3]，但放療后復(fù)發(fā)率仍然較高，中晚期患者的五年生存率僅為50%[4]。影響鼻咽癌預(yù)后的主要因素是腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移程度，但其具體機(jī)制仍然不是十分清楚。而腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移與細(xì)胞的異常運(yùn)動(dòng)有關(guān)[5]，是癌細(xì)胞粘附、降解、運(yùn)動(dòng)及新生血管形成等多種生物學(xué)行為相互作用的結(jié)果，因此研究鼻咽癌細(xì)胞微環(huán)境對(duì)其復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究顯得十分重要。

血管內(nèi)皮細(xì)胞已被證實(shí)是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分[6]，本實(shí)驗(yàn)主要利用三維共培養(yǎng)模型，模擬體內(nèi)鼻咽癌微環(huán)境，將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）和人鼻咽癌細(xì)胞（human nasopharyngeal carcinoma cell，CNE2）共培養(yǎng)，探索HUVEC對(duì)CNE2的侵襲、轉(zhuǎn)移及增殖能力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料

人鼻咽癌CNE2細(xì)胞系為低分化鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系，以及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞均購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；Matrigel基質(zhì)膠、RPMI-1640、胎牛血清（FBS）、胰酶EDTA、Transwell小室（3μm和8μm）、24孔培養(yǎng)培養(yǎng)板、96孔板（美國(guó)corning公司）；PBS緩沖液（北京索萊寶公司）；CCK-8試劑（日本同仁公司）；吉姆薩染劑、4%多聚甲醛（北京碧云天公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀（美國(guó)THERMO公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代

CNE2和HUVEC常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI-1640中，于5% CO2、37.5℃飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，每2天換1次液（PBS沖洗后放入新培養(yǎng)液），2d后在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞鋪滿整個(gè)瓶壁底部約75%時(shí)用0.25%胰蛋白酶（EDTA）消化，待細(xì)胞變圓吹打混勻并傳代。

1.3 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

配膠：Matrigel：1640培養(yǎng)液按1：6的比例配置，每個(gè)小室內(nèi)每孔鋪體積為60μL的基質(zhì)膠，37℃過(guò)夜成膠備用。共培養(yǎng)組在24孔板的下室放入含HUVEC細(xì)胞（2×104個(gè)）的完全培養(yǎng)液500μL，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。非共培養(yǎng)組放入等體積的不含HUVEC的完全培養(yǎng)液作為對(duì)照組處理。將此24孔板放在37.5℃、5% CO2的細(xì)胞溫箱中過(guò)夜。24h后，在兩組Transwell小室內(nèi)分別加入10×104個(gè)CNE2鼻咽癌細(xì)胞（體積200μL），然后放入37.5℃、5% CO2的細(xì)胞溫箱中培養(yǎng)48h。最后，小室背面的細(xì)胞用4%的多聚甲醛固定，然后用吉姆薩染色劑染色，用光學(xué)顯微鏡計(jì)算細(xì)胞數(shù)量。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

共培養(yǎng)組在24孔板的下室放入含HUVEC細(xì)胞（2×104個(gè)）的完全培養(yǎng)液500μL。設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。非共培養(yǎng)組放入等體積的不含人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的完全培養(yǎng)液作為對(duì)照組處理。將這24孔板放在37.5℃、5% CO2的細(xì)胞溫箱中過(guò)夜。24h后，在兩組Transwell小室內(nèi)分別加入1×104個(gè)的CNE2細(xì)胞（體積200μL），然后放入37.5℃、5% CO2的細(xì)胞溫箱中培養(yǎng)48h。最后，小室背面的細(xì)胞用4%的多聚甲醛固定，吉姆薩染色劑染色，放在光學(xué)顯微鏡下計(jì)算細(xì)胞數(shù)目。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

采用CCK-8法檢測(cè)CNE2增殖能力，共培養(yǎng)組下室內(nèi)每孔放入含有0.5×104個(gè)HUVEC的培養(yǎng)液（體積900μL）。非共培養(yǎng)組下室放入900μL的10% FBS的培養(yǎng)液作為對(duì)照組。培養(yǎng)24h后，分別在兩組小室內(nèi)（孔徑為3μm）每孔放入0.2×104個(gè)的CNE2細(xì)胞（體積為200μL）。將這兩組放入37.5℃、5% CO2細(xì)胞溫箱中過(guò)夜。分別檢測(cè)培養(yǎng)第1～5天的OD值，測(cè)量?jī)蓚€(gè)組別OD值計(jì)數(shù)，并繪制生長(zhǎng)曲線（圖3）。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以（表示，兩組獨(dú)立樣本比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞侵襲能力比較

HUVEC與CNE2共培養(yǎng)48h后固定染色并計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)，共培養(yǎng)組CNE2侵襲數(shù)為（37.3±22.0），顯著高于非共與培養(yǎng)組（5.98±5.76），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖1。

圖1 共培養(yǎng)組和非共培養(yǎng)組CNE2侵襲能力比較

2.2 細(xì)胞遷移能力比較

HUVEC與CNE2培 養(yǎng)48h后，共 培 養(yǎng) 組CNE2細(xì)胞遷移數(shù)（74.00±29.40），非共培養(yǎng)組為（20.38±17.41），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

圖2 共培養(yǎng)組和非共培養(yǎng)組CNE2遷移數(shù)目比較

2.3 增殖能力實(shí)驗(yàn)

采用CCK-8法檢測(cè)CNE2細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示共培養(yǎng)組和非共培養(yǎng)組的OD值第3天、第4天及第5天分別為（1.321±0.036 & 1.174±0.015，P＜ 0.05）、（1.924±0.033 & 1.666±0.088，P＜0.05）、（2.111±0.117 & 2.003±0.081，P＜0.05），提示共培養(yǎng)組CNE2細(xì)胞增殖率高于非共培養(yǎng)組（見(jiàn)圖3、表1）。

3 討論

圖3 共培養(yǎng)組和非共培養(yǎng)組CNE2生長(zhǎng)曲線的比較，*P＜0.05

表1 共培養(yǎng)組與非共培養(yǎng)組CNE2細(xì)胞OD值比較（

表1 共培養(yǎng)組與非共培養(yǎng)組CNE2細(xì)胞OD值比較（

時(shí)間（d） 共培養(yǎng)組 非共培養(yǎng)組 t P1 0.207±0.008 0.105±0.139 19.13 0.00 2 0.605±0.242 0.428±0.152 1.86 0.09 3 1.321±0.036 1.174±0.015 11.36 0.00 4 1.924±0.033 1.666±0.088 8.20 0.00 5 2.111±0.117 2.003±0.081 2.27 0.04

鼻咽癌是一種源自鼻黏膜上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，其解剖位置隱匿，病理類(lèi)型又多為低分化級(jí)別，且具有較高的侵襲轉(zhuǎn)移能力，是治療失敗和致患者死亡的主要原因，嚴(yán)重困擾著臨床醫(yī)生和科研工作者。腫瘤細(xì)胞的惡性能力是由相鄰內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)中的信號(hào)進(jìn)行調(diào)節(jié)的，統(tǒng)稱(chēng)為腫瘤細(xì)胞微環(huán)境[7]。研究表明腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞，尤其是周?chē)膬?nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及炎癥相關(guān)細(xì)胞等分泌因子，通過(guò)系列的化學(xué)信號(hào)通路作用于癌細(xì)胞，促進(jìn)或抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[8]。Battiston等[9]研究表明腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間可通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)的自分泌、旁分泌、雙向分泌可溶性生物因子介導(dǎo)復(fù)雜生物信號(hào)通路，以及通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞間直接接觸作用，互相影響彼此的發(fā)生發(fā)展。亦有文獻(xiàn)報(bào)道，腫瘤細(xì)胞可通過(guò)與相鄰的血管內(nèi)皮細(xì)胞相接觸，可引發(fā)新血管生成[10]。越來(lái)越多的研究證實(shí)腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間存在密不可分的關(guān)系，彼此之間有促進(jìn)和依賴作用[11]。

二維細(xì)胞培養(yǎng)體系改變了細(xì)胞原有生長(zhǎng)形態(tài)，引起細(xì)胞喪失一些原本特性，使體外實(shí)驗(yàn)研究受到了一定限制，而三維共培養(yǎng)模型能模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境，較好地模仿人體的細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而更好的研究細(xì)胞間的相互作用[12]。Wang等[13]研究亦指出三維共培養(yǎng)在探討靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和另一種細(xì)胞間相互作用的研究中具有重要價(jià)值，目前三維共培養(yǎng)倍受關(guān)注。

Transwell小室共培養(yǎng)是以聚碳酸酯膜分隔上、下室，因聚碳酸酯膜具有通透性，從而可以研究下層細(xì)胞或其分泌的特定因子對(duì)上室細(xì)胞的影響，進(jìn)而構(gòu)建一種不直接接觸法研究一種細(xì)胞對(duì)另一種細(xì)胞影響的共培養(yǎng)模型。眾所周知腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤中危害最大生物學(xué)特性之一，可直接導(dǎo)致腫瘤患者的死亡。而腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移，首要步驟是先穿過(guò)組織基膜，Transwell小室則可以較好地模擬體內(nèi)環(huán)境，觀察細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的改變[14]。

本研究利用Transwell小室構(gòu)建HUVEC和CNE2的三維共培養(yǎng)模型，結(jié)果顯示HUVEC對(duì)CNE2的侵襲和遷移活動(dòng)有明顯促進(jìn)作用。研究表明內(nèi)皮細(xì)胞可通過(guò)直接作用于癌細(xì)胞及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子等影響腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)行為[15]。Cheng等[16]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞共培養(yǎng)情況下，增強(qiáng)了膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的侵襲遷移能力。另有研究表明，腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)到一定體積后，會(huì)分泌血管相關(guān)因子，而血管內(nèi)皮細(xì)胞主動(dòng)攝取由腫瘤細(xì)胞分泌的含有表皮生長(zhǎng)因子受體的微泡，從而激活內(nèi)皮細(xì)胞，啟動(dòng)VEGF/VEGFR2信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤新生血管生成[17]。Nikolia等[18]在HUVEC和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)到HUVEC的基因表達(dá)發(fā)生了改變，出現(xiàn)了Tie-2受體、VEGF-1受體、FGF-2受體等腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞特有基因。而腫瘤血管生成能力是惡性腫瘤侵襲周?chē)M織，發(fā)生腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要條件之一。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌的VEGF和bFGF通過(guò)刺激MMP-2和MMP9的分泌，可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解，加速腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[19-20]。

在本研究中我們亦發(fā)現(xiàn)在三維共培養(yǎng)模型下，HUVEC促進(jìn)了CNE2細(xì)胞的增殖，提示腫瘤微環(huán)境中HUVEC有利于維持CNE2細(xì)胞的活力。Bidarra等[21]研究顯示共培養(yǎng)中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)一直延續(xù)到第21天，且在后兩周共培養(yǎng)者的增殖率明顯高于單獨(dú)培養(yǎng)組，提示HUVE具有刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的潛力。

越來(lái)越多的研究證明，內(nèi)皮細(xì)胞是癌癥進(jìn)展的推進(jìn)器，可以增強(qiáng)癌細(xì)胞自發(fā)的侵入周?chē)M織[22-23]，而腫瘤微環(huán)境是一個(gè)復(fù)雜多變的體系，HUVEC細(xì)胞是CNE2細(xì)胞外重要的組成成分，HUVEC與CNE2共培養(yǎng)體系中是通過(guò)何種方式誘導(dǎo)了鼻咽癌細(xì)胞的侵襲、遷移和增殖，仍有待進(jìn)一步深入研究。

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Influence of human umbilical vein endothelial cells under the three-dimensional co culture model to invasion， migration and proliferation of nasopharyngeal carcinoma cell line CNE2

LIANG Xia1GAO Chao2TANG Yong2LIU Hannan2WU Jianyong2LI Yuhong2PANG Bo2CHEN Yu2

1.Department of Radiotherapy,Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021,China;
2.Department of Urology Surgery, Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021,China

ObjectiveTo explore the influence of human umbilical vein endothelial cells(HUVEC) under the three-dimensional co culture model to invasion, migration and proliferation of nasopharyngeal carcinoma cell line CNE2.MethodsTranswell was used to give co culture of HUVEC cells and CNE2 cells.CCK-8 was used to compare the CNE2 cell proliferation.Cell counting method was used to compare the cell migration ability.Matrigel method was used to compare the invasive ability.ResultsUnder the co culture condition of CNE2 and HUVEC,the migration ability of co culture group was significantly higher than that of non co culture group(P＜ 0.01).The invasive ability of the co culture group was significantly higher than that in the non co culture group(P＜ 0.01).In the proliferation experiment,On the third day,fourth day and fifth day,the cell proliferation rate was significantly higher than that of non co culture co culture group(P＜0.05).ConclusionUnder three dimensional co culture conditions,HUVEC can promote the invasion,migration and proliferation of CNE2 nasopharyngeal carcinoma cells.

Three-dimensional co culture model;CNE2 nasopharyngeal carcinoma cell;Human umbilical vein endothelial cells;Proliferation; Migration;Invasion

R737.31

A

2095-0616（2016）19-36-05

2016-07-27）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81560428）；廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2011GXNSFC018020，2012GXNSFAA053163）；廣西科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（桂科攻1355005-3-11）；廣西醫(yī)療衛(wèi)生適宜技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)課題（S201301-06）；廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳科研課題（Z2011226）。

▲通訊作者