王曉玲， 呂園園， 張淑麗， 官志忠,2， 齊曉嵐

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SH-SY5Y細(xì)胞α7神經(jīng)型尼古丁受體基因沉默對(duì)突觸相關(guān)蛋白的影響

王曉玲1， 呂園園1， 張淑麗1， 官志忠1,2， 齊曉嵐1

目的 研究神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y) α7 神經(jīng)型尼古丁受體基因(α7 nAChR) 表達(dá)沉默后對(duì)細(xì)胞突觸相關(guān)蛋白的影響，探討 α7 nAChR神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制及在阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD) 的發(fā)病機(jī)制中的作用。方法 用Real-time PCR法和蛋白免疫印跡(Western blot)法分別測(cè)定細(xì)胞中囊泡相關(guān)蛋白(synaptophysin)和突觸后膜蛋白(PSD-95) mRNA蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果 α7 nAChR沉默組的突觸相關(guān)蛋白PSD-95、SYPmRNA及蛋白表達(dá)都有明顯的減少。結(jié)論 沉默SH-SY5Y細(xì)胞α7 nAChR水平能夠使細(xì)胞突觸相關(guān)蛋白水平減少。這可能提示了α7 nAChR與細(xì)胞突觸密切相關(guān)，并且α7 nAChR對(duì)突觸有一定的保護(hù)作用，進(jìn)一步說(shuō)明α7 nAChR在阿爾茨海默病的發(fā)病中起著重要作用。

α7 神經(jīng)型尼古丁受體； 阿爾茨海默?。?SH-SY5Y細(xì)胞； 突觸

阿爾茨海默病 (Alzheimer’s disease,AD)是一種認(rèn)知障礙、神經(jīng)元丟失和進(jìn)行性突觸功能障礙為主要表現(xiàn)的漸行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變[1～3]。研究表明，突觸缺失以及其可塑性障礙是AD重要病理特征之一，突觸功能障礙與AD認(rèn)知學(xué)習(xí)功能受損密切相關(guān)[4]。在AD患者腦中,不僅存在突觸數(shù)量的減少和神經(jīng)元的大量丟失現(xiàn)象，且突觸數(shù)量減少較神經(jīng)元的丟失更為突出，突觸缺失的程度與記憶和學(xué)習(xí)能力的表現(xiàn)衰弱有著密切的關(guān)系，這提示了大量的突觸缺失是AD發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)[5]。突觸蛋白對(duì)于正常突觸功能的形成和維持具有顯著的作用，目前已有許多已知突觸相關(guān)蛋白得到驗(yàn)證。在AD中，突觸功能的異常被認(rèn)為在認(rèn)知功能障礙中起著關(guān)鍵作用[6]，在AD患者腦組織中研究發(fā)現(xiàn)，突觸丟失主要發(fā)生在AD的早期階段[7,8]。

本課題通過(guò)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 α7 nAChR mRNA 基因來(lái)研究在AD發(fā)病機(jī)制中，α7 nAChR基因及蛋白的表達(dá)情況對(duì)突觸功能的影響進(jìn)行深入研究，研究其可能的影響機(jī)制，為進(jìn)一步闡明AD發(fā)病機(jī)制提供可靠的理論依據(jù)，為癡呆的治理提供治療靶點(diǎn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人腦神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SH-SY5Y)細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)保存；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染α7 nAChR- pCDNA 3.1表達(dá)質(zhì)粒及空載質(zhì)粒的SH-SY5Y細(xì)胞由本課題組凍存于本實(shí)驗(yàn)室液氮罐中；胎牛血清(FBS)購(gòu)于Gibco公司；高糖DMEM培養(yǎng)基、0.25% 胰蛋白酶液購(gòu)于HyClone公司；Firststart Universal SYBR Green Master(Rox)購(gòu)于Roche公司(德國(guó))；兔抗PSD-95 單克隆抗體(GTX61948)、高分子量蛋白Marker(12-170 kD)購(gòu)于GeneTex公司(美國(guó))；兔抗Synaptophysin單克隆抗體(ab32127)購(gòu)于abcam公司(美國(guó))；鼠抗β-actin單克隆抗體(sc-81178)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP) 標(biāo)記的抗鼠二抗(sc-2005)購(gòu)于Santa Cruz 公司(美國(guó))；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗兔二抗#7074購(gòu)于CST公司(美國(guó))；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、高效顯影膠片、聚乙烯二氟(PVDF)膜購(gòu)于Amersham公司(美國(guó))；嘌呤霉素、六氟異丙醇(HFIP)、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)于Sigma公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Thermo公司；Trizol試劑購(gòu)于Invitrogen公司；β-actin、PSD-95、SYP 3種的引物均由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成。

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)為DMEM高糖培養(yǎng)基，胎牛血清 10%，雙抗(青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)1%；篩選沉默細(xì)胞的培養(yǎng)為DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清15%、嘌呤霉素(濃度為2 μg/ml)；置于含5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 Real-time PCR檢測(cè)7 nAChR mRNA 表達(dá)水平 采用Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行Real-time PCR。所用試劑為Firststart Universal SYBR Green Master(Rox)。其中PSD-95、SYP、β-actin的引物序列(見(jiàn)表1)。運(yùn)用ABI Step One Plus型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，采集PSD-95、SYP及β-actin基因擴(kuò)增各循環(huán)的熒光信號(hào)，以Applied Biosystems SDS2.1軟件收集熒光和分析數(shù)據(jù)。分析結(jié)果時(shí)以β-actin為內(nèi)對(duì)照，計(jì)算PSD-95、SYP基因在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的相對(duì)水平(RQ=2-△△Ct)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)復(fù)孔。

1.2.3 蛋白表達(dá)水平測(cè)定 收集細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白(裂解2 h，14000 rpm離心5 min)并進(jìn)行BCA方法定量，用Western blot方法檢測(cè)PSD-95、SYP蛋白表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)對(duì)照。用ImageJ軟件分析結(jié)果，計(jì)算PSD-95、SYP蛋白條帶與β-actin蛋白像素灰度的比值作為蛋白表達(dá)相對(duì)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)復(fù)孔。

2 結(jié) 果

2.1 α7 nAChR水平抑制后PSD-95 mRNA及蛋白表達(dá)水平 本實(shí)驗(yàn)表明，用Real-time PCR和Western blot方法檢測(cè)到正常對(duì)照組、空質(zhì)粒組和沉默組中，SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染α7 nAChR shRNA質(zhì)粒α7 nAChR水平抑制后PSD-95mRNA及蛋白表達(dá)水平都較對(duì)照組明顯降低(P<0.01或P<0.05)，而空載質(zhì)粒組與對(duì)照組相比PSD-95 mRNA及蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異(見(jiàn)圖1A、圖1B，其中溶解曲線(C)及擴(kuò)增曲線(D)。

2.2 α7 nAChR水平抑制后SYP mRNA及蛋白表達(dá)水平 本實(shí)驗(yàn)表明，用Real-time PCR和Western blot方法檢測(cè)到正常對(duì)照組、空質(zhì)粒組和沉默組中，SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染α7 nAChRshRNA質(zhì)粒α7 nAChR水平抑制后SYP mRNA及蛋白表達(dá)水平都較對(duì)照組明顯降低(P<0.01或P<0.05)，而空載質(zhì)粒組與對(duì)照組相比SYP mRNA及蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異(見(jiàn)圖2A、圖2B，其中溶解曲線(C)及擴(kuò)增曲線(D)。

表1 熒光定量PCR引物序列及產(chǎn)物片段

與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義*P<0.05，與對(duì)照組相比差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義**P<0.01

圖1 各組SH-SY5Y細(xì)胞PSD-95 mRNA(A)及蛋白表達(dá)水平(B)；溶解曲線(C)及擴(kuò)增曲線(D)

與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義*P<0.05，與對(duì)照組相比差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義**P<0.01

圖2 各組SH-SY5Y 細(xì)胞SYP mRNA(A)及蛋白表達(dá)水平(B)；溶解曲線(C)及擴(kuò)增曲線(D)

3 討 論

AD是一種由多種因素所致的中樞神經(jīng)變性疾病，由于長(zhǎng)期、慢性、漸行性腦組織損傷而出現(xiàn)一系列學(xué)習(xí)、記憶、認(rèn)知功能障礙的衰退性疾病綜合征，也是老年性癡呆最為常見(jiàn)的重要發(fā)病原因。

在AD的多種發(fā)病機(jī)制中nAChR數(shù)量的改變?cè)絹?lái)越引起學(xué)者的關(guān)注。nAChRs是由4個(gè)亞基構(gòu)成的五聚體α2βγδ，在腦中分布廣泛，主要為α4β2亞型和α7 亞型。海馬區(qū)對(duì)于學(xué)習(xí)和記憶尤為關(guān)鍵，AD中海馬區(qū)的膽堿能系統(tǒng)異常與認(rèn)知功能障礙關(guān)系密切，這可能也與 α7 nAChRs功能異常有關(guān)[9]。經(jīng)本課題組研究發(fā)現(xiàn)， AD患者與正常同年齡對(duì)照組相比，α3亞基在大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)分別減少了35%和29%；α4亞基在海馬區(qū)和大腦皮質(zhì)中分別減少了35%和47%；α7亞基在海馬中減少了36%，而在大腦皮質(zhì)中無(wú)明顯變化；β2亞基在海馬區(qū)及大腦皮質(zhì)中都沒(méi)有明顯的變化。由此可見(jiàn)，在AD患者腦內(nèi)，nAChRs將嚴(yán)重受損，這會(huì)對(duì)學(xué)習(xí)及記憶能力產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，即AD涉及的膽堿能神經(jīng)元損傷通常會(huì)導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶損傷[10]。

眾所周知，突觸的可塑性是形成記憶的主要機(jī)制。在正常成年人腦中，大腦皮質(zhì)和海馬中正常行使突觸功能對(duì)學(xué)習(xí)記憶特別重要。突觸部位是寡聚 Aβ結(jié)合區(qū)，突觸前和突觸后受到干擾可以造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸傳遞和突觸可塑性的異常變化[11,12]。對(duì)于突觸功能而言,其中很重要的因素為突觸相關(guān)蛋白。突觸相關(guān)蛋白種類(lèi)很多，而本課題主要研究突觸相關(guān)蛋白PSD-95、SYP這兩個(gè)蛋白。

PSD95的分子量大小為95 kDa,是PSD中含量最豐富的蛋白之一，被認(rèn)為在突觸后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的裝配和組織中起核心作用，通常作為突觸后特異性的標(biāo)記物，是突觸可塑性的關(guān)鍵指標(biāo)之一[13]。在AD患者腦中發(fā)現(xiàn)Aβ的產(chǎn)生和膠質(zhì)細(xì)胞的增生是伴隨PSD-95表達(dá)水平的下降[14]。PSD-95表達(dá)水平的減少,說(shuō)明突觸后致密物質(zhì)變薄及突觸活性降低，最終導(dǎo)致突觸的傳導(dǎo)發(fā)生障礙[15]。PSD-95是影響突觸及神經(jīng)元可塑性、影響神經(jīng)遞質(zhì)和其他神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子合成、調(diào)節(jié)神經(jīng)元對(duì)神經(jīng)傳導(dǎo)信號(hào)免疫應(yīng)答、影響突觸發(fā)育和再塑作用的重要蛋白。研究表明，在APP原代培養(yǎng)的神經(jīng)元中寡聚Aβ的積累和突觸的丟失，SYP和PSD-95蛋白的水平降低，這些都和突觸功能的降低相關(guān)，而對(duì)照組WT培養(yǎng)并未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象[16]。SYP的減少提示著突觸囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)能力的減弱，這可能使神經(jīng)系統(tǒng)的信息傳遞、加工和儲(chǔ)存出現(xiàn)障礙。

SYP是分子量大小為38 kDa的一種鈣結(jié)合蛋白，其在神經(jīng)元胞體合成后轉(zhuǎn)運(yùn)至軸突末端，特異性地存在于腦內(nèi)所有神經(jīng)元軸突末端的突觸前囊泡膜上，常被作為突觸前末端特異性標(biāo)記物進(jìn)行對(duì)突觸含量定量分析[17]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，AD患者腦中的SYP蛋白表達(dá)顯著降低，這可能提示了AD腦中存在一定程度的突觸聯(lián)系缺失，其最終將導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力的衰減[18]。

盡管AD患者早期學(xué)習(xí)記憶能力減退的病理學(xué)基礎(chǔ)可能是神經(jīng)元突觸的改變，但造成AD患者腦中突觸病變的具體分子機(jī)制并不十分清楚。課題組前期的研究表明Aβ能明顯降低大鼠及培養(yǎng)細(xì)胞中α7 nAChR的表達(dá)，Aβ誘導(dǎo)的突觸功能損傷是否與α7 nAChR的相互作用有關(guān)，α7 nAChR影響突觸功能?chē)?guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)研究報(bào)道。

本研究旨在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染α7 nAChR-shRNA 表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞克隆株觀察不同的α7 nAChR表達(dá)量對(duì)神經(jīng)細(xì)胞突觸相關(guān)蛋白的影響，為進(jìn)一步的研究提供了基礎(chǔ)。本課題結(jié)果顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染α7 nAChR-shRNA表達(dá)質(zhì)粒的沉默細(xì)胞株，與空質(zhì)粒及正常對(duì)照組相比突觸相關(guān)蛋白PSD-95、SYP的表達(dá)都減少。表明α7 nAChR在SH-SY5Y細(xì)胞中的表達(dá)量的沉默將會(huì)影響突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)。這可能提示了α7 nAChR在突觸功能中發(fā)揮著重要的作用。沉默α7 nAChR表達(dá)后，引發(fā)突觸損傷，最終可能導(dǎo)致記憶和學(xué)習(xí)認(rèn)知功能缺陷。但其具體的機(jī)制還不是非常的清楚，需要進(jìn)一步的研究探索。

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The effects of inhibited expression of 7 neural nicotinic receptors on synaptic proteins in SH-SY5Y

WANGXiaoling,LVYuanyuan,ZHANGShuli,etal.

(TheKeyLaboratoryofMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

Objective To investigate the effects of changed expression of 7 neural nicotinic acetylcholine receptors (nAChR) on synaptic proteins,to understand the neuroprotective role of 7 nAChR in the pathogenesis of Alzheimer’s disease (Alzheimer diseases,AD).Methods The mRNA and protein level of vesicle associated protein (synaptophysin) and postsynaptic membrane proteins (PSD-95) were detected by real-time PCR and western blotting,respectively.Results The mRNA and protein level of PSD-95,SYP were decreased obviously in cells with α7nAChR silencing.Conclusion Inhibiting the level of α7 nAChR reduce the synaptic proteins level in cells.The results indicated that α7 nAChR is closely related to the synaptic in cells,α7nAChR can protect the synapse function,suggesting that the receptor might play an important neuroprotective role in connection with the pathogenesis of AD.

α7 nAChR； AD； SH-SY5Y cell； Synaptic

1003-2754(2016)12-1080-04

2016-08-19；

2016-11-29 基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81360178)；教育部“長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃資助”(No.IRT13058)；貴州省科技廳重大專(zhuān)項(xiàng)[黔科合重大專(zhuān)項(xiàng)字2014(600)]]；貴州省科技廳項(xiàng)目[201344，黔科合SY字(2013)3020] 作者單位：(1.貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550004) 通訊作者：齊曉嵐，E-mail：xiaolan76@163.com

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