胡小倩

（浙江大學(xué)，浙江 杭州 310000）

應(yīng)用共聚焦顯微拉曼光譜儀檢測(cè)鐵皮石斛不同部位多糖含量初探

胡小倩

（浙江大學(xué)，浙江 杭州 310000）

美國(guó)Thermo Scientificic公司的DXR激光共聚焦顯微拉曼光譜儀，結(jié)合了拉曼光譜分析技術(shù)與顯微鏡分析技術(shù)，不僅具有常規(guī)拉曼光譜非破壞性、檢測(cè)時(shí)間短、樣品需求量小、樣品制備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，輔以高倍光學(xué)顯微鏡，還具有微觀、原位、多相態(tài)、穩(wěn)定性好、空間分辨率高等優(yōu)點(diǎn)。本研究旨在探索應(yīng)用共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)測(cè)定鐵皮石斛的根、莖、葉和花的多糖含量，在提高多糖含量測(cè)定效率的同時(shí)，將共聚焦纖維拉曼光譜技術(shù)應(yīng)用到中藥有效成分檢測(cè)方面，為相關(guān)研究提供新的技術(shù)方法。

共聚焦顯微拉曼光譜儀；鐵皮石斛；多糖含量；檢測(cè)

顯微拉曼儀具有很好的空間分辨率，樣品分析時(shí)將入射光通過顯微鏡聚焦到樣品上，從而可以在不受周圍物質(zhì)干擾的情況下，精確獲得所照樣品微區(qū)的有關(guān)化學(xué)成分、晶體結(jié)構(gòu)、分子相互作用以及分子取向等各種拉曼光譜信息。應(yīng)用共聚焦顯微拉曼光譜儀檢測(cè)鐵皮石斛不同部位多糖含量，能夠有效提高相應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果，這對(duì)提高石斛有效多糖的利用率具有重要意義。

1 拉曼光譜及鐵皮石斛簡(jiǎn)介

拉曼光譜又稱拉曼效應(yīng)，是以發(fā)現(xiàn)者印度人C.V. Raman命名的。德文文獻(xiàn)中常稱之為邁克爾—拉曼效應(yīng)，而蘇聯(lián)前若干年的文獻(xiàn)中則稱之為聯(lián)合散射。拉曼于1928年在CCl4光譜中發(fā)現(xiàn)了當(dāng)光與分子相互作用后，一部分光的波長(zhǎng)會(huì)發(fā)生變化（顏色發(fā)生變化），通過對(duì)于這些顏色發(fā)生變化的散射光的研究，可以得到分子結(jié)構(gòu)的信息，因此將這種效應(yīng)命名為Raman效應(yīng)[3]。

鐵皮石斛（Dendrobium candidurn Wall．ex Lindnd．）為蘭科石斛屬（Dendrobium Sw．）多年生草本植物，是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，素有“中華仙草”、“藥中黃金”之美稱，列“中華九大仙草”之首。近些年研究表明，鐵皮石斛具有滋養(yǎng)陰津、增強(qiáng)體質(zhì)、補(bǔ)益脾胃、護(hù)肝利膽、清虛熱、強(qiáng)筋壯骨、降低血糖、抑制腫瘤、明亮眼目、滋養(yǎng)肌膚和延年益壽等功效。由于長(zhǎng)期的過度開采，野生鐵皮石斛瀕臨滅絕，現(xiàn)已被國(guó)家列為重點(diǎn)保護(hù)野生藥材。目前絕大部分野生藥材是應(yīng)用植物組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)進(jìn)行種苗繁育的，但當(dāng)前所應(yīng)用的鐵皮石斛人工種植技術(shù)均存在所用品系復(fù)雜、品種退化等現(xiàn)象，造成在大規(guī)模生產(chǎn)中所用的種質(zhì)資源遺傳性狀參差不齊、品質(zhì)不穩(wěn)定、有效成分可溶性多糖含量低、生活力弱、栽培困難等問題。浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站植物種質(zhì)改良中心經(jīng)過多年研究，利用雜交育種技術(shù)和人工誘變技術(shù)改良鐵皮石斛的遺傳性狀，首次在藥用石斛的生產(chǎn)上利用雜交優(yōu)勢(shì)技術(shù)，重點(diǎn)培育鮮食型鐵皮石斛新品種（鮮食鐵皮石斛可以最完整地保存鐵皮石斛的有效成分），該鮮食鐵皮石斛多糖含量高、品性穩(wěn)定。

2 檢測(cè)方法及重點(diǎn)

2.1 建立鐵皮石斛多糖成分的定性分析方法

選用3年齡人工組培鐵皮石斛栽培苗，采集新鮮植株不同部位作為檢測(cè)樣本，挑選適當(dāng)波長(zhǎng)的激光光源以減少熒光干擾，采用主成分分析算法處理共聚焦顯微拉曼光譜，指認(rèn)光譜中波峰化學(xué)基團(tuán)歸屬，實(shí)現(xiàn)多糖定性分析。

2.2 掃描位置選取

選取樣本的適當(dāng)位置對(duì)其進(jìn)行拉曼光譜的面掃描測(cè)定，在位置選取的時(shí)候，盡量保證樹脂的厚度最薄、細(xì)胞的輪廓明顯，并且所做的面掃描中至少要包含一個(gè)上表皮細(xì)胞和一個(gè)柵欄組織細(xì)胞。

2.3 建立鐵皮石斛多糖的定量分析方法

結(jié)合鐵皮石斛多糖成分的拉曼指紋普帶信息，采用計(jì)算機(jī)優(yōu)化算法和化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，篩選出波峰明顯且專一性好的譜帶，作為多糖成分的定量峰，實(shí)現(xiàn)多糖成分定量檢測(cè)。

2.4 研究關(guān)鍵點(diǎn)

篩選出適當(dāng)波長(zhǎng)的激光光源以及最優(yōu)化的檢測(cè)條件的設(shè)定。

3 檢測(cè)意義及結(jié)果

準(zhǔn)確測(cè)定鐵皮石斛多糖含量以及在植株根、莖、葉和花中的分布情況，對(duì)提高石斛有效多糖的利用率具有重要意義。陳云龍等研究過野生細(xì)莖石斛不同部位的有效成分及其分別規(guī)律[2]。尚喜雨取鐵皮石斛的不同部位，通過將鐵皮石斛先殺青后烘干和先室溫放置后暴曬制成的干燥粉末。采用微波輔助的方法，對(duì)上述材料中的石斛多糖進(jìn)行提取，多糖含量進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得結(jié)果為：鐵皮石斛的多糖含量很高，尤以莖段為最；不同部位的含量存在一定差異，莖部的差異要大于根、葉的；人工栽培兩年生植株的多糖含量要比一年生的多，野生型的比栽培型的多[1]。浙江大學(xué)華允芬博士在其博士論文中借助現(xiàn)代色譜技術(shù)如體積排阻色譜 (SEC)、凝聚滲透色譜(GPC)、高效離子交換色譜 (HPAEC-PAD)、薄層色譜(TLC)和氣相色譜(Gc)等，光譜技術(shù)如紫外光譜(uV)、紅外光譜(破)、質(zhì)譜(Ms)和核磁共振光譜以及其他手段輔助如高碘酸氧化、酸降解或酶降解，對(duì)鐵皮石斛的多糖進(jìn)行了系統(tǒng)的分析和比較研究。以上檢測(cè)方法都需要對(duì)樣品植物組織進(jìn)行分解、提純等化學(xué)過程，耗時(shí)費(fèi)力，而且樣品處理過程會(huì)消耗分解改變多糖含量。

4 小結(jié)

本項(xiàng)目探索采用共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)，實(shí)現(xiàn)快速、簡(jiǎn)單、可重復(fù)、無損傷地測(cè)定鮮食鐵皮石斛不同部位多糖含量，將高新技術(shù)應(yīng)用到新的領(lǐng)域，在實(shí)現(xiàn)植物組織成分快速檢測(cè)的同時(shí)，也為相關(guān)領(lǐng)域（醫(yī)藥行業(yè)）的有關(guān)研究提供新思路、新方法。本項(xiàng)目研究成果應(yīng)用前景廣闊，對(duì)中藥成分檢測(cè)研究具有很強(qiáng)的實(shí)際指導(dǎo)意義。

[1]尚喜雨.多糖在不同來源不同部位鐵皮石斛中的分布規(guī)律[J].中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2010(13):104-105.

[2]陳云龍,張銘,華允芬,等.細(xì)莖石斛不同部位有效成分及分布規(guī)律研究[J].中國(guó)中藥雜志,2001,26(10): 709-710.

[3]張光濃,畢志明,王崢濤,等.石斛屬植物化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].中草藥,2003,34 (6):C5-C8.

1005-2690（2017）02-0078-02

S567.239

B

2017-01-17）

胡小倩（1982-），女，河北隆堯人，研究生，實(shí)驗(yàn)師，從事植物真菌病害研究與防治工作。