楊博文

（張家口市種子管理站，河北 張家口 075000）

張家口市馬鈴薯脫毒種薯病毒檢測(cè)試驗(yàn)研究

楊博文

（張家口市種子管理站，河北 張家口 075000）

本試驗(yàn)應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)對(duì)36個(gè)馬鈴薯脫毒種苗樣品進(jìn)行PVX、PVY、PVS、PLRV 4種病毒檢測(cè)，未檢測(cè)出PVX、PVS和PLRV病毒，表明這3種病毒脫毒情況良好；PVY病毒有1份樣品檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，需重點(diǎn)對(duì)PVY病毒進(jìn)行監(jiān)測(cè)，阻止帶毒瓶苗進(jìn)入生產(chǎn)，從源頭上控制種薯質(zhì)量。

馬鈴薯；脫毒種薯；病毒檢測(cè)；試驗(yàn)

近年來(lái)，張家口地區(qū)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展，播種面積占河北省馬鈴薯面積的60%。由于大量使用脫毒種薯，全市馬鈴薯平均單產(chǎn)高達(dá)1.49 t/667 m2，高于全國(guó)單產(chǎn)0.968 t/667 m2。要保證脫毒種薯的質(zhì)量，脫毒瓶苗的帶毒率必須為0。

本試驗(yàn)應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，對(duì)本市生產(chǎn)的馬鈴薯脫毒種苗進(jìn)行檢測(cè)，以了解本市各種薯企業(yè)馬鈴薯種薯脫毒情況，為馬鈴薯脫毒種薯質(zhì)量監(jiān)督提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

采用瑞士BIOREBA公司生產(chǎn)的馬鈴薯病毒檢測(cè)試劑盒，包括馬鈴薯X病毒（PVX）、馬鈴薯Y病毒（PVY）、馬鈴薯S病毒（PVS）、馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）。試驗(yàn)材料為本地主栽品種“荷蘭十五”、“冀張薯12號(hào)”、“夏波蒂”、“布爾班克”等馬鈴薯脫毒瓶苗樣品，共計(jì)36個(gè)。試驗(yàn)儀器包括酶標(biāo)儀、微量移液器、恒溫箱、離心機(jī)、冰箱等。

1.2 試驗(yàn)方法

①配置溶液，制備樣品，提取緩沖液和洗滌緩沖液。②樣品制備：將馬鈴薯種苗稱重后放入樣品袋并做好標(biāo)記，每0.1 g加入1 mL提取緩沖液，研磨后離心取上清備用。③對(duì)照物準(zhǔn)備：稀釋陰陽(yáng)對(duì)照物-20℃保存?zhèn)溆?。④加樣和?duì)照物：將已包被好的酶標(biāo)板取出，標(biāo)注樣品號(hào)（一個(gè)樣品兩個(gè)重復(fù)）和病毒名稱，每孔加100 μL樣品上清液。設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照孔，分別加入陰陽(yáng)性溶液，然后裝入封口膜37℃孵育3 h或4℃過(guò)夜。⑤制備酶標(biāo)溶液，制備沒(méi)標(biāo)緩沖液，向酶標(biāo)緩沖液中加入酶標(biāo)抗體（IgG-AP）配制成酶標(biāo)抗體溶液。⑥洗版，每孔加入200 μL洗滌緩沖液，浸泡1 min，倒空酶聯(lián)板，立即在吸水紙上吸干殘余液體。重復(fù)3～4次。⑦加酶標(biāo)抗體，向每個(gè)樣品孔中加入100 μL酶標(biāo)抗體溶液。37℃下孵育2 h或4℃過(guò)夜。⑧洗版，方法同⑥。⑨制備底物溶液，準(zhǔn)備底物緩沖液，將50 mg底物溶于5 mL底物緩沖液中。⑩顯色反應(yīng)，向每個(gè)樣品孔中加底物溶液100 μL，為了保證顯色時(shí)間一致，使用8道槍加液，然后將酶標(biāo)板在20～25℃溫度下避光孵育，5 min開(kāi)始觀察結(jié)果，20～60 min結(jié)果有效。結(jié)果判斷：在OD 405/490讀數(shù)，OD405/490≥2×陰性對(duì)照的樣品判斷為感染病毒。肉眼觀察陽(yáng)性對(duì)照和感病的樣品為黃色記錄為“＋”，顏色越深，病毒含量越高。

2 結(jié)果與分析

從表1可以看出，PVX陰性對(duì)照OD 405值為0.135，2倍OD 405值為0.270，所有樣品檢測(cè)值均小于0.270，無(wú)顯色，未檢測(cè)出PVX病毒；PVY陰性對(duì)照OD 405值為0.136，2倍OD 405值為0.272，樣品QW 008檢測(cè)值為0.485，大于0.272，顯色黃色，確定樣品QW 008檢測(cè)出PVY病毒；PVS陰性對(duì)照OD 405值為0.138，2倍OD 405值為0.276，所有樣品檢測(cè)值均小于0.276，無(wú)顯色，未檢測(cè)出PVS病毒；PLRV陰性對(duì)照OD 405值為0.135，2倍OD 405值為0.270，所有樣品檢測(cè)值均小于0.270，無(wú)顯色，未檢測(cè)出PVX病毒。同時(shí)，4種病毒的陽(yáng)性對(duì)照OD 405值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于2倍陰性對(duì)照OD 405值，并且明顯顯黃色，證明試驗(yàn)步驟正確，試驗(yàn)結(jié)果可信。

表1 瓶苗病毒檢測(cè)結(jié)果

樣品編號(hào) 顯色PVX PVY PVS PLRV OD405OD405 顯色OD405 顯色OD405 顯色QW005 QW006 QW007 QW008 QW009 QW010 QW011 QW012 QW013 QW014 QW015 QW016 QW017 QW018 QW019 QW020 QW021 QW022 QW023 QW024 QW025 QW026 QW027 QW028 QW029 QW030 QW031 QW032 QW033 QW034 QW035 QW036 0.134 0.136 0.134 0.139 0.133 0.139 0.133 0.131 0.132 0.135 0.130 0.134 0.130 0.140 0.131 0.140 0.136 0.138 0.134 0.133 0.134 0.132 0.136 0.132 0.132 0.132 0.133 0.131 0.135 0.136 0.129 0.141－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－0.141 0.136 0.132 0.485 0.136 0.141 0.141 0.135 0.137 0.141 0.138 0.142 0.133 0.136 0.132 0.133 0.130 0.133 0.130 0.140 0.136 0.130 0.131 0.140 0.138 0.132 0.137 0.130 0.141 0.137 0.130 0.137－－－＋－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－0.135 0.134 0.141 0.135 0.134 0.131 0.132 0.131 0.134 0.139 0.138 0.129 0.139 0.133 0.137 0.141 0.134 0.135 0.133 0.141 0.136 0.131 0.136 0.130 0.131 0.139 0.135 0.139 0.137 0.135 0.135 0.132－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－0.137 0.137 0.138 0.135 0.130 0.139 0.130 0.137 0.133 0.131 0.139 0.135 0.141 0.137 0.135 0.138 0.139 0.141 0.142 0.138 0.130 0.134 0.132 0.138 0.134 0.129 0.141 0.130 0.133 0.138 0.138 0.133－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－

3 小結(jié)與討論

檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，有1個(gè)樣品感染PVY病毒。感染PVY會(huì)使馬鈴薯植株葉片斑駁黃化、卷曲、壞死，葉脈壞死，重型花葉，薯塊退化變小，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)50%。調(diào)查發(fā)現(xiàn)：該病毒是實(shí)驗(yàn)室莖尖剝離脫毒階段殘留的，種薯企業(yè)應(yīng)提高生產(chǎn)技術(shù)水平，比如在莖尖剝離時(shí)盡量小，才能達(dá)到完全脫毒。同時(shí)，要阻止檢測(cè)出帶毒的馬鈴薯種苗進(jìn)入下一步生產(chǎn)，從源頭上控制馬鈴薯種薯質(zhì)量，防止品種退化。

1005-2690（2017）02-0084-02

S435.32

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2016-12-20）