張煜劉鑫成 范宏斌

整合素與軟骨細胞去分化

整合素類；軟骨細胞；細胞去分化；軟骨

構建組織工程化軟骨常常需要體外擴增軟骨細胞。但是，軟骨細胞在體外培養(yǎng)、擴增過程中常發(fā)生去分化( dedifferentiation ) 而喪失細胞表型[1]，導致再生軟骨中II 型膠原、氨基葡萄糖 ( GAG ) 合成減少，易發(fā)生退變。目前有關去分化的具體機理尚未闡明，但以往的研究表明去分化主要與體外擴增的軟骨細胞缺乏細胞與細胞外基質 ( extracellular matrix，ECM ) 之間有效的信號刺激有關[2-3]。Integrin ( 整合素 ) 作為細胞膜上的一種跨膜糖蛋白，廣泛存在于細胞表面，其表達水平與細胞活力、細胞黏附和細胞表型密切相關。軟骨細胞表面的 Integrin 可以將 ECM 中的信號傳遞給細胞骨架 ( cytoskeleton，CSK ) 和胞漿內蛋白，通過多條信號通路調節(jié)細胞的生長、增殖、分化。將現(xiàn) Integrin 在軟骨細胞去分化中的作用作一綜述。

一、Integrin 結構與信號傳導

軟骨組織主要由軟骨細胞和 ECM 組成。Integrin 是軟骨細胞表面的一種跨膜糖蛋白，由 α ( 120～185 kDa ) 和 β ( 90～110 kDa ) 兩個亞單位構成異二聚體。目前至少有19 種 α 和 8 種 β 亞單位。α 亞單位和 β 亞單位分為細胞外區(qū)、跨膜區(qū)和細胞內區(qū)，其中胞外區(qū)普遍較長，胞內區(qū)較短 ( β4 亞單位胞內區(qū)較長 )。α 亞單位 N 端有多個 EF- 樣結構，能與 2 價陽離子 ( 尤其是 Ca+) 集合。β 亞單位除了高度保守區(qū)域胞外端外，在靠近跨膜區(qū)的 C 端含有多個富半胱氨酸區(qū)。胞外區(qū)的 α 與 β 亞單位結合成鏈，共同構成特異性受體部分。Integrin 族屬于細胞黏附分子家族，作用依賴于 Ca2+。并且作為軟骨細胞表面受體在細胞與 ECM相互作用中起重要作用，能通過特異性配體識別 ECM 中眾多的蛋白，尤其是纖連蛋白、II 型和 VI 型膠原，且還能作為機械傳感器感知相應機械力，其中 Integrin αVβ1 尤為重要[4]。

一般來說，不同亞單位組成的異源二聚體 Integrin 的作用是不同的，主要表現(xiàn)在各自的特異性結合位點與其在信號通路中的功能方面。Integrin 在軟骨細胞中主要通過 ECM-Integrin-Cell 的方式進行信號傳導，ECM 結合蛋白作為配體與 Integrin 結合形成信號復合體。其中常見的信號通路包括 RAS-MKK4 / 7-JNK、RAS-MKK3 / 6-p38MAPK、RAF-MEK-ERK、Rho-ROCK-Sox9 等，這些信號通路依賴 Integrin 家族不同成員表現(xiàn)出對各種信號的特異性。例如 α1β1、α3β1、α5β1 在細胞力學信號傳導中作用最為突出[5]。Loeser[6]也在研究中發(fā)現(xiàn)，正常成人關節(jié)軟骨細胞表面主要的 Integrin 類型包括 α1β1、α3β1、α5β1、α10β1、αVβ3 和 αVβ5，而骨關節(jié)炎 ( OA ) 患者的關節(jié)軟骨細胞表面主要類型為 α2β1，α4β1，α6β1。這不但表明 Integrin 與軟骨細胞存活、增殖、分化和基質重塑等各項功能息息相關，也提示大多數(shù)促進或者抑制去分化的刺激信號均可通過 ECM-Integrin-Cell 的方式向細胞內或外進行傳遞。

二、Integrin 與 ECM 相互作用

軟骨 ECM 是由軟骨細胞合成并分布到胞外的大分子，不但分布在細胞表面，也分布在細胞之間。主要成分包括 II 型膠原、IV 型膠原、IX 型膠原、蛋白聚糖、和多糖等。目前多認為 ECM 構成了復雜的網(wǎng)架結構支持并連接細胞，Integrin 則可結合 ECM 中各種信號蛋白，將刺激信號處理后傳遞給細胞骨架和胞漿內蛋白，通過多條通路調控軟骨細胞功能[7]。有研究表明，Integrin β1 族是 ECM中主要受體，可通過調節(jié) GIT1 表達增加蛋白多糖和 II 型膠原含量，促進軟骨細胞增殖并抑制凋亡[8]。這與以往報道的 α10β1 是穩(wěn)定軟骨細胞表型的最主要分子之一的研究結果相吻合[9]。II 型膠原作為軟骨細胞分泌到 ECM 中的特異標志，其表達降低被認為是軟骨細胞去分化的特異性改變，Xin 等[10]通過 SiRNA 轉染新生小鼠膝關節(jié)軟骨細胞抑制 COL2 α1 下調 II 型膠原的表達，發(fā)現(xiàn) II 型膠原的缺乏直接導致 Integrin 表型的變化。同時，ECM 和軟骨細胞間的關聯(lián)有可能是通過 Integrin 介導的 Ihh / PTHrP 通路得以實現(xiàn)。提示 Integrin 能夠在軟骨細胞膜上雙向傳遞信息，影響細胞去分化。

值得注意的是，關節(jié)軟骨細胞周基質 ( pericellular matrix，PCM ) 的生物化學和生物力學特性與 ECM 明顯不同[11]。PCM 作為軟骨細胞外 ECM 中包繞軟骨細胞的一層狹窄基質與所包繞的軟骨細胞共同構成軟骨單位( chondron )[4]，且蛋白多糖與膠原纖維含量明顯高于ECM。ECM 的主要成分為 II 型膠原，而 PCM 以 IV 型膠原為主。當關節(jié)軟骨承受壓力負荷后，PCM 通過包繞不同數(shù)量的軟骨細胞由淺入深，逐漸增強抗壓作用來緩解壓力。Knudson 等[4]研究發(fā)現(xiàn)，PCM 中 VI 型膠原可以幫助Integrin 與透明質酸相互作用，借此傳導力學信號進入軟骨細胞。研究表明 PCM 在軟骨細胞的整個信號傳導系統(tǒng)中起到重要作用[12]。Vonk 等[13]研究 PCM 降解后的單純軟骨細胞發(fā)現(xiàn)，單純軟骨細胞相比保留 PCM 基質的軟骨細胞，II 型膠原表達量明顯較低，且 I 型膠原表達量升高。證明 PCM 能提供正常軟骨細胞生長、分化所需要的微環(huán)境。Guilak 等[14]也發(fā)現(xiàn) PCM 可作為細胞表面 Integrin 與ECM 之間相互作用的介質。以上研究均表明 PCM 在軟骨細胞生理活動中的功能有別于 ECM，呈現(xiàn)出自身的特性。

三、Integrin 與 CSK 相互作用

細胞骨架是胞質中蛋白纖維交織而成的網(wǎng)狀結構，由微絲 ( microtubule，MT )、微管 ( microfilament，MF ) 與中間纖維 ( intermediate filament，IF ) 組成。主要維持軟骨細胞黏彈性與固態(tài)特性，并且保持細胞內部結構的有序性[15]。同時，CSK 在應力傳導中也不可或缺，能夠將應力刺激迅速傳導至細胞內部各個部位。Integrin 作為溝通 CSK與 ECM 的橋梁，存在許多關鍵連接位點，保證刺激信號在 ECM-Integrin-CSK 所構成的結構系統(tǒng)中有效作用，其中黏著斑 ( focal adhesions，F(xiàn)As ) 是重要的結構基礎。

FAs 位于細胞與胞外基質間，作為將 ECM 與 CSK 聯(lián)系起來的多蛋白聚集體，可結合介質蛋白與 Integrin β 亞單位和細胞骨架肌動蛋白 ( actin )，形成黏著斑復合體( focal adhesion complex，F(xiàn)AC )，引導肌動蛋白形成應力纖維將 Integrin 胞外區(qū)和 ECM 相連，胞內區(qū)與細胞骨架相連。整個結構復合體又結合諸多信號蛋白，例如：踝蛋白 ( talin )、輔肌動蛋白 ( α-actinin )、絲蛋白、蛋白激酶 C ( PKC )、黏著斑激酶 ( FAK ) 等。因為 Integrin 本身不具有激酶活性，F(xiàn)AC 利用銜接蛋白啟動多種細胞信號通路，保證了 Integrin 發(fā)揮細胞膜上雙向傳遞信息的作用。另外，在黏著斑相關的細胞特異性黏附途徑中，細胞外基質肽序列 ( RGD ) 可結合不同的 Integrin 亞型發(fā)揮重要作用，影響軟骨細胞和膠原纖維之間的黏附[16]，是目前研究的重要細胞膜受體識別位點。

四、Integrin 與軟骨細胞去分化

眾所周知，軟骨細胞體外培養(yǎng)存在的去分化現(xiàn)象已經(jīng)成為組織工程化軟骨進步的桎梏。但目前對軟骨細胞去分化的研究大多集中在正常軟骨細胞和去分化軟骨細胞在基因、蛋白表達及表型上的差異，對去分化起因的分子機制還有待進一步系統(tǒng)研究。比較確定的是，去分化現(xiàn)象與軟骨細胞衰老密切相關。其中陸峻泓等[17]研究發(fā)現(xiàn)軟骨細胞去分化過程中端粒酶與凋亡抑制基因 Bcl-2 表達下降，但并沒有對軟骨細胞去分化后再分化進一步研究。此外，印第安刺猬蛋白 ( Ihh ) 依賴的 Wnt / β-catenin 信號轉導通路、Notch 信號轉導通路、MAPK 信號通路也被證明參與軟骨細胞去分化過程。Integrin 如前所述，作為軟骨細胞刺激信號轉導的樞紐，在其中的作用不容忽視。

1. Integrin 介導的生物化學信號通路與軟骨細胞去分化：與正常軟骨細胞相比，去分化的軟骨細胞在細胞表型、基因調控和基因表達上均有差異。其形態(tài)由圓形和多角形的“鋪路石”樣外觀逐漸變?yōu)轭惱w維細胞樣的長梭形、扁平形，同時 II 型膠原、軟骨基質多聚蛋白、氨基葡萄糖、軟骨黏附素、踝蛋白、FAK 表達均下調；I、IV、VI 型膠原等表達上調。但眾多因子變化中，各自針對 Integrin 的作用究竟是單向還是雙向？因子之間是否存在相互作用？Integrin 接受因子刺激后是否會反饋影響因子表達？這些問題還有待進一步研究。例如：目前已知TGF-β 具有促進軟骨細胞增殖、分化和促進軟骨特異性ECM 與軟骨形成的能力。其能增加 Integrin α5β1 的表達，但同時并不增加 α1β1 表達[18]。而 Zhang 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，Integrin 與 ECM 相互作用可激活 TGF-β / SMAD 信號通路抑制軟骨細胞肥大。這與已知的 TGF-β / SMAD 信號通路可上調 Sox9 mRNA 水平，增強相關蛋白表達對抗軟骨細胞去分化相一致。

通常隨著軟骨細胞去分化程度加重，ECM 相關基因表達水平明顯下降，Integrin 表達逐漸升高。但并非所有的 Integrin 家族成員對軟骨細胞去分化刺激表現(xiàn)出一致的反應。研究發(fā)現(xiàn)，軟骨細胞去分化會導致 Integrin α5 表達減少，同時 α1、α2、α3 的表達卻增加[20]。生長分化因子 5 ( growth and differentiation factor-5，GDF-5 ) 可誘導 α5 亞單位的表達，從而維持軟骨細胞表型，對抗去分化。但肥大軟骨細胞中表達的 Integrin αV 則相反，使用骨形成蛋白-7 ( bone morphogenefie protein-7，BMP-7 ) 誘導 αV 表達后，肥大軟骨細胞去分化程度加重。此外，Goessler 等[21]發(fā)現(xiàn)，軟骨細胞傳代過程中 α5β1 表達明顯上調，軟骨分化相關轉錄因子 Sox9 ( SRY-related high mobility group-box gene9 ) 的表達逐漸下調。目前，II 型膠原、GAG 和 Sox9是研究較多的體現(xiàn)軟骨細胞去分化程度相對可靠的特異性因子，這些特異性因子與 Integrin 不同亞型的不同作用還有待進一步研究。

Ramos[22]發(fā)現(xiàn) Integrin αVβ5 亞型主要通過 Ras-Raf-MEK-ERK 信號通路活化細胞外信號調節(jié)蛋白激酶 ( ERK )從而抑制軟骨相關基因表達。抑制 Integrin αVβ5 后，ERK 活化降低且 Sox9 活性提高，促進了軟骨特征性 II 型膠原、IX 型膠原和 GAG 的表達[23]。這提示抑制 Integrin αVβ5、RAS 或拮抗 ERK 的活性都可以阻止軟骨細胞去分化，但亦有研究發(fā)現(xiàn) Integrin αVβ5 對抗去分化作用隨時間延長而降低[24]。另外，Integrin 中類似于 ERK 通路的還有c-Jun 氨基末端激酶 ( JNK ) 通路和 P38 MAPK 通路，它們共同的上游分子均為絲裂原活化蛋白激酶 ( MAPK )。通過使用拮抗劑抑制 ERK、JNK 和 P38 的活性都能夠抑制去分化功能。但是與 ERK 和 JNK 相比，P38 MAPK 通路抑制軟骨細胞去分化的作用更強[25]。這提示各型 Integrin 中不同信號通路功能是否有區(qū)別？P38 MAPK 通路是否也受Ras 調控？這有待進一步研究。

2. Integrin 介導的生物力學信號通路與軟骨細胞去分化：生理條件下，關節(jié)軟骨是體內重要的應力減震組織，能夠通過感知力學刺激來調節(jié)軟骨細胞的生理活動。研究證明 ECM 與 PCM 在接受生物力學信號刺激、調節(jié)軟骨細胞功能方面有重要作用[26]。ECM 中的組織蛋白酶 K ( cathepsin K，CTSK ) 是一種降解酶，在去分化的軟骨細胞中高表達，Ruettger 等[27]發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象可能與 II 型膠原激活蛋白激酶 ( PKC ) 通路和 MAPK 通路相關。Peters 等[28]使用碘醋酸鈉與星孢菌素分別處理軟骨細胞與軟骨單位后發(fā)現(xiàn)，軟骨單位的凋亡率與死亡率明顯低于軟骨細胞，提示 PCM 對軟骨細胞有保護作用。由于 PCM 與軟骨細胞直接毗鄰，其在很大程度上可影響細胞的力學特性，Wilusz等[29]運用原子顯微鏡剛性映射技術與免疫熒光技術，不但發(fā)現(xiàn)缺乏 IV 型膠原的 PCM 彈性模量較高，而且證實體外培養(yǎng)軟骨單位中的 PCM 可優(yōu)化軟骨細胞去分化相關基因表型的穩(wěn)定性及表達能力。Murray 等[30]研究表明 PCM中 IV 膠原被破壞后，PCM 會發(fā)生降解并促使軟骨細胞去分化。但目前有關 PCM 如何影響去分化的研究較少，特別是 ECM 與 PCM 各自感受力學刺激信號后如何與 Integrin的相互作用影響去分化尚無報道。

力學刺激對軟骨細胞的作用非常復雜，其中細胞基質傳遞給軟骨細胞的力學刺激通過 Integrin 通路、牽張激活性離子通道 ( stretch activatedionchannels，SACs ) 和細胞骨架等轉化為胞內生物學信號，影響靶基因表達。Millward等[31]發(fā)現(xiàn)，骨性關節(jié)炎中軟骨細胞通過 Integrin α5β1 傳導力學刺激。而 Lucechinetti 等[32]通過實驗進一步發(fā)現(xiàn)，Integrin α5 可能是軟骨細胞的主要力學感受器。適宜的力學刺激有利于軟骨細胞的修復，可如何保持力學信號對軟骨細胞的良性刺激作用目前還不十分清楚。有研究表明，適宜的周期性力學刺激可以促進軟骨細胞基質合成和細胞增殖修復，而不恰當?shù)某掷m(xù)性壓力則使得細胞基質減少，細胞凋亡增加[33]。另外，Integrin 胞內區(qū)尾部結構較短，不具有酶活性，必須通過某些介質蛋白如樁蛋白( Paxillin )、Shc 和 Tensin 來介導，形成 FAC 發(fā)揮作用。有研究表明，F(xiàn)AC 最先募集來的信號分子是 FAK，并且通過 FAK 可激活 MAPK 信號通路[34]。力學信號還可通過Integrin β-Src-Rac-MEK-ERK 通路傳導，使用拮抗劑抑制此通路后，軟骨細胞的增殖和 GAG 的合成相應降低[35]。但該研究并未采用研究軟骨細胞常用的周期性壓力刺激模式，壓力信號能否通過該信號傳導通路尚待驗證。

目前低強度脈沖超聲波 ( low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS ) 對軟骨細胞的影響研究較多。有研究表明LIPUS 可以通過 Integrin 介導的 P38 MAPK 通路影響 ECM的分泌[36]。Iwabuchi 等[37]則發(fā)現(xiàn)用 LIPUS 處理過的軟骨細胞可通過 Integrin β1 受體與 ERK1 / 2 的磷酸化誘導Cox-2 表達。而 Cheng 等[38]在骨關節(jié)炎 ( OA ) 的軟骨細胞中研究發(fā)現(xiàn)，LIPUS 可能影響 Integrin-FAK-P13K-Akt 通路使得軟骨細胞對抗去分化相關基因表達增加，減少骨關節(jié)炎的軟骨細胞的凋亡。這些研究都提示軟骨細胞對同一種類的力學刺激反應可能是多樣的，且不同種類的力學刺激在細胞中產(chǎn)生的效應是復雜且相互關聯(lián)的。

綜上所述，Integrin 因自身結構特點，將軟骨細胞胞外基質與胞內作用蛋白聯(lián)系成統(tǒng)一的系統(tǒng)，能介導軟骨細胞感受外界環(huán)境刺激做出應答，調節(jié)細胞各項功能。大量研究表明，孤立的 Integrin 并不具有明確的促進或抑制去分化傾向，但誘導去分化的外界刺激信號通過特異的 Integrin 進入胞內，并且去分化的軟骨細胞細胞表型、基因調控和基因表達方面的改變又經(jīng) Integrin 傳遞出胞外與 ECM 產(chǎn)生互動。這一特性決定了 Integrin 可能是解決軟骨細胞去分化現(xiàn)象的重要環(huán)節(jié)。但因為 Integrin 影響去分化的具體機制還不十分清楚，又或目前對 Integrin 在軟骨細胞去分化現(xiàn)象中的研究重點集中在其不同亞單位在不同刺激信號下的表現(xiàn)。而對于包括各種類信號通路如何調節(jié)軟骨細胞功能，以及信號刺激對 Integrin 亞型的影響是否有交互作用等還不明確，使得 Integrin 在軟骨細胞去分化進程中的作用沒有得到足夠重視。在以后的研究中，應當以 Integrin 作為立足點，加大對其影響去分化的機制的探索，促進軟骨組織工程的進一步發(fā)展。

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( 本文編輯：李慧文 )

Integrin and dedifferentiation of chondrocyte

ZHANG Yu-shen, LIU Xin-cheng, FAN Hong-bin. Institute of Orthopedics, Xijing Hospital, the fourth Military Medical University, Xi’an, Shanxi, 710032, China

FAN Hong-bin, E-mail: fanhb@fmmu.edu.cn.

ObjectiveIn order to provide a better way to increase the quality of tissue-engineered cartilage, the effects of integrin on the dedifferentiation of chondrocyte were reviewed. Methods By searching PubMed and CBM, we reviewed published papers on integrin and chondrocyte dedifferentiation and analyzed the effects of integrin. Results ( 1 ) Integrin is a transmembrane glycoprotein on the surface of chondrocyte, belonging to the family of cell adhesion molecules. As the surface receptor of chondrocyte, it plays an important role in the interaction between the cell and extracellular matrix ( ECM ). ( 2 ) Integrin, which can be combined with a variety of signaling protein in the ECM, will transmit the stimulus signals to the cytoskeletal ( CSK ) and cytosolic proteins. Additionally, it can regulate the function of chondrocyte and affect the dedifferentiation through multiple pathways. ( 3 ) As a bridge between CSK and ECM, there are a number of critical junctions in the integrin which ensure normal operation of the signal of ECMIntegrin-CSK. ( 4 ) Because of the structural characteristics, a unif i ed system of ECM and the intracellular protein are linked by integrin, which can be used to mediate the stimulation and regulate the function of chondrocyte. Conclusions Chondrocyte dedifferentition is closely related to integrin, which can affect cell viability, cell adhesion and cell phenotype. Due to the transmition of ECM, it can regulate the chondrocyte dedifferentiation process through specif i c singling pathway.

Integrins; Chondrocytes; Cell dedifferentiation; Cartilage

10.3969/j.issn.2095-252X.2017.03.015

Q291

國家自然科學基金項目 ( 31170936，31470936 )

710032 西安，第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院全軍骨科研究所

范宏斌，Email: fanhb@fmmu.edu.cn

2016-10-19 )