王華榮，廖勤，吳世青

（1.滄州市公安局刑警支隊，河北滄州 061000；2.唐山市公安局刑警支隊，河北唐山 063000）

三種磁珠法提取脫落細胞DNA的比較

王華榮1，廖勤2，吳世青1

（1.滄州市公安局刑警支隊，河北滄州 061000；2.唐山市公安局刑警支隊，河北唐山 063000）

法醫(yī)遺傳學(xué)；DNA；提取法；磁珠法；脫落細胞

法醫(yī)DNA鑒定中的脫落細胞檢材是指含有人體皮膚黏膜脫落上皮細胞的檢材，是當(dāng)前刑事案件現(xiàn)場最有可能提取到的生物物證。目前關(guān)于脫落細胞提取純化方法對比的報道[1-3]較多，但相同提取方法效果橫向比較的研究較少。本研究對IQ磁珠、M48磁珠、PrepFiler磁珠三種常見的磁珠法提取脫落細胞DNA的檢驗效果進行比較，為法庭科學(xué)實踐提供參考依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

50例脫落細胞類檢材均取自本實驗室2013—2015年檢案積累，包括10枚煙蒂、10個飲料瓶、10件衣物（含手套、帽子）、10枚汗液指紋膠帶及10例作案工具（手柄）。

1.2 方法

1.2.1 前處理

煙蒂及膠帶上指紋采取剪取法，飲料瓶及作案工具采取擦拭法［4N6FLOQSwabsTM植絨拭子[4]（美國AB公司）］，衣物采取吸取法［生物脫落細胞提取儀[5]（北京貝斯湃生物技術(shù)有限責(zé)任公司）］。每份樣本平均分配至3個微量離心管中備檢。

1.2.2 DNA提取

IQ磁珠法：使用Maxwell?16自動純化儀（美國Promega公司）按照儀器及IQ磁珠試劑盒（美國Promega公司）相關(guān)說明進行DNA抽提。

M48磁珠法：采用MagAttract M48 DNA Manual試劑盒（德國QIAGEN公司），按照公安部物證鑒定中心IFSC-02-02-05-2010《M48手工提取方法》進行DNA抽提。

PrepFiler磁珠法按照PrepFiler?BTA Forensic DNA Extraction試劑盒（美國AB公司）操作說明書進行DNA抽提。

1.2.3 DNA擴增、檢測及分析

采用AmpFlSTR?Identifiler?Plus試劑盒（美國AB公司）10μL體系（包括緩沖液4μL，超純水3μL，引物2 μL和模板DNA 1 μL），在9700型PCR擴增儀（美國AB公司）上按試劑盒說明書進行擴增。擴增產(chǎn)物用3130xl型遺傳分析儀（美國AB公司）進行檢測，GeneMapper ID v3.2軟件分析結(jié)果。

磁珠提取法檢驗成功的評價標(biāo)準(zhǔn)：樣本所有基因座均能正確分型，獲得的譜峰峰高大于300相對熒光單位（RFU），雜合子兩個峰高比例在70%以上[6]，無或少雜峰等干擾因素。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行多組樣本間的非參數(shù)檢驗和組間的兩兩比較，采用Kruskal-Wallis檢驗比較各組間的差異，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果與討論

表1 三種磁珠法提取五類檢材檢驗的成功結(jié)果［n=10，例（%）］

2.1 結(jié)果

2.1.1 檢驗成功率

五類檢材三種磁珠法提取檢驗獲得成功結(jié)果情況見表1。對磁珠法、檢材類型的不同檢驗成功率進行交互比較，發(fā)現(xiàn)差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。三種常見磁珠法脫落細胞檢驗成功率：PrepFiler磁珠法［45例（90%）］＞M48磁珠法［43例（86%）］＞IQ磁珠法［26例（52%）］。五類檢材脫落細胞檢驗成功率：煙蒂［30例（100%）］＞衣物［26例（87%）］＞飲料瓶［24例（80%）］＞作案工具［18例（60%）］＞汗液指紋［16例（53%）］。

2.1.2 圖譜均衡性及峰高

五類檢材采用三種磁珠法提取檢驗獲得成功結(jié)果的峰高均值和雜合子均衡性見表2。PrepFiler磁珠法與M48磁珠法的峰高及均衡性差異不明顯，但均好于IQ磁珠法。對PrepFiler磁珠法、M48磁珠法與IQ磁珠法的峰高進行同一樣本對比，發(fā)現(xiàn)三種方法均檢驗成功的樣本中有21例（81%）在PrepFiler磁珠法與M48磁珠法的峰高為IQ磁珠法的1.5～2.5倍。本研究同時發(fā)現(xiàn)，檢測得到的峰高均值越高，雜合子均衡性越好。

表2 三種磁珠法提取五類檢材獲得的峰高均值和雜合子均衡性（n=10）

3 討論

三種磁珠法均利用細胞裂解液和蛋白酶促使細胞膜、核膜破裂釋放DNA，通過磁珠作為載體在相關(guān)試劑盒試劑制造的環(huán)境下結(jié)合DNA，利用磁力架（棒）富集磁珠，并洗滌、純化去除干擾雜質(zhì)后，將DNA釋放于體積相對較少、DNA模板濃度較高的洗脫液中。此過程起到提取、純化、富集的作用，因此磁珠法對于污染重、微量的脫落細胞DNA的提取具有較大優(yōu)勢。

本研究中，五種不同類型脫落細胞檢材樣本的檢驗除采用不同的磁珠提取方法外，余實驗環(huán)節(jié)均保持完全一致，確保無其他可能的因素影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示，對于煙蒂檢材因其含有的模板DNA量較大，三種磁珠法均能獲得理想的效果；對于飲料瓶、衣物類檢材其含有的模板DNA量或多或少，PrepFiler磁珠法與M48磁珠法獲得的圖譜峰高均值更大，檢驗成功率更高；對于汗液指紋、作案工具等接觸類檢材其含有的模板DNA量較少，PrepFiler磁珠法與M48磁珠法獲得的檢驗成功率更高。以上結(jié)果均表明PrepFiler磁珠法與M48磁珠法對DNA具有更好的吸附或釋放性能，相比IQ磁珠法更適合于脫落細胞中微量模板DNA的提取檢驗，在實際檢案應(yīng)用中更具優(yōu)勢。

[1]楊電，劉超，徐曲毅，等.DNA IQ磁珠法結(jié)合Maxwell? 16自動儀提取接觸DNA[J].刑事技術(shù)，2011，（3）：3-5.

[2]徐程，豐蕾，楊帆，等.微量接觸DNA的濃縮與回收[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2014，45（6）：532-535.

[3]駱繼懷，陳曉軍，孫紅兵，等.接觸性生物檢材提取DNA方法的比較[J].蘭州大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2015，41（1）：18-22.

[4]徐海軍，葉志鵬，徐姚力，等.植絨和棉簽拭子對不同載體微量生物物證的提取研究[J].刑事技術(shù)，2015，（5）：373-375.

[5]陳殿宇，郝金萍，張忠祥，等.生物脫落細胞提取儀在案件檢驗中的應(yīng)用[J].刑事技術(shù)，2008，（2）：58-59.

[6]巴華杰，林子清，劉亞楠，等.5種免提取試劑盒檢驗濾紙血痕結(jié)果的比較[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2013，28（1）：49-51.

（本文編輯：張素華）

更正聲明

各位讀者，2016年第5期《鈍器致鼻部骨折95例法醫(yī)學(xué)分析》一文，有一處筆誤，現(xiàn)更正如下：第355頁“3.5完善鑒定標(biāo)準(zhǔn)的思考和建議”中第一段第四行“上頜骨額突骨折合并鼻中隔骨折按《舊標(biāo)準(zhǔn)》……”，更正為“單純鼻骨骨折（無明顯移位）合并鼻中隔骨折在《舊標(biāo)準(zhǔn)》中并無明確規(guī)定，實踐中存在爭議”。特此聲明。

《法醫(yī)學(xué)雜志》編輯部

DF795.2

B

10.3969/j.issn.1004-5619.2016.06.018

1004-5619（2016）06-0459-02

2016-06-03）

王華榮（1966—），男，副主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)病理學(xué)和法醫(yī)物證學(xué)鑒定與研究；E-mail：wushiqing507＠sohu.com